培养条件对大肠杆菌的影响Word格式.docx
《培养条件对大肠杆菌的影响Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《培养条件对大肠杆菌的影响Word格式.docx(13页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![培养条件对大肠杆菌的影响Word格式.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2022-10/1/3231d728-eb70-4bc3-a437-b9da6544f610/3231d728-eb70-4bc3-a437-b9da6544f6101.gif)
毕业设计(论文)任务书
班级
学生姓名
指导教师
设计(论文)题目
浅析培养条件对大肠杆菌的生长和和rhG-CSF表达的影响
主要
研究
内容
培养条件对大肠杆菌的生长和rhG-CSF表达的影响。
主要从温度,PH值,溶解氧,接种量,培养时间,摇床的转速,工程菌生长时间机诱导时间的对照实验,来研究大肠杆菌的生长和表达的条件。
根据研究的结论,进一步分析大肠杆菌在生物药品生产中的应用最佳条件。
主要技
术指标
或研究
目标
借鉴了大量的著名专家的文献,以文献的知识为主线。
严格每一步的操作。
逐一研究大肠杆菌的生活条件,对照实验结果,得出更严谨的数据。
通过试验得到利于大肠杆菌生长的营养环境和rhG-CSF表达的最佳环境条件,用来提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达,进一步的缩短生产周期,降低生产成本,为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定最坚实的基础。
基本
要求
严格根据实验步骤合理安排实验,每个实验都设立3个对照,使实验结果更具有说服力,真实可行。
主要参
考资料
及文献
[1]杨炜,王伟刚,田海英,等.重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究[J].生物技术2006
[2]郑大勇,罗荣城.蔡红兵.基因工程抗体anti?
HBsAgFab原核表达体系大规模培养条件的实验研究[J].第一军医大学学报,2004
[3]霍向东,石玉瑚.大肠杆菌高密度发酵补料调控策略的研究进展[J].新疆农业科学。
2004
[4]张嗣良.发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究,基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术[J].中国工程科学.2001
目录
1前言-1-
1.1简述-1-
2材料与方法-2-
2.1菌种-2-
2.2试剂-2-
2.3培养基及组成成分添加-2-
2.4培养方法-2-
2.4.1摇瓶发酵-3-
2.4.2种子罐培养-3-
3培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响-3-
3.1培养温度-3-
3.2pH值-3-
3.3溶解氧-3-
3.4接种量-3-
3.5培养时间-4-
3.6转速-4-
3.7工程菌的生长时间及诱导时机-4-
4OD值的测定-4-
5结果与分析-4-
5.1培养温度的测定-4-
5.2pH值的测定-4-
5.3溶氧量对菌体生长的影响-5-
5.4接种量的影响-5-
5.5培养时间的测定-5-
5.6转速的测定-5-
5.7工程菌的生长曲线及诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响-5-
6小结与讨论-5-
参考文献-7-
谢辞-8-
摘要
利用大肠杆菌生产药品是一种生物方法:
即利用生物工程技术将外源基因转入大肠杆菌中,经过发酵培养使之表达,经过离心收集菌体,再用特定的溶液使菌体破碎后收集目的蛋白,在经过后续的一些处理制成药品。
从菌种选择方面进行研究。
工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。
选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种,基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。
为了提高大肠杆菌工程菌生长和目标蛋白表达,缩短生产周期,降低生产成本,进行了单因子试验。
试验分别从培养温度、pH值、溶解氧、接种量、培养时间、转数、诱导时机等方面对rhG-CSF表达的影响进行了逐一研究。
通过试验我们得到了大肠杆菌在10L发酵罐培养的最佳营养条件和最佳环境条件。
通过试验得出的结果培养大肠杆菌,在不同时间段测其OD600nm值,得出最佳诱导时机。
利用得到的结果,结合药品GMP原则,从而得到了大肠杆菌工业化生产工艺,为大肠杆菌表达的目的蛋白大规模生产奠定基础。
关键词:
大肠杆菌;
发酵;
目的蛋白
1前言
1.1简述
大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)为革兰氏阴性短杆菌,又称肠埃希氏菌。
大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌,周身鞭毛,能运动,无芽孢。
主要生活在大肠内。
培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌,菌落呈深紫色,并有金属光泽,可鉴别大肠杆菌是否存在。
在不致病的情况下(正常状况下),可认为是互利共生(一般高中阶段认为是这种关系);
在致病的情况下,可认为是寄生。
它的基因组DNA为拟核中的一个环状分子。
同时可以有多个环状质粒DNA。
大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料。
大肠杆菌是细菌,属于原核生物;
具有由肽聚糖组成的细胞壁,只含有核糖体简单的细胞器,没有细胞核有拟核;
大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。
大肠杆菌细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
作为外源基因表达的宿主,大肠杆菌遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,繁殖迅速,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系,是生物学上重要的实验材料。
1.2重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)
重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),是应用基因重组工程技术制成的一种蛋白质,作为粒系祖细胞及成熟中性粒细胞表面的特异性受体结合,促进前者的增殖分化并增强后者的功能(包括趋化性、吞噬和杀伤功能等)。
本蛋白还可促进髓系造血祖细胞的增殖、分化和成熟,调节中性粒细胞系的增殖与分化成熟;
也可驱使中性粒细胞释放至血流,使外周中性粒细胞数量增多。
rhG-CSF为Ⅱ类造血刺激因子,有细胞系特异性,仅作用于中性粒细胞及其祖细胞。
适用治疗各种原因引起的中性粒细胞减少症,较大剂量也可用于骨髓增生异常综合征,与再生障碍性贫血伴发的中性粒细胞减少症。
2材料与方法
2.1菌种
处于安全考虑,工业生产用的菌株是在生物工程技术不断筛选后被挑选出的菌株。
这些菌株失去了细胞壁的重要组分,在自然条件下已无法生长。
甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。
这样,即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出,也不易导致生化危机。
发酵用菌种的筛选:
用LB液体培养基铺平皿,接种,30℃培养18h,挑单菌落接种于含5mlLB培养基(50μg/ml氨卞西林钠)的试管中,30℃培养至OD600nm为0.4-0.6,升温至42℃,培养3h,离心收集菌体,SDS-PAGE检测,选取表达量最高的克隆菌作为发酵用菌种。
基因工程菌为大肠杆菌DH5α/pBV220。
2.2试剂
氯化钠、氢氧化钠、工业消泡剂、甘油、硫酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、无水硫酸镁、酵母粉和蛋白胨、琼脂等。
2.3培养基及组成成分添加
发酵大肠杆菌所需培养基包括种子罐培养基,发酵罐培养基(以种子培养基为基质,再添加适量营养成分、无机盐和微量元素)。
微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。
在提供上述几种主要营养物质的基础上,培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
每1L配制好的微量元素溶液中含有FeCl3·
6H2O3.24g,ZnCl20.22g,CoCl2·
6H2O0.24g,NaMoO4·
2H2O0.24g,CaCl2·
2H2O0.12g,CuSO4·
5H2O0.20g,H3BO31.00g,MgSO40.74g及62mLw=38%的盐酸溶液。
取130μL上述微量元素溶液及4μL25g/L的维生素溶液,将其一起加入到100mL的培养基中。
2.4培养方法
我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌。
准确称取各成分。
配置LB固体培养基时还需要加入琼脂。
在250ml三角瓶和500ml
三角瓶中分别装入30ml和230mlLB液体培养基。
将三角瓶用6层纱布包住瓶口,再用牛皮纸包好,放入灭菌柜内,121℃液体程序灭菌20min。
2.4.1摇瓶发酵
将在-70℃的甘油管中冻存的基因工程菌(大肠杆菌)菌种接种于装有LB液体培养基的250ml三角瓶中,所有培养基均含氨苄西林钠(Amp)0.1g/mL。
将培养液在37.5℃,200r/min的摇床条件下培养17-18小时,取出,放于洁净密闭工作台中。
手消毒后点燃酒精灯,于工作台中吸取2mL菌液,再接种于装有230mlLB液体培养基的500mL三角瓶中。
将培养液放入摇床中培养,培养至菌体光密度达到所需要求后,将其作为一级种子。
2.4.2种子罐培养
将一级种子接种于10L种子罐培养基(含Amp0.1g/mL)中,通气量为50L/min,搅拌速度为200-1000r/min,当培养至菌体光密度达到所需要求时,升温至42℃,诱导表达一定时间。
发酵中加入一定比例的工业消泡剂消除泡沫,以防泡沫过多,影响发酵。
在接种前取样一次,并将此样品作为比色测定的参比溶液。
接种后每隔30min取样一次,测菌体光密度,最后取2mL发酵终止液进行离心,测定菌体光密度、菌体湿重、菌体干重和rhG-CSF的表达量。
3培养条件对工程菌的生长和rhG-CSF表达的影响
3.1培养温度
在LB液体培养基中,按4%的接种量,30~40℃,200r/min,溶氧量50%,在pH7.5的培养基中培养18h,取菌液测定菌体密度。
每个处理设3个重复。
3.2pH值
以35mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4为缓冲液,将培养基分别调至pH6.0~8.5,4%的接种量,37.5℃,200r/min,溶氧量50%,培养18h后测定菌体密度。
3.3溶解氧
按照4%接种量接人液体大肠杆菌种子液,37.5℃,200r/min,在pH7.5的培养基中培养,并以不同的通气量,使溶氧指数达到20%、30%、40%、50%、60%、70%,18h后取菌液测定菌体密度。
3.4接种量
按照不同的接种量1%、2%、3%、4%、5%,接种于10L发酵罐中,在37.5℃,200r/min,溶氧量50%,pH7.5的培养基中培养,18h取菌液测定菌体密度。
3.5培养时间
按4%接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中,37.5℃,在培养过程中自动控制pH7.5,溶氧量50%,200r/min,培养10h后每隔2h测定菌体密度。
每个处理设3个重复。
3.6转速
按4%接种量接入含LB培养基的10L发酵罐中,在100~300r/min,自动控制pH7.5,溶氧量50%,pH7.5的培养基中培养,37.5℃培养18h后测定菌体密度。
3.7工程菌的生长时间及诱导时机
在选定的发酵罐培养条件下,将种子液接种于发酵培养基中,测定工程菌在37.5℃时的生长曲线,观察工程菌生长和rhG-CSF的表达。
实验同时还比较不同的诱导时机对工程菌生长和rhG-CSF表达的影响。
4OD值的测定
在10L发酵罐中的应用验证取冻存菌株,经二次划平板活化后接种于LB液体培养基中,摇床过夜培养(200r/min,37.5℃)成一级种子。
取一级种子液,以4%的接种量再次转接种于LB液体培养基中,200r/min,37.5℃培养