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费洛蒙感应神经元的配体构象激活气味结合蛋白

CarolinaGomez-Diaz1,JaimeH.Reina1,ChristianCambillau2,RichardBenton1*

1CenterforIntegrativeGenomics,FacultyofBiologyandMedicine,UniversityofLausanne,Lausanne,Switzerland,2ArchitectureetFonctiondesMacromole´culesBiologiques,UMR7257CNRSandAix-MarseilleUniversity,Marseille,France

摘要费洛蒙在许多动物种内沟通时必需的化学语言。

嗅觉系统是如何识别费洛蒙信号的敏感性和特异性均不能很好地理解。

在果蝇的体内一个重要范式的过程性费洛蒙的检测机制（Z）-11-十八碳烯基乙酸酯（乙酸顺式vaccenylCVA）被发现。

CVA-诱发神经元激活需要分泌气味结合蛋白，LUSH，CD36相关的跨膜蛋白SNMP，和气味受体OR67d。

晶体学分析显示，CVA-结合LUSH构象有别于载脂蛋白（未配对的）LUSH。

LUSH的重组表达的突变类型预测，以增强或减弱这些结构性变化，产生相应的自发的改动和/或CVA-诱发的活动，当注入嗅觉感受器时，引导费洛蒙受体模型匹配未游离的CVA，但LUSH是“构象激活”后与CVA绑定。

在这里，我们提出的证据表明，这种模式是矛盾的。

首先，我们证明了相同的LUSH的突变转基因表达的影响既无基础，也没有诱发费洛蒙的活性。

其次，我们比较结构的载脂蛋白LUSH，CVA/LUSH，无费洛蒙配体的LUSH复合物，发现CVA/LUSH没有构象的属性，可以解释其提出的独特的激活状态。

最后，我们表明，除了SNMP或OR67d之外，在没有LUSH的的时候高浓度的CVA也可以诱导神经元的活性。

我们的研究结果与CVA/LUSH复杂的费洛蒙配体行为并不一致，并表明，费洛蒙分子能单独直接激活神经元受体。

引用：

Gomez-DiazC,ReinaJH,CambillauC,BentonR（2013）LigandsforPheromone-SensingNeuronsAreNotConformationallyActivatedOdorantBindingProteins.PLoSBiol11（4）:

e1001546.doi:

10.1371/journal.pbio.1001546

学术编辑：

HubertAmrein,TexasA&MHealthScienceCenter,UnitedStatesofAmerica

收稿：

2012年12月6日截稿：

2013年3月12日出版：

2013年4月30日

版权所有：

©2013Gomez-Diazetal.Thisisanopen-accessarticledistributedunderthetermsoftheCreativeCommonsAttributionLicense,whichpermitsunrestricteduse,distribution,andreproductioninanymedium,providedtheoriginalauthorandsourcearecredited.

资金来源：

CGDwassupportedbythePost-doctoralFICYT-PCTIClarinProgrammefromtheGovernmentofthePrincipadodeAsturias.CCwassupportedinpartbytheFP7EUprojectEnaromatic（FP7/2007–2013,GrantAgreementNo.FP7-222927）.ResearchinRB'slaboratoryissupportedbytheUniversityofLausanne,aEuropeanResearchCouncilStartingIndependentResearcherGrant（205202）,andtheSwissNationalScienceFoundation（31003A_140869）.Thefundershadnoroleinstudydesign,datacollectionandanalysis,decisiontopublish,orpreparationofthemanuscript.

竞争利益：

作者声明不存在相互竞争的利益。

缩写：

CVA，顺醋酸vaccenyl;OBP，气味结合蛋白;ODE，气味降解酶，或气味受体ORCO，气味受体的共受体，OSN，嗅觉神经元;PBP，费洛蒙结合蛋白;PDB，蛋白质数据褚库，SNMP，感觉神经元膜蛋白

作者总结（AuthorSummary）

动物产生的化学信号，名为费洛蒙，同一物种的其他成员沟通，规范社会行为。

如何检测费洛蒙是一个根本性的问题。

费洛蒙的识别是一个重要的模型系统在果蝇中，性费洛蒙顺的醋酸vaccenyl（CVA）激活表达气味受体OR67d的嗅感觉神经元。

CVA神经刺激需要，不仅OR67d也称为LUSH外的气味结合蛋白。

以前的研究工作表明，CVA与LUSH中的蛋白质诱导的构象变化。

LUSH的一种突变版本，模仿这种结构上的改动时，在体外表达，并注入约OR67d神经刺激这些神经元在没有CVA，这表明配体的激活神经元OR67d的是一个CVA/LUSH复杂的，而不是游离CVA。

与此相反，我们表明，相同的突变体，在体内表达时，不激活神经元的OR67d，质疑的构象变化的意义。

我们还表明，高浓度的CVA可以诱导神经元的活动在没有LUSH的，也无OR67d，表明LUSH费洛蒙的检测是非常重要的，但不是必需的。

总之，这些研究结果挑战所建立的模型的CVA信号和建议，这种费洛蒙直接激活OR67d。

介绍

费洛蒙“兴奋”的载体希腊是由个人产生的化学信号，并确认同种诱导定义的行为反应[1]。

因为费洛蒙的基础通信控制不同的社会在许多生物体的相互作用（例如，聚合，亲属识别性和竞争行为），了解这些化学物质如何检测早已是一个根本性的问题[1]。

许多动物费洛蒙是长链烃的[2]，其结构的通用性提供了一个大的化学物种和行为的特定信号的产生曲目[3][4]。

在哺乳动物中，费洛蒙也可以是肽，如啮齿类动物外分泌腺分泌肽1，这是雄性眼泪释放和增强女性性感受性[5]，[6]或小蛋白质，如主要尿蛋白[7]。

在昆虫费洛蒙的检测已被深入研究[8]-[12]。

这些挥发性化学物质从空气中被捕获的昆虫触角的表面上覆盖有多孔的，感觉毛的表皮，头部附肢，称为感受器。

费洛蒙的分子通过，可能是由扩散[13]，通过毛孔内部感器，房子纤毛树突状结局的嗅感觉神经元（嗅觉神经元）（图1A）。

这些纤毛沐浴在淋巴液丰富的气味结合蛋白（OBPs）（也称为费洛蒙结合蛋白藻胆蛋白）和气味降解酶（微分方程），这是从侧翼OSN辅助细胞胞体分泌。

3个跨膜受体本地化费洛蒙传感OSN纤毛：

指令系统之一的气味受体（OR），这被认为是主要的决定费洛蒙反应的特异性[14]，[15]，共受体ORCO[16]，[17]，和CD36相关蛋白称为感觉神经元膜蛋白相关蛋白（SNMP）[18]-[21]。

图1。

费洛蒙依赖的LUSH构象变化。

（A）示意图说明主要超微结构特点和蛋白质参与检测CVA信息素检测毛状感器。

OSN承担一个单一的感觉纤毛异源信息素受体OR67d/ORCO和CD36的相关SNMP本地化。

辅助细胞分泌OBP都至少有三个，包括LUSH，常微分方程，包括羧酸EST-6[49]，到淋巴结内浸润OSN纤毛流到sensillar头发内腔。

（B）CVA-依赖的构象变化，在郁郁葱葱的。

丝带鉴于叠加骨干脂蛋白LUSH（灰色）和CVA/LUSH（绿色，单体A，A只表示构象;也看到图S2）（PDB的ID1T14[27]和2GTE[29]）。

CVA的配位体，是描绘为棒的形式（黄色，碳原子数;红，氧原子）。

最突出的构象的结构之间的差异的范围内的C-末端尾部扫描（CT）。

（C）的特写地区郁郁葱葱的相应残基83-87和115-123（B）所示的结构。

K87，D118，F121的侧链枝表示。

载脂蛋白LUSH（灰色），但不是在此构CVA/LUSH（绿色）-K87和D118可以形成盐桥（虚线）（见表1和图S2）。

DOI：

10.1371/journal.pbio.1001546.g001

一个最好的研究费洛蒙检测系统是黑腹果蝇性费洛蒙（Z）-11-十八碳烯基乙酸酯（乙酸顺式vaccenylCVA），它激活神经活性的OR67d表达的OSNs（图1A）。

遗传分析表明CVA检测需要OR67d[22][23]，ORCO[20][21]，和SNMP[20][21]，以及OBPLUSH[24]。

出乎意料的，LUSH损失也会导致OR67d神经元自发的下降在缺乏费洛蒙导致的主张是OBP在CVA-诱发的神经元活动起着直接的作用，而不是只是作为增溶剂或费洛蒙的载体[24]。

在体外，LUSH结合CVA以及一些短链正醇[25] - [27] ，邻苯二甲酸酯[28]。

APO（CD4结合前状态）LUSH，各种酒精/LUSH的复合物，CVA/LUSH复杂的X-射线晶体结构已报道[25] - [27] [29] 。

LUSH与CVA或醇的配合物的一个显著的共同特点是几乎完全封装内的6个α-螺旋束类似的许多其他的配位体/OBP配合物的配位体[30][31] ，因此不太可能的ORs可以直接识别的配体，在这种复合物内[29] （图1B）。

重要的是，CVA/LUSH络合物的结构不同于载脂蛋白LUSH或酒精/LUSH配合物[25] - [27] [29] ，特异的范围在C-末端尾部（在加工LUSH蛋白的氨基酸113-124位）[29] （图1B和图1C）。

这些观察导致的建议，对CVA/LUSH复杂的这种独特的构象是很重要的的OR67d神经元的刺激[29] 。

重组表达的这些CVA诱发的结构性变化的功能意义已通过测试定向位点突变LUSH，预计将表现出不同程度的构象变化[29]。

这些纯化蛋白注入成个别LUSH突变的动物嗅觉神经元感受器OR67d、OSNs中，缺乏内源性OBP，通过玻璃记录电极。

基底和cva诱发激活这些神经元由细胞外电生理学记录然后测量。

一对互补的突变体LUSHF121A和LUSHF121W，预计将减少或增强构象变化，分别减少或增加CVA灵敏度。

值得注意的是，一个突变体，LUSHD118A，干扰预测盐桥载脂蛋白，但不约束CVA-LUSH[29]，在缺乏CVA时诱导增加OR67d神经元解离。

CVA的这种表现并没有进一步增加这种神经元活性。

这些观察引起CVA诱导“构象激活”LUSH的模型，其中，正是这种CVA/LUSH复合物和非游离CVA，这是公认的神经元的费洛蒙受体（通过一个未定义的机制）[29]。

这种模型与费洛蒙分子最终必须直接结合并刺激费洛蒙感知ORs这种广泛持有的想法相对比[10][11][14][15]，尽管费洛蒙/或相互作用生化从来没有被证明。

然而，发现小蛋白费洛蒙可以刺激嗅觉神经元[7]在哺乳动物细胞外蛋白质，LUSH在昆虫费洛蒙的神经元激活的作用提供了一个有趣的平行。

我们已经测试了这个由转基因表达相同的LUSH突变模型[29]预测影响CVA-诱导的构象变化。

我们发现，在体内表达的LUSH的突变不复述重组LUSH的效果。

我们还表明，在高浓度CVA下，没有SNMP或OR67d的LUSH，是可有可无的诱发费洛蒙活性的物质。

这些结果不支持CVA/LUSH复合物作为费洛蒙传感神经元的配体的主张。

结果

LUSH转基因系统的结构与功能分析

为了测试在体内表达突变体LUSH蛋白的活性，我们首先生成的野生型基因组LUSH的救援构建体，跨越整个转录单元和两侧的间隔序列（图2A）。

这种结构，以下简称为LUSH重量，预计将包含所有必要复述内源性LUSH的表达调控序列。

通过定点突变，我们产生了三个额外的LUSH的结构，编码的蛋白质相当于重组表达LUSH的变种分析（LUSHF121A，LUSHF121W和LUSHD118A）[29]。

集成在每个转基因相同的基因组位置phiC31介导的生殖细胞转化[32]和交叉成一个LUSH的无效突变体背景[33]产生苍蝇，除了内转基因LUSH的编码序列突变的基因完全相同。

我们首先比较LUSH表达这些Westernblot菌株中使用抗LUSH抗体触角蛋白提取物的分析。

在所有的基因型，我们观察到一个单一的突出的范围，它对应于LUSH合作迁移与内源性LUSH的野生型提取物和在LUSH的突变提取物缺失（图2B）。

LUSH的水平相对定量表明，突变或野生型转基因LUSH蛋白的表达差异无统计学意义时相比，内源性LUSH（图2B）。

相同基因型的提取物，这可能是由于难以再现的蛋白质提取小，表皮，触角结构之间有一些变化。

免疫荧光的葱郁,ORCO在触角的部分确认所有转基因LUSH的突变体在辅助细胞周围的ORCO-阳性表示OSNs（免疫荧光检测辅助细胞周围所有的转基因LUSH的变种均以触角部分证实的免疫分泌LUSH在sensillar淋巴结可能是困难的，因为这在很大程度上失去了组织制备和染色过程中细胞外液）。

位于这些LUSH表达细胞内的远侧区费洛蒙检测毛状感器结果（包括壳体OR67d神经元）的天线，在一个模式，从内源性LUSH（图2C）没有什么区别。

图2。

 LUSH转基因系统的结构-功能的分析。

（A）LUSH的基因组救援示意图。

编码外显子的颜色是绿色和5'-和3'-非编码区为灰色，内含子和侧翼的基因组DNA，用黑线表示。

每个基因被插入在attp40登陆网站使用基于phiC31的集成系统在相同的基因组的位置。

（B）上：

代表从指示的基因型的触角蛋白提取物的Western印迹，用一种抗的LUSH抗体（上面板）或控制的抗IR8A抗体（下图）。

基因型（这和所有下面的数字）：

野生型果蝇瓦特1118。

LUSH-/-空突变的果蝇是LUSH的1 /LUSH1。

转基因LUSH的苍蝇是LUSH的x / x茂密，LUSH的1 /LUSH1，其中“ LUSH x “指到指定的LUSH转基因。

底部：

相对定量LUSH的表达在指定的基因型。

水平IR8A使用作为蛋白质加载控制。

任意单位（红色条）±SD四个独立的提取物为每种基因型的光密度（OD值）的平均值，如图所示。

在LUSH的表达野生型和LUSH-/-基因型之间的统计分析（ANOVA和Dunnett多重比较测试，使用野生型平均控制）的表现出显着的差异（** p <0.01），但没有显着差异提取物苍蝇表达不同的LUSH的转基因。

（C）具有抗LUSH（绿色）和抗ORCO（品红）野生型，LUSH-/-突变体，和LUSH转基因动物的触角冰冻切片的抗体的免疫荧光。

图中标尺为20微米。

更高的放大倍率一个光学部分野生型的触角部分的细节显示了两个ORCO两侧由LUSH阳性辅助细胞阳性神经元。

LUSH的表达类似的限制辅助细胞中观察到所有的基因型;绿色和品红色信号重叠是由于辅助细胞覆盖在不同的光学部分的神经元。

DOI：

10.1371/journal.pbio.1001546.g002

LUSHF121突变不影响OR67d神经对CVA灵敏度

CVA/LUSH的复合物，费洛蒙直接与F121的C末端，这表明这种残留物具有核心作用，触发CVA-诱导构象变化LUSH[29]。

据推测，取代F121由一个较小的残余物（如丙氨酸）或更大范围内的残余物（如色氨酸）可能会降低或提高，分别使这种构象变化。

事实上，重组LUSHF121A通过记录电极注入到：

感器OR67d（也被称为T1感器[29]）的突变体LUSH还原灵敏度CVA〜50倍，低于所赋予的重组野生型LUSH跨费洛蒙浓度1000倍的范围[29]。

相反，输注重组LUSHF121W赋予灵敏度的OR67d神经元对CVA有5倍的增长[29]。

总之，这些观察的想法是一致的，CVA-诱导的构象变化，在LUSH的基础OR67d神经元激活。

我们测试是否可以通过转基因LUSH的变种概括这些属性，通过测量CVA-感器单电生理记录LUSHwt，LUSHF121A，LUSHF121W动物在OR67d的神经元的诱发反应。

所有这三个转基因恢复这种费洛蒙的敏感性，一个LUSH的突变的背景（图3A）。

然而，在对比观察重组LUSH[29]，跨越了10,000倍的CVA浓度范围的神经元的反应是非常相似的在所有三种基因型（图3B）。

这些菌株之间唯一的统计学显着差异，观察在刺激浓度最高，在LUSH的F121W苍蝇展出略低CVA灵敏度比LUSH重量（图3B）。

这个结果是相反的报告，重组LUSH的的F121W提高CVA灵敏度[29]。

图3。

 LUSH F121突变不影响灵敏度CVA的OR67d神经元。

（A）代表的痕迹外的OR67d神经元的电生理记录果蝇10％CVA刺激LUSH-/- ，LUSHwt，LUSHF121A，LUSHF121W（参见图2传说基因型的详细信息）。

灰色条表示的刺激时间（1秒）。

（B）的剂量-反应曲线CVA的OR67d神经元，在（A）中的基因型。

绘制平均响应（±SEM Ñ =12-16感器;≤3感器每只动物）。

棱镜GraphPad软件使用日志与响应变量的边坡模型拟合曲线。

有CVA敏感性测试（ANOVA，P=0.1183）之间的所有转基因株系的基因型差异无统计学意义。

有稍微CVA-敏感性的显着减少的LUSH （重量）（p <0.05，Tukey多重比较测试）时相比，在100％CVA为LUSHF121W刺激。

DOI：

10.1371/journal.pbio.1001546.g003

OR67d神经元内LUSHD118突变不会增加自发活性

CVA-诱发构象激活牵连在LUSH的第二个残基D118，被预测以形成盐桥与K87载脂蛋白LUSH结合CVA（图1C）[29]被打乱。

据推测，这种盐桥保持LUSH“无效”状态，导致预测D118的突变会产生一个“激活”LUSH的形式。

同样，重组LUSHD118A被发现诱导CVA增加在OR67d神经元活动在没有重组野生型LUSH，在的野生型OR67d神经元刺激1％CVA的水平相比，[29]。

这LUSHD118A诱发活性取决于两个OR67d和SNMP[29]。

为了测试D118是否是转基因表达LUSH至关重要的，我们测量了在LUSHwt和LUSHD118AOR67d神经元自发活性。

我们还测试了LUSHF121A和LUSHF121W，因为重组LUSHF121A无法挽救损失的自发活动OR67d观察神经元在LUSH的突变，从而提供证据表明LUSH的构象变化和OR67d神经元放电有关[24][29]。

我们观察到，所有的LUSH的转基因恢复的的OR67d神经元的自发放电（图4A）。

这项活动的定量显示其平均发射频率（〜1-3尖峰/s）的轻微变化，但这些差异均无统计学显着不同基因型（图4B）。

更重要的是，并没有表现出LUSHD118A苍蝇的自发活动水平升高报告重组LUSHD118A。

令人惊讶的是，自发放电也观察到在LUSH的的F121A基因型（图4B），这是与重组LUSHF121A活动不一致，但符合我们的观察，转基因蛋白的支持CVA-诱发活动，有效地为LUSHwt（图3B）

基底活动在OR67d神经元在没有LUSH的亏损提供了一个初步的提示，这OBP直接作用在促进OR67d活动[24]。

不过，虽然自发活动高度降低在LUSH的突变体中，还没有完全取消（0.05±0.01尖峰/s的平均值±标准平均误差（SEM）;Ñ=19）（图4A和图4B）。

此外，OR67d/ORCO唤起强大的自发活动，在没有LUSH的时错误表示[14][21]和在OR67d感受器缺乏LUSH的SNMP[21]。

因此CVA这个LUSH的表型和其相关的信号转导的起源尚不清楚。

一个可能的解释是，LUSH的损失感器淋巴液间接影响后OR67d的神经元的兴奋性，改变这种媒介的生理特性。

图4。

LUSH的D118突变不增加自发活动在OR67d神经元。

（A）代表在LUSHOR67d神经元的自发活动的痕迹-/-，LUSHwt，LUSHF121A，LUSHF121W，LUSHD118A。

（B）定量平均自发活动的基因型（A）（±SEMŃ=19-20感器;≤3感器动物）。

有自发活动中，由于测试（秩和检验，P=0.0610）之间的所有转基因株系的基因型差异无统计学意义。

只有LUSH-/-无效突变有统计学显着减少自发活动时相比，所有其他基因型（P<0.0001，邓恩的多重对比测试）。

DOI：

10.1371/journal.pbio.1001546.g004的

LUSHD118突变不影响OR67d神经元对CVA的反应

实验的一个重要的区别与LUSHD118A重组[29]转基因LUSHD118A（图4）是前蛋白急性感器提供了在电生理记录，而后者则是连续出现在淋巴。

我们认为转基因LUSHD118A的可能性也是组成活跃，但其恒定的存在导致脱敏的OR67d神经元。

如果是这样的话，我们就不会想到这些嗅觉神经元能够响应CVA。

然而，我们观察到LUSHD118A转基因果蝇仍然显示强劲的回应了10,000倍的的CVA浓度（图5A和5B）。

这些响应是统计学上没有区别从LUSHwt，除了在最高剂量（图5B）。

CVA-诱发神经元活动的时空动态分析发现，无论是发病和CVA响应的衰减非常相似LUSHD118A和LUSHwt（图5C）。

这些观察结果表明，转基因表达LUSHD118A不会导致脱敏的OR67d神经元。

相反，他们突出的一个重要功能重组和转基因之间的差异LUSHD118A：

LUSHD118A重组据报道，无法支持进一步激活神经元时，CVA是提出OR67d[29]。

这个的观察建议反映的事实，“构激活”LUSHD118A不能被进一步激活CVA。

相比之下，我们的结果表明，转基因LUSHD118A支持CVA诱发野生型LUSH活动基本上相同。

由于这些差异，我们分析了独立产生LUSHD118A转基因株系（图S1）[34]。

在在这些果蝇OR67d神经元的自发活动没有升高（事实上，这是稍低一些）控制救援转基因野生型菌株（图S1A和S1B）相比，和CVA-诱发反应的基本上是正常的（图S1C与S1D），与我们LUSHD118A转基因的性质相一致。

LUSH的复试结构动力学

由于LUSH转基因和重组蛋白质的属性之间的差异，我们重新审查出现的LUSH结构的配位体，该OBP（表1）的构象的存在和类型之间的关系确定。

我们首先叠加12LUSH的结构（图S2A）[25]-[27][29]。

在LUSH的晶体（除了一个在每个不对称单元：

载脂蛋白LUSH，蛋白质数据库[PDB]ID1OOI）的，有两个蛋白质分子，称为单体A和B中的CVA/LUSH[29]（其他气味结合蛋白二聚体的被观察到晶体结构[30]，并没有证据，这反映了在体内生化LUSH的能力。

所有非-CVA方向的的LUSH的结构（除丁醇/LUSHT57APDB3B87的）回路116-122（图S2A）具有相似的构象，并从这些结构CVA/