医院病理科分子病理实验室设计实施方案设计.docx
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医院病理科分子病理实验室设计实施方案设计
医院病理科分子病理实验室
建设方案
第一局部分子病理概述
病理为医之本Asisourpathology,soisourmedicine
分子病理学中常用的分子生物学技术主要有核酸分子杂交、PCR相关技术、免疫荧光化学、基因芯片以与DNA序列分析等。
由于分子病理学的应用，使得我们对疾病本质的认识更加深化，对于肿瘤的诊断和治疗也取得很大的进展。
主要表现在以下几个方面：
1、肿瘤易感基因的检测：
肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛检具有实用价值，已明确的肿瘤易感基因与其相关肿瘤有Rb1（视网膜母细胞瘤）、WT1（肾母细胞瘤）等。
除了检测高危人群的易感基因外，有方法也应用于正常人群肿瘤易感性检测，如检测Ret基因突变用于诊断Ⅱ型多发性内分泌肿瘤，通过分析GST基因型以判断个体暴露于致癌物时的致癌危险性等。
2、肿瘤相关病毒的检测：
如HPV病毒与宫颈癌的发生有很大关系，通过对HPV病毒的检测可起到预防和提早治疗的作用。
而当前国际上诊断HPV感染以DNA检测为主。
3、肿瘤的早期诊断：
K-ras基因突变在结肠癌、胰腺癌和肺癌等肿瘤中发生率较高。
应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌的第12密码子变突。
应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中的Ras基因突变，其检出率与瘤组织中相似，可用于高危人群的筛选。
4、疑难肿瘤的诊断和分类：
传统的病理学诊断主要通过形态学和免疫表型来判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤，但对对医生的经验要求较高，且难度较大。
应用RFLP分析免疫球蛋白或T细胞受体基因重排，具有鉴别诊断作用，且这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。
对Bcr区基因重排的检测，可对慢性粒细胞性白血病和急性粒细胞性白血病进展鉴别诊断。
N-myc和C-myc扩增和表达的检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值，因前者N-myc明显扩增，而后者如此为C-myc明显扩增。
5、肿瘤的预后监测：
利用癌症患者的全基因序列开发出的个性化血液检测方法有助于医生调整癌症患者的治疗方案，可以监测癌症治疗后的情况以与发现癌症是否复发。
6、为肿瘤个体化和预见性治疗提供依据：
肿瘤在发生、开展的不同时期，可能涉与不同基因的不同变化形式，而这种变化与肿瘤临床治疗的敏感性密切相关，如能在分子水平对肿瘤基因变化提供指标，对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义。
如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺癌中存在Ras基因的激活，50%左右的肿瘤有P53基因不同形式的突变，这些基因的异常，使肿瘤对某些放疗或化疗的方法具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，如此可提高放、化疗的敏感性。
7、肿瘤的预后判断：
肿瘤基因的突变、扩增与过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。
如HER2基因扩增与乳腺癌发生开展与临床预后密切相关,HER2的阳性表达提示预后不良，可通过荧光原位杂交〔FISH〕技术进展检测，配合术后治疗，指导临床用药。
分子病理诊断的应用X围
⏹人类遗传病的基因诊断和产前诊断
⏹肿瘤分子靶向治疗
⏹明确感染性疾病的病源体〔细胞、真菌、病毒〕
⏹多基因病研究
⏹组织器官移植配型
⏹辅助病理诊断
⏹法医学
⏹性别鉴定
⏹根底研究
◆通过PCR技术确认Ig和TCR基因是否发生重排，判定淋巴造血系统疾病的良恶性。
◆FISH法检测乳腺癌her-2基因是否发生扩增，指导临床靶向药物〔赫赛汀〕治疗。
◆FISH法检测滑膜肉瘤SYT基因是否发生易位，协助临床诊断。
◆通过对结直肠癌KRAS基因的突变测序分析，指导靶向用药〔爱比妥〕。
◆HPV多亚型检测，提示宫颈癌的发病风险。
◆肺癌分子靶向治疗EGFR酪氨酸激酶抑制剂：
吉非替尼（gefitinib,商品名Iressa）、埃罗替尼（Erlotinib,商品名Tarceva）
◆检测HER2状态的临床价值胃癌靶向治疗患者筛选、疗效预测
◆免疫组织化学〔IHC〕技术－检测蛋白
◆分子原位杂交－DNA，RNA
◆荧光原位杂交〔FISH〕技术－DNA，RNA
◆多聚酶链式反响PCR技术－DNA，RNA
◆荧光定量PCR－DNA，RNA
◆DNA测序技术－DNA突变
◆生物芯片技术－DNA，RNA，蛋白质等
◆DNA印迹〔Southernblot〕
◆微卫星不稳定检测〔MSI〕
医院病理科开展分子病理实验项目，一般从实用出发，二级医院主要开展荧光原位杂交〔FISH〕项目，三级医院主要开展荧光原位杂交〔FISH〕、荧光定量PCR项目，有条件的三级医院可以开展DNA基因测序项目。
1.3FISH-荧光原位杂交
FISH技术是一种通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，在荧光显微镜下能原位显示细胞核内杂交信号的分子细胞遗传学技术。
FISH技术检测基因扩增的准确性比其他检测技术高，可以防止由于染色体的多体而呈现的假阳性，被誉为“金标准〞。
◆实验流程FISH样本的制备--探针的制备--探针标记--杂交--〔染色体显带〕--荧光显微镜检测--结果分析◆FISH优点1.荧光探针商业化、采购方便、保存安全。
2.实验周期短、特异性好、定位准确。
3.可定位1KB的DNA序列，灵敏度高4.一次染色可获取24种不同颜色的染色体，对于隐匿性的缺失、异位诊断准确。
◆FISH技术在医院的运用一切与染色体相关的科室。
特别是病理科、血液科、妇产科、生殖中心〔产前诊断、植入前诊断〕等。
目前应用于临床检测的FISH基因探针有接近于一百种。
在美国，FISH探针已被FDA列为“特异性分析试剂〞，不需批准即可用于临床医学检测。
所以，FISH检测在国外应用非常广泛和迅速。
如Vysis、Cytocell等公司，其产品已遍布全球，但其价格较贵，严重阻碍了在我国国内的推广。
国内厂家，如金菩嘉和某某安必平，近年来开展迅速，品种覆盖X围较广，且产品质量保证、性价比高。
并且，更为有利的是，国内公司供货快速与时、售后服务好。
由于国内厂家的崛起，近年来国内医院开展FISH检测的速度大大加快。
◆FISH技术实验室根本要求
①实验室环境：
样本准备区、暗室〔10-15平米左右〕；
②实验设备：
荧光显微镜以与荧光成像分析系统、水浴锅、原位杂交仪、冰箱、离心机、恒温箱
③办公设备：
电脑、打印机
④实验耗材：
FISH探针，进口如雅培、罗氏
细胞类探针：
诸如血液病类，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等。
其次，产前诊断和产后筛查类；实体肿瘤类探针：
病理科在检测乳腺癌、子宫颈癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌、软组织肉瘤、前列腺癌、甲状腺癌等方面。
⑤技术人员：
1人
1.4局部FISH产品比照〔厂家提供，仅供参考〕
品牌
比拟
某某安必平
金菩嘉
雅培〔Vysis〕
探针种类
覆盖70种肿瘤探针，品种齐全，覆盖了实体瘤与血液疾病。
约40种，局部肿瘤没有覆盖。
覆盖70种肿瘤探针，品种齐全，覆盖了实体瘤与血液疾病。
探针质量
用多个克隆标记探针，信号灵敏，背景低，质量与国外相当。
实体瘤探针质量与国外相当，但血液病探针信号不佳。
探针信号灵敏，背景低，质量好。
价格
由于有自己的研发团队，探针都为自产，本钱较低，具有强大的价格竞争力，本公司的出现也打破了国内公司一家独大的垄断。
价格比雅培低，但高于安必平。
由于异国操作，运营本钱高，价格高。
操作便利性
即用型探针：
探针溶液已包含杂交液组分，可直接点样杂交，无需杂交前溶解探针和混匀探针与杂交液，方便操作和减少出错。
探针与杂交液分开，杂交前需在黑暗环境中混合两者，操作不变、容易出错。
探针与杂交液分开，杂交前需在黑暗环境中混合两者，操作不变、容易出错。
辅助试剂
配送FISH所需的常规试剂〔蛋白酶K或胃蛋白酶、NP-40、多聚甲醛、20×SSC等〕，节约客户采购时间与本钱。
搭配蛋白酶K一起销售。
搭配蛋白酶K、NP-40等一起销售。
荧光显微系统配置
从客户出发，帮客户选用性价比高的荧光显微镜与图像分析软件，操作便利，性价比高。
满足要求，但价格较高。
满足要求，但价格较高，且客户可能需自己配置系统。
显微镜
明场观察
配相差功能，可镜下仔细观察蛋白酶消化状态，对小体积样本与珍贵样本处理特别有效，防止消化不佳导致杂交结果不好。
不配相差功能。
不配相差功能。
标配滤块
对新客户标配四种颜色的荧光滤块〔DAPI、绿、红、青〕，可同时满足实体瘤与产前诊断。
只标配三种颜色滤块〔DAPI、绿、红〕，如需开展产前诊断的话客户还要额外购置青色滤块。
只标配三种颜色滤块〔DAPI、绿、红〕；如需开展产前诊断的话客户还要额外购置青色滤块，且需用到金色滤块〔容易出现窜色〕，滤块配置要求太高。
检测靶标
因为标配了四种滤块，可同时检测三个靶标〔绿红青〕，临床检测效率高、能降低试剂本钱、且能应用于多靶标检测的科研课题。
只有两个靶标的试剂〔绿红〕，靶向选择与组合受限。
有同时检测三个靶标的试剂，但因为不是标配，应用受限。
图像分析软件
有自主研发的图像分析软件，降低客户采购本钱。
外购。
外购。
品种设计
因为所有探针都为自主研发，可为客户灵活设计产品探针组成，以便临床、科研充分使用与降低试剂本钱
探针不能根据客户需求进展调整，可能存在试剂本钱较高的风险。
探针不能根据客户需求进展调整，可能存在试剂本钱较高的风险。
特色产品
能设计多个“二合一〞探针组合；
15种微缺失探针〔用于流产原因筛查与其他少见综合症〕；
只有局部基因探针。
不能根据客户需求设计“二合一〞探针。
国内SFDA证书
两个产品取得注册受理号，即将取得注册证书。
几个产品取得注册证书。
两个产品取得注册证书。
地理位置
位于某某，华南地区客户地理位置近，送货与服务与时到位。
位于，华南地区服务不便。
位于国外，国内虽有代理，但售后服务与技术支持不能最快反响。
平台支持
有多年其他产品的网络支持，如病理科中的液基细胞学平台，与客户建立了多年来的良好关系。
产品单一，只有FISH试剂，设备、人员投入高。
有其他试剂，但病理科中只有FISH，无其他平台支持。
售后服务
借助于广泛的液基细胞学网络与合作公司达安基因的全国网络，售后服务迅速周到。
售后服务网络单一，售后服务风险较高。
售后服务网络单一，售后服务风险较高。
优势资源
与达安基因合资，充分利用全国广泛的销售与技术支持资源。
——
——
特殊资源
有自己的学术核心期刊《分子诊断与治疗》，方便客户课题研究。
无
无
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反响体系中参加荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进展定量分析的方法。
◆临床疾病诊断：
各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物与瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。
◆实时荧光定量PCR分子病理诊断应用
•绝对定量〔AbsoluteQuantification〕
>病原体检测（HiV,HBV,结核杆菌,H1N1等〕
>基因表达研究（白血病融合基因表达检测〕
•相对定量〔RelativeQuantification〕
>肿瘤组织中的特定基因表达（EGFR,VEGFR,BRCA1&2,ERCC1&2,RRM1〕
>肿瘤Bio-Marker特定miRNA检测——1900多个试剂盒
>V研究——超过160万个TaqManCopyNumerAssay
>药物疗效考核
•突变分型〔AllelicDiscrimination〕
>基因突变分析-肿瘤个体化医疗
>SNP研究——2600个药物代谢试剂盒,个体化医疗
>物种鉴定、菌株鉴定
•阴阳性检验〔Plus/MinuswithIPC〕
•稀有突变检测〔早期肿瘤诊断：
外周血痕量肿瘤细胞等
◆荧光定量PCR显著优点 〔1〕、可以进展准确的定量检测，可适用于基因诊断的各种疾病； 〔2〕、定量X围极宽，样品无需做梯度稀释； 〔3〕、特异性更强，克制了假阳性的主要来源； 〔4〕、操作快速，无需PCR后处理； 〔5〕、技术简单，易于学习和掌握； 〔6〕、安全，对操作员和环境都无危害。
〔7〕、易于进展电脑化操作和数据管理，有利于医院的现代化建设。
◆实时荧光定量PCR检测肿瘤的有关项目 CEA mRNA、AFPmRNA、uPAmRNA、CK19mRNA、CK20mRNA、MDRImRNA。
1.6基因测序
DNA测序技术主要依据Sanger的双脱氧链终止法。
以DNA单链为模板，在特定条件下，用特异的引物在测序级DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原如此，不断将4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）加到引物的3''-羟基末端并使引物链得到延伸。
将测序结果用DNAsequencinganalysis5.1软件自动分析原始测序数据，获取测序电泳图和序列图。
临床基因测序检测对病理科的形态诊断金标准含金量的提升和分子病理技术的开发与经济效益改善有现实意义。
对于可疑癌前病变患者可以明确其病变标本是否真正含有候选基因的突变，以解除大量由免疫组化标记癌基因阳性患者的心理恐慌和经济负担。
对癌症家族有血缘关系的亲属检测相关癌基因突变或多态性，具有亚健康诊断和体检意义。
第二局部分子病理实验室设施与环境
1、布局合理、实验室各区域的划分；
2、水电、照明、通风符合实验室根本要求；
3、消防设施齐全、消防通道畅通；
4、石蜡组织、DNA样本的存放；
5、实验室记录、操作手册等文件存放；
6、实验室耗材、试剂的存放；
7、安装生物安全防护设施；
8、废弃物的处置
9、实验室的清洁与日常消毒、并有相关记录
其中：
PCR实验环境要求
①明确分区，一般分为4个工作区；
②各区独立，互不相通；
③设置缓冲间，设置传递窗；
④单一方向
FISH实验环境要求：
需要避光独立的暗室，专门的荧光显微镜观察室
第三局部病理科实验室质量管理标准
1、卫生部【2009】31号文件《病理科建设与管理指南〔试行〕》
2、2006年6月1日实施的《医疗机构临床实验室管理方法》
3、全国各省市的关于临床病理专业质量检查与评价标准
4、美国CAP认可标准
5、欧洲NordiQC认证标准
6、国际标准化组织制定并于2003年正式发布医学实验室的管理标准：
ISO15189:
2003《医学实验室质量和能力的专用要求》，由国际实验室认可合作组织〔ILAC〕推荐执行。
适合临床多学科实验室对检验前、中、后全过程的管理。
第四局部分子病理常用检测设备
1、徕卡Leica荧光显微镜原位杂交图像分析系统
品牌/型号:
LEICADM2500技术参数
一、荧光显微镜局部
1、配显微镜主机
2、光学系统：
无限远校正光学系统。
3、具有明场、荧光观察功能。
4、6位物镜转换器。
5、总放大倍数：
50X-1000X。
6、*三目观察镜筒，分光比例：
100%/0,50%/50%,0/100%
7、透射光照明：
12V100W卤素灯。
8、底座带滤片架和日光滤光片。
9、*单手操作样夹,方便同时记录。
10、*调焦与X-Y调节全对称,实现无疲劳操作。
11、*调焦旋钮高度可调
12、*3步聚焦（粗/中/细）,钮距可调,停焦可调。
13、*聚光镜:
带与物镜放大倍数相匹配的孔镜光栏彩色标记,方便聚光镜调节
14、超硬镀陶瓷载物台
15、*载物台调节左右手可以更换。
16、X-Y移动无暴露齿条。
17、配平场半复消色差物镜：
1.25x〔NA=0.04〕，平场半复消色差荧光物镜10x〔NA=0.30〕，平场复消色差荧光物镜63x〔NA=1.30〕oil,平场半复消色差荧光物镜100x〔NA=1.30〕oil。
18、目镜：
10X宽视野目镜，视野数为25mm；
19、荧光装置：
5位荧光滤块转换器，配紫外、蓝色、绿色荧光激发。
UV激发:
激发340-380nm;阻挡400nm;发射:
425nm;
Blue激发：
激发480/40nm;阻挡505nm;发射:
527/30nm;
Green激发：
激发546/12nm;阻挡565nm;发射:
600/40nm
20、外置荧光光源：
外置金属卤化物光源，长寿命，免调节工作时间2000小时以上。
光源通过光纤传输，无热力传输。
21、*有荧光“零像素点漂移〞技术。
22、*有光陷設計可以确保有很黑的背景:
倾斜的发射光滤块,吸收雜光的黑色涂层,磨光外表和减少反射的涂层。
23、配1x接口
二、数码成像系统局部：
配高灵敏度双速单色冷CCD数码摄像头参数，半导体式制冷，-20度。
2/3英寸CCD，像素1392x1040（1.4Mpixel），像素大小6.45xumpixels，感光面积8.9*6.6mm。
三、细胞染色体核型与荧光原位杂交分析软件
1、CytoVisionkaryotyping染色体核型与荧光原位杂交分析
1.1、有完备的染色体图象处理技术，对染色体之间的重叠交叉和连接等都可用单键自动分割或手动画线分割，划线切割时画错可以任意后退回擦；
1.2、画中轴线别离染色体时，不同染色体自动用不同颜色突出；
1.3、可对显带不够清晰的染色体应用不同的高斯数阵显示格式使条带明晰；
1.4、染色体放大、缩小、旋转、翻转、镜向翻转；
1.5、可自动或人工干预识别着丝粒位置，可自动或手动将染色体拉直
1.6、可以创建用于自己染色体样品的分类体系以增加分类的准确性，也可以对已有的分类器进展训练，使之与分析对象更匹配
1.7、快速校正错放和未识别的染色体
1.8、可以编辑定义染色体标准模式图
1.9、强大的（CASEVIEW）功能，可对捕获的中期相图进展分类标记，可根据需要选择不同的中期相分别进展核型分析、染色体数目直接计数和中期染色体直接标记
1.10、强大的多细胞平行比拟（MULTICELL）功能，方便比拟同一或不同玻片上的同一号染色体的差异
1.11、强大的主任管理（DIRECTORREVIEW）功能，方便和复查相关病例的核型结果；
1.12、可识别G、R、Q、C、DAPI的显带分型，G带有300、400、550、700、850条带的分类标准、R带有400、550条带的标准；
1.13、强大的实验室管理、质量控制和数据统计功能，可追踪染色体分析的数量，可对各种不同类型病例进展分类统计。
2、CytoVisionFISH荧光原位杂交分析模块
2.1、多通道颜色采集，不限数量
2.2、可以识别出DAPI和PI染色的染色体分带细节
2.3、可对FISH图像的探针信号比照度调节
2.4、可对局部选择对目标信号单独修饰
2.5、有对信号的感兴趣区采集功能
2.6、可用于探针标记和G-带染色体比拟
2.7、可计算FISH信号的强度面积距离等
2.8、可测量P端长度比〔FLPTER〕值
2.9、可对中期FISH图中的信号进展定位
2.10、可对中期FISH图进展染色体分割排列
2.11、核型图可显示为反转黑白条带〔与G带带纹匹配〕
2.12、FISH核型图可显示为彩色荧光图
2.13、彩色荧光信号可明确显示位于哪条染色体具体什么位置
2.14、强大的捕获中和铺货后图像处理功能〔除常规GAMMA、比照度、锐化柔化、消除等等功能外，还可以使用多种高斯数阵改变图像显示方式〕
2.15、可手工直接对间期细胞进展分类标记，然后自动统计每一类细胞的数量和百分比
2.16、可在FISH图像上添加文字和图谱
2.17、可与染色体标准模式图或核型图比拟
2.18、可与染色体核型图出在一X报告上；
2.19、Z轴分层采集：
每种荧光素独立设置不同参数，分别进展分层采集，然后自动合彩色图像，层间距根据细胞大小灵活设置，层数根据目标厚度灵活设置，探针大小可灵活设置，克制了荧光信号不在同一焦平面上倒置局部信号虚化或缺失的问题，使FISH信号点数清晰可数，使FISH图像漂亮美观
2.20、荧光点分类计数：
自动搜索间期细胞、定位间期细胞、自动采集、统计每个间期细胞上不同荧光信号数量，统计融合信号，统计不同类细胞数量和百分比，可在扫描捕获中使用z轴分层采集
3、原装进口Dell电脑,Windows7控制系统;22〞LCD显示屏。
◆选配：
建议核型加荧光原位杂交一起购置这样对用户教师使用X围更广，含盖的面就比拟全，如细胞中期和间期的荧光原位杂交都可以观察，而且精度就会很高。
2、LeicaBond-Max全自动免疫组化和原位杂交多功能染色机
Bond-Max是一台性能卓越的全自动免疫组化染色机，免疫组化的所有步骤-烤片、脱蜡、抗原修复、阻断、标记一炕、标记二抗、显色直到复染-都可以由Bond-Max自动完成，
每个Bond-Max有3个玻片盘，同时最多可容纳30X玻片，而每个玻片盘可独立执行不同程序
3、罗氏LightCycler®480模块式高通量实时荧光定量PCR系统
超过10年的实时定量PCR系统与试剂研发的丰富经验，凝聚成今日业界的经典之作。
先进
■ Therma-BaseTM热循环技术和改良光路设计确保检测均一性，彻底消除边缘效应。
■ 可以进展高分辨率熔解曲线分析的模块式高通量荧光定量PCR系统。
■ 配合LIMS系统与自动进样机械臂可实现远程控制和自动化运作。
准确度高
■ 动力学X围广，可检测到100-1010个拷贝DNA。
■ 重复性高，CV＜0.15%。
■ 高重复性，孔间温度均一性可达±0.1℃
■ 高分辨率，轻松区分1000与2000拷贝模板浓度差异。
灵活
■ 96孔、384孔热循环模块用户自助更换。
■ 荧光染料和试剂完全开放。
■ 5个激发通道，6个检测通道，支持多种检测模式。
■ 可广泛应用于绝对定量、相对定量、产物鉴定、终点法基因分型、熔解曲线基因分型、MicroRNA研究、DNA甲基化研究、HRM基因扫描等研究。
高速
■ 反响时间（40个循环）：
384孔＜40分钟，96孔＜60分钟。
4、罗氏BenchMarkGX全自动多功能组织病理检测系统
·柔性自动化
使IHC、ISH和FITC载片的所有制备步骤实现完全自动化；可单独或同步处理IHC、ISH和FITC检测。
·灵活优化临床研究方案
·可选择您自己的原抗体，也可选择Ventana提供的即用型抗体
·可根据您的比容量/通量要求选择一个或多个BenchMark
·一触式双色方案
·染色自动烤片
·一流技术
·自动烤片
·自动脱蜡
·自动细胞调节
·自动染色
5、IlluminaHiSeq2000高通量测序仪
HiSeq2000测序涉与生物学各领域，包括DNA测序、RNA测序、某某因组测序、甲基化测序、外显子捕获测序、ChIP-Seq等。
因此，HiSeq2000能够为基因调控分析、转录组分析、SNP位点、结构变异分析和疾病分析等提供迅捷、庞大、准确的信息数据。
6、NatureGeneTermoBrite原位杂交仪 一次可进展12X切片的实验 ·反响舱密封禁闭，温度适宜 ·准确的
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