本科生六个基本生物学实验Word格式.doc
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3.2 自该步骤起皆需无菌操作。
在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的、冰预冷的50ml离心管中。
3.3 4℃离心,4000g×
5min回收细胞。
3.4 弃去培养液,将离心管倒置于滤纸上1min,以使最后残留的培养液流尽。
3.5 加入冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液10ml重悬菌体,置冰浴30min。
3.6 4℃离心,4000g×
5min,弃去上清液,倒置于滤纸1min。
3.7 再加4ml用冰预冷的0.1molCaCl2重悬菌体(重悬时操作要轻)。
3.8 置4℃冰箱置12—24h,即可应用于转化。
思考题:
制备感受态细胞时加入CaCl2的作用是什么?
钙离子结合于细胞膜上,使细胞膜呈现一种液晶态。
在冷热变化刺激下液晶态的细胞膜表面会产生裂隙,细胞膜的通透性发生变化,使外源DNA进入。
实验二质粒转化
1.原理 当宿主菌接受CaCl2处理后,细胞膜通透性改变,感染细菌的质粒很容易地透过细胞膜,在宿主菌酶系统的作用下,质粒大量繁殖。
通过进一步实验,可获得大量的质粒DNA,以供分子生物学实验所用。
一般的实验室都应用CaCl2处理细菌。
2.实验材料
2.1,质粒GFP-SNAT2-pBK-CMVΔ(kan抗性)
2.2,LB固体培养基平板(kan抗性),LB液体培养基
2.3,感受态细胞
2.4,1.5ml离心管,枪头,三角耙(以上物品需灭菌处理);
移液器,冰,恒温水浴锅,恒温摇床,恒温培养箱,超净工作台,-70℃冰箱
3.1 无菌状态下取新鲜感受态50μl置于无菌的1.5ml离心管。
3.2 每管加质粒50—100ng,轻轻旋转以混合内容物,在冰上放置30min。
3.3 42℃热休克90s,不要摇动离心管。
3.4 每管加无抗生素的普通LB培养基950μl,37℃(150—180r/min)摇床,温和摇振45min。
3.5用无菌弯头玻璃铺菌器(三角耙),将10μl菌液铺于含卡那青霉素(Kan)的琼脂平板表面,37℃平放20min,然后倒置培养10—14h。
4.结果观察
计数全皿菌落数
5.写实验报告(详细描述转化菌落的生长情况)
6.思考题
请说明每一步骤的原理:
冰上30分钟、42度热休克90秒、37度温和震荡45分钟等。
冰上30分钟:
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。
42度热休克90秒:
42度短暂的热刺激,细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随即出现许多间隙,促进细胞吸收DNA复合物。
37度温和震荡45分钟:
促使在转化过程中获得新的表型得到表达
实验三质粒DNA的抽提和纯化
1.原理:
质粒为多数细菌和某些真核生物染色体的双链环状分子。
一般情况下,质粒并不是它的宿主细胞所必需的,如细胞分裂时,分裂的子细胞中不含质粒,但子细胞仍能生长分裂。
然而,许多质粒含有在特殊环境下所必需的抗生素抗性。
尽管质粒的复制有赖于宿主细胞的酶系统进行,但质粒DNA是独立于宿主基因组以外的环状分子,对于碱的裂解具有较强的耐受性,因此,用碱裂解法可将质粒DNA与宿主的线性DNA分开。
2材料
2.1质粒DNA小抽试剂盒,乙醇
2.2含质粒的菌液(GFP-SNAT2-pBK-CMV⊿)
2.3离心管,枪头(以上物品需灭菌);
移液器,离心机
3.步骤
见试剂盒说明书
实验四琼脂糖凝胶电泳
1.原理:
带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。
各种生物大分子在一定的pH值条件下,可解离成带电荷的离子,在电场中向相反的电极移动。
分子生物学领域中,琼脂糖和聚丙烯酰胺作为支持介质的凝胶电泳应用最多,它们是分离、鉴定和纯化DNA及RNA片段的主要方法。
该方法操作简便、快速,可以分辨其它方法(如梯密度离心法)所无法分离的片段。
直接嵌入荧光染料后,在紫外灯下可直接检出DNA片段所在的位置,如有必要,从凝胶中回收DNA片段,用于各种克隆操作。
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶均可制成各种不同大小、形状和孔径的凝胶块,在不同的装置上进行电泳。
琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率低,但其分离范围广,约200bp~50kb的DNA。
琼脂糖凝胶电泳通常在水平装置上进行。
聚丙烯酰胺分离小片段(5~500bp)的效果较好,甚至可以分辨相差1bp的DNA片段。
长度大于10000kb的DNA片段,可以通过电场方向呈周期性变化,在脉冲电场胶中进行电泳。
2.琼脂糖凝胶的性质:
琼脂糖是从海澡中提取的长链状多聚物,琼脂糖凝胶点为40~45℃。
当加热至90℃左右时,即可成清亮、透明的液体,浇在模具上冷却后固化形成凝胶,琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。
为了满足特殊的要求,可选择低溶点琼脂糖(<
70℃,低于双链DNA的变性温度)。
3材料
3.1琼脂糖,10mg/ml溴化乙锭,1kbDNAmarker
3.2100ml50×
TAE缓冲液:
Tris24.2g,冰乙酸5.71ml,0.5mol/LEDTA(PH6.8)10ml
3.36×
上样缓冲液:
0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油
3.4枪头,移液器,锥形瓶,微波炉,制胶槽,梳子,水平电泳仪,稳压器,凝胶成像系统
4 操作步骤:
4.1 将胶模槽放于水平工作台上。
4.2 用电泳缓冲液在微波炉中将琼脂糖颗粒用最短的时间完全溶解。
熔化琼脂糖溶液冷却至60度时,加入浓度为0.5μg/ml溴化乙锭10ul,充分混匀。
4.3 在胶模放置好梳子后,将具有一定温度的凝胶倒入胶模中,凝胶的厚度在3-5mm之间。
注胶时要避免产生气泡,若有气泡可用吸管小心吸去。
4.4 凝胶凝固后通常需要在室温中放置30——45min,小心移去梳子,并将凝胶托盘放入电泳槽。
可同时制作几块凝胶,待其固化后用保鲜纸包住以防水分挥发,置4度保存,通常在数日之内可以使用。
4.5加入电泳缓冲液,使液面高出凝胶表面1—2mm,样品孔内有气泡,用吸管小心吸去,以免影响加样。
4.6 将样品与上样缓冲液混合:
上样缓冲液不仅能提高样品的密度,使样品均匀沉到孔底,还可使样品带色,便于上样、估计电泳时间和判断电泳位置。
4.7 用微量移液器将样品依次加在样品孔内。
4.8 盖上电泳槽并通电,5V/cm2,恒压电泳,使DNA向阳极方向移动。
4.9 电泳完成后切断电源,取出凝胶。
如果凝胶中加有溴化乙锭,可直接在紫外透射灯下观察,否则就将凝胶浸泡在0.5微克/ml溴化乙锭缓冲液中浸泡30——45min。
4.10 用凝胶分析系统直接观察并拍照。
5. 注意事项:
5.1 加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器,并可对着光线肉眼检查凝胶溶解情况,使附着在壁上的颗粒完全溶解。
5.2 在微波炉上加热时间不要过长,以免引起暴沸。
如蒸发过多的溶液,应补充部分缓冲液。
5.3 气温较高或用低熔点、低浓度(小于0.5%)琼脂糖制胶、倒胶和电泳时,最好在4℃进行。
6.结果观察
6.1仔细观察DNA泳动的方向。
6.2DNA电泳结束后,记录正常组与marker组电泳条带的相应位置。
7.书写实验报告
实验五DNA限制内切酶技术
限制性内切酶(即限制性核酸内切酶,简称限制酶或内切酶)是一类能识别双链分子中特异核酸序列的水解酶,这类酶的发现和应用,促进了基因工程和DNA序列测定以及基因诊断技术的发展。
它的应用是当代分子生物学研究最基本、最重要的技术手段。
从质粒、噬菌体或粘性质粒获得的含有目的基因重组分子,必须经过酶切、电泳分离、回收基因片断,方可用于重组或探针标记。
根据酶切的目的不同,可采用小量酶切或大量酶切反应两种体系。
2.实验材料
2.1质粒SNAT1-PBK-CMV⊿(600ng/ul,150ul)
2.2限制性内切酶EcoRI
2.31kbDNAmarker
2.4离心管,枪头,移液器,离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳所需材料
3.小量酶切反应体系
本实验主要应用于质粒的酶切鉴定。
典型的反应是20μl体积中含0.2—1μgDNA,酶切反应体系如下:
质粒DNA5μl
10×
缓冲液1μl
限制酶(根据质粒酶切位点选择)1μl
双蒸去离子水3μl
总体积10μl
4.操作方法
4.1 在一灭菌的新的Ep管中加入3μl双蒸水。
4.2 加入10×
缓冲液1μl。
4.3 加限制酶1μl。
4.4 最后加入质粒DNA5μl。
4.5 稍离心,混合。
4.6 37℃水浴1—1.5h。
4.7取出后电泳分析鉴定是否酶解。
5.注意事项
5.1 双蒸水为可变体积,当其他反应成分的量确定后,用双蒸水将反应体积补足。
5.2 质粒DNA最后加入,以防止操作不当引起试剂的污染。
5.3 为保持限制酶的活性,将酶从低温冰箱取出后立即置于预先准备的碎冰中冰浴,操作应迅速,用后立即放回低温冰箱中。
5.4 大多数酶多以浓缩液存放,吸取时需严格取量。
若要取用多种酶,每种酶必须单独使用吸头,避免交叉污染。
5.5 大多数限制酶均加50%甘油缓冲液置于-20℃保存,其活力稳定,但在配制反应混合物时,酶的加入量要准确限制小于体积的1/10,否则甘油会抑制酶解反应。
5.6 如欲节省酶的用量,可增加酶解时间,但酶解时间过长,易出现异常条带。
5.7 当样品加入反应管之后,必须将装酶试管盖盖严,避免温育时水蒸汽进入管内。
6.1 DNA分子中分布的酶切位点的多少与酶解后条带呈正比。
仔细观察条带数量。
6.2.与Marker对照,观察各条带中的bp数。
6.3.书写实验记录并画图记录各条带的位置。
实验六PCR技术
PCR技术实际上是一个在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下,DNA聚合酶依赖的酶促反应,扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。
整个扩增过程分为三步:
①变性:
加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链;
②退火:
突然降温后,模板DNA与引物按碱基配对的原则互补结合。
也存在2链