细胞染色方法总结Word文件下载.doc

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JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体（monomer）存在，发射光以绿光（～525nm）为主；

而在高浓度时则可以形成多聚体（aggregation），发射光以红光（-590nm）为主。

线粒体本身存在一定的极性（polarization），其外膜为负极，内膜为正极。

电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。

当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。

在线粒体发生去极化（depolarization）时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。

JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势（membranepotential），而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。

由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。

其实验方法如下。

JC-l染色非常简单。

首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液（1～5mg/ml），储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。

对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦下观察。

线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。

该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

钙黄绿素-AM（Calcein-AM）:

Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光（激发：

490nm，发射：

515nm）。

因此Calcein-AM仅对活细胞染色

细胞活力鉴定——台盼蓝染色法

原理：

细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。

而活细胞能阻止染料进入细胞内。

故可以鉴别死细胞与活细胞。

用品：

1.4%台盼蓝母液：

称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。

使用时。

用PBS稀释至0.4%。

2.吸管、血细胞计数板、显微镜

步骤：

1、制备单细胞悬液。

并作适当稀释（106细胞/ml）

2、染色：

细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:

1混合混匀。

3、计数：

在三分钟内，用计数板分别计数活细胞和死细胞

结果统计：

镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。

根据下式求细胞活力：

活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×

100

注意事项：

台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。

否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。

台盼蓝染色原理

通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。

台盼蓝（TrypanBlue）是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。

健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。

依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。

试述台盼蓝染发鉴别死活细胞的原理，试分析染色时间过长本来是活细胞也被染色的原因

死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。

活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。

若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。

方法特点

染细胞类型

染色部位

激发光

颜色

意义

Hoechst染色

活细胞（主要是早期凋亡细胞）

细胞核

紫外激发

核染蓝色

检测早期凋亡

PI染色

坏死细胞或凋亡晚期细胞

绿光激发！

核染红色

检测死细胞或凋亡晚期细胞

annexin-v染色

早期凋亡细胞

细胞膜

不定

早期凋亡灵敏指标

JC-1染色

线粒体膜

绿光为主

功能好的细胞绿色为主反之红为主

早期凋亡

台盼蓝染色

死细胞

降解DNA

?

蓝色

细胞存活率

Calcein-AM染色

活细胞

绿荧光光

黄绿色

活细胞数