RT-PCR全过程步骤_精品文档Word格式文档下载.docx
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泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干)
3、匀浆器:
(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)
三、试剂配制:
1、DEPC水:
吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇:
用无水乙醇DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压)
3、异丙醇:
放入棕色瓶中
4、氯仿:
5、琼脂糖
二.总RNA提取
1.取100mg组织,放到1.5mlEP管中,加入1mlTrizol剪碎。
(1)液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,再研磨,如此三次,按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol,转入离心管进行第2步操作。
(2)匀浆:
组织样品按50-100mg/mlTrizol加入Trizol。
另外,组织体积不能超过Trizol体积的10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
2.震荡30s,室温放置5min,使其充分裂解。
12,000rpm离心5min,弃沉淀。
3.加0.2ml氯仿,摇动30s,室温5-10min。
注:
禁用漩涡振荡器,以免基因组DNA断裂。
4.12000×
g,4℃离心,15min。
5.吸上层无色水相,移入另一EP管中(约0.5ml)。
6.加等体积异丙醇,室温放置5-10min。
7.12000×
g,4℃离心,10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8.弃上清,加冰预冷75%乙醇1ml,温和振荡,悬浮沉淀。
9.8000×
10.弃上清,用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5-10min。
11.沉淀溶于20μlDEPC水(可用20ulH2O,TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品,55-60℃,5-10min。
H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
),取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12.计算浓度与纯度,-70℃保存。
三、逆转录合成cDNA第一链
反应体系如下
总体系20μl
约3μgRNA量+1μlOligodT+water=12μl
5*RTbuffer4μl
dNTP2μl
RNaseinhibitor1μl
AMVReverseTranspase1μl
温度42℃1小时
冰上配制混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
四、PCR反应
混匀快速离心一次
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×
LoadingBuffer2μl2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA30min溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果。