短柄五加果实中多糖提取工艺研究.docx
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短柄五加果实中多糖提取工艺研究
短柄五加果实中多糖提取工艺研究
摘要：
研究短柄五加果实中多糖提取和纯化工艺。
利用水提醇沉法进行多糖的提取，通过单因素实验和正交实验确定短柄五加果实多糖提取最佳工艺条件为：
料液比1:
35（W/V）、提取温度80℃、提取时间75min、pH6.0提取1次得到多糖样品提取率为4.243%。
该研究为短柄五加果实多糖的工业化生产提供数据支持和理论指导。
关键词：
短柄五加果实；多糖；正交试验
StudyontheExtractionandPurificationofPolysaccharidefromAcanthopanaxbrachypusHarms
Abstract：
[Objective]TheobjectiveofthisstudywastoextractandpurifypolysaccharidefromAcanthopanaxbrachypusHarms.[Methods]PolysacchayideextractedfromAcanthopanaxbrachypusHarmsbywater-extraction-alcohol-precipitationmethodweredeterminedbyphenolsulfonicacidspectrophotometry.[Results]Theresultsshowedthattheoptimumconditionsbasedonsinglefactorandorthogonaltestareasfollows:
twoextractingAcanthopanaxbrachypusHarmswith1timevolume（V/W）of35ethanolaatpH6.0for75minat80℃.Undertheseconditions,theextractionyieldis4.243%,purityis43.25%.[Conclusion]ThestudyprovidedatasupportandtheoreticalguidanceforthefruitsofpolysaccharidefromAcanthopanaxbrachypusHarmsofindustrialproduction.
Keywords:
AcanthopanaxbrachypusHarms；polysaccharide；Orthogonalexperiment
引言
短柄五加（AcanthopanaxbrachypusHarms）为五加科五加属药食两用植物，其具有悠久的药用和食用历史。
世界上仅中国西北部黄土高原区有分布。
短柄五加具补肾健脾、养心安神、解郁活血等功效[1]，可作刺五加替代品[2]，其根、茎和叶已用于各种疾病的治疗[3]。
目前对其在根茎化学成分[4-9]、生殖生物学和生态学方面研究较多[10]。
短柄五加果实产量高、口感好，富含Fe、Se、Cu、Mn等多种微量元素和人体全部必需氨基酸及阿拉伯糖、果糖、葡萄糖及天然色素等，具有极大的开发价值。
多糖是多个单糖通过糖苷键聚合而成的高分子物质。
部分活性多糖具有显著而广泛的药理作用。
可治疗癌症、多种免疫缺陷疾病、某些耐药菌与病毒引起的慢性疾病和诱导干扰素产生[11]。
短柄五加多糖为其药效成分之一，可参与人体细胞的多种代谢过程和生理功能调节，其独特的活性和低毒性使其在临床上具有较强的发展潜力。
目前，多糖的提取工艺常用水提醇沉法。
由于植物中多糖常与其他成分共存，该工艺提取的粗多糖含有大分子蛋白质、色素、无机盐及其他杂质[12]。
胡浩斌采用超声-微波辅助流动提取技术（UMAFE）对短柄五加茎皮中的多糖类成分进行提取分离[13]。
黄土高原子午岭林区为短柄五加天然原产地，野生资源丰富，果实产量高，但其果实多糖开发利用研究较少，因此，本研究旨在摸索和探讨其果实中多糖提取最佳工艺，以期能够为食品和药品领域拓展研究思路，并进一步为短柄五加果实中多糖的开发利用提供科学依据及数据参考。
1材料与方法
1.1材料和试剂
短柄五加果实短柄五加果实样品于2008年10月采于甘肃省庆阳市子午岭中湾林场。
将采集的新鲜果实挑选干净，室内阴干，收储。
95%乙醇，石油醚（60℃～90℃），浓硫酸，蒽酮试剂，三氯乙酸，Severg试剂（氯仿：
正丁醇=3:
1），以上试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
PC-1000数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；SHB-3型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；724微机型分光光度计，上海光学仪器厂；电子天平ISO9001，北京赛多利斯科学仪器有限公司；颗粒制冰机B-60S,上海康华生化仪器制造有限公司；冰箱BCD-220MLVP,苏州三星电子；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；UV757CRT紫外可见分光光度计，棱光仪器公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；TDZ5-WS多管架自动平稳离心机，长沙市湘仪离心机厂；TGL-16G离心机，飞鸽仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1短柄五加果实预处理
实验前用70℃恒温干燥箱将短柄五加果实烘干，粉碎，过80目筛，置于棕色瓶中低温保存。
准确称量300.00g果实粉末，加入600ml石油醚浸泡48h，抽滤，重复以上操作，直至石油醚相颜色变浅，以除去果实中脂溶性杂质。
用95%乙醇600ml浸泡两天，减压抽滤，以除去极性较大的杂质，将样品干燥后称重。
1.3.2葡萄糖标准曲线制作
精确称取100.00mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至1000ml，得到浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准液。
称取0.1g蒽酮，溶于76ml浓硫酸中，用蒸馏水定容至100ml，得到0.1%的蒽酮试剂。
取21支干燥洁净试管分为1，2，3，4，5，6，7共7组，每组3个平行，然后按表1加入不同体积葡萄糖标准液及蒸馏水，在冰浴条件下分别向7组各加5.0ml0.1%蒽酮试剂。
置于沸水浴7min，冷却至室温，在620nm下测定吸光值，求出回归方程Y=0.00558X-0.00454，R2=0.9918，其中Y为吸光值（A），X为浓度（μg/ml）。
表1标准曲线的制作
试剂
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液
0
0.10
0.20
0.30
0.40
0.60
0.80
水
1.0
0.90
0.80
0.70
0.60
0.40
0.20
蒽酮试剂
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
总体积
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
6.0
图1葡萄糖含量测定的标准曲线
1.3.3短柄五加果实多糖单因素实验
根据多糖提取工艺相关文献报道，固液比、提取时间、提取次数、pH、温度是影响粗多糖提取效果的主要因素，通过研究单因素对短柄五加果实多糖提取率的影响，以确定正交实验研究范围。
取5.00g预处理样品，按固液比1:
10、1:
20、1:
30、1:
40、1:
50，pH7.0，80℃水浴浸提3h；按时间1h、2h、3h、4h、5h、6h，固液比1:
30，pH7.0，80℃水浴浸提；按温度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，固液比1:
30；pH7.0，水浴浸提3h；按pH分别为6、7、8，固液比1:
30；80℃水浴浸提3h。
以上所得提取液减压浓缩，浓缩液用5倍体积95%乙醇沉淀，静置于冰箱内24h，5000r/min离心10min，取沉淀置80℃烘箱中烘干，计算干膏质量；测定多糖含量，计算粗多糖提取率，以确定不同单因素对短柄五加果实多糖提取率影响
1.3.4短柄五加果实多糖含量测定
取0.01g干膏，置锥形瓶中，加蒸馏水50ml溶解，取1ml溶液，按测定标准曲线的方法测定多糖含量，计算粗多糖提取率。
测定用蒽酮比色法，利用糖类在较高温度下被硫酸脱水生成糖醛或糖醛衍生物后与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收峰，在糖含量150µg/ml以内吸光度与糖浓度成正比的原理，根据标准曲线即可得到样品中多糖含量。
计算提取率与纯度，公式如下：
产物中多糖质量（g）
提取率（100%）＝×100%
短柄五加果实质量（g）
产物中多糖质量（g）
纯度（100%）＝×100%
产物质量（g）
1.3.5正交实验
在单因素实验基础上选取主要影响因素时间（A），温度（B），pH（C）和料液比（D）为研究对象，采用四因素三水平正交实验研究短柄五加果实多糖不同条件下提取效果，每个实验条件下做三个平行实验，并对正交实验结果进行分析，确定最佳提取工艺。
表2正交实验因素水平表
水平
A时间（min）
B温度（℃）
C（pH）
D料液比（W/V）
1
45
70
6
1:
25
2
60
80
7
1:
30
3
75
90
8
1:
35
取0.01g粗多糖干膏，定容至50ml，得到浓度为0.2μg/ml粗多糖溶液，取1ml溶液于试管中，在冰浴中加0.1%蒽酮试剂3ml，按测定标准曲线的方法测定多糖含量，计算粗多糖提取率。
1.3.6提取次数对多糖提取率的影响
在优化工艺的试验条件下，对提取次数进行分析。
按次数为1、2、3次，固液比1:
30，pH7.0，80℃水浴浸提3h，提取液减压浓缩，将浓缩液用5倍体积95%乙醇沉淀，静置于冰箱内24h，5000r/min离心10min，将所得沉淀置于80℃烘干，按测定标准曲线的方法测定多糖含量，计算粗多糖提取率，确定最佳提取次数。
1.3.7短柄五加果实多糖脱蛋白
severg试剂法根据蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性的特点，从而去除蛋白。
按多糖水溶液体积的1/4~1/3加入氯仿:
戊醇（正丁醇）=5:
1，剧烈振摇20~30min，除去含有蛋白质的氯仿和正丁醇混合液。
该法条件温和，可避免多糖降解，但除蛋白效率不高，需多次萃取。
取0.5g粗多糖加蒸馏水定容到100ml，配制成0.5%粗多糖溶液；Severg试剂：
（体积比）氯仿:
正丁醇=5:
1。
取24支试管，分为8组，编号0~7，每组3个平行，按表3操作，取上清液0.2ml稀释至4ml，分别在260nm、280nm下测定吸光值，根据蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260（mg/mL），计算蛋白含量。
表3severg试剂脱蛋白
序号
0
1
2
3
4
5
6
7
多糖溶液（ml）
蒸馏水4
4
8
12
14
16
20
24
Severg试剂（ml）
1
1
2
3
3.5
4
5
6
充分摇匀，静置过夜，0，1号管取上清，5000r/min离心5min，取上清，保存待用
三氯乙酸法
确定最佳三氯乙酸浓度：
取0.5g粗多糖定容至100ml，制成0.5%粗多糖溶液。
配制不同浓度三氯乙酸水溶液：
1%、3%、5%、7%、10%、15%。
取21支试管，分为1、2、3、4、5、6、7共7组，每组3个平行，分别加入3ml粗多糖溶液，然后每组依次加入0%、1%、3%、5%、7%、10%、15%三氯乙酸溶液各3ml，摇匀，静置12h，5000r/min离心5min，取0.3ml原液稀释20倍，在260nm和280nm下比色测定蛋白质含量。
确定最佳三氯乙酸体积：
确定5%三氯乙酸作用下的最适体积：
取24支试管分为8组，每组3个平行，分别加入0.5%粗多糖溶液各4ml，5%三氯乙酸1、2、3、4、5、6、7、8ml，摇匀，静置12h，5000r/min离心5min，取0.3ml原液稀释10倍，分别在260nm和280nm下比色测定蛋白质含量。
2结果与分析
2.1单因素实验
2.1.1固液比对粗多糖提取率的影响
表4料液比对粗多糖提取率的影响
固液比
吸光度（A）
多糖含量（μg）
干膏质量（g）
多糖提取率（%）
1:
10
0.288
8.471
0.4698
0.796
1:
20
0.156
7.368
0.4080
0.602
1:
30
0.044
12.196
0.6784
1.655
1:
40
0.078
11.654
0.6480
1.510
1:
50
0.097
10.905
0.6061
1.321
图2料液比对多糖提取率的影响
图2和表4数据可知，当料液比逐渐增加，多糖提取率逐渐升高，从0.602%上升至1.655%，升幅为63.630%；当料液比为1:
30时，短柄五加果实多糖提取率最高（1.655%），其后，随料液比增加，多糖提取率逐渐降低，从1.655%降至1.321%，降幅为20.18%。
以上结果表明：
随料液比逐渐增加，短柄五加果实多糖提取率呈先增加后减少的趋势。
一般来说，溶剂用量越多，产物提取率越高，但当料液比大到一定程度时，有效成分已经基本析出完全，再增大料液比，不但不会提高目标产物的提取率，而且还会使更多杂质继续溶出，给后续工作增加难度，也增加了生产成本和能源浪费。
2.2.2提取时间对粗多糖提取率的影响
表5提取时间对粗多糖得率的影响
时间（h）
吸光度（A）
平均吸光度（A）
总糖含量（μg）
多糖提取率（%）
干膏质量（g）
1
0.865
0.865
0.836
0.855
15.350
1.921
0.6256
2
1.069
1.071
1.082
1.077
19.314
2.463
0.6375
3
0.81
0.81
0.8
0.807
14.493
2.738
0.9445
4
0.871
0.871
0.861
0.868
15.582
2.132
0.6840
5
0.621
0.615
0.604
0.613
11.029
1.694
0.7682
6
0.825
0.826
0.824
0.825
14.814
2.364
0.7979
图3提取时间对多糖得率的影响
由表5和图3数据可知，当提取时间逐渐增加时，多糖提取率逐渐升高，从1.921%上升至2.738%，升幅为29.84%，提取时间为3h时，短柄五加果实多糖提取率最高（18.89%），其后，随提取时间的增加，到5h时，多糖提取率逐渐减小从2.738%降至1.694%，降幅为38.13%，但到6h提取率突然升高。
以上结果表明：
随提取时间逐渐增加，短柄五加果实多糖提取率总的呈先增加后减少的趋势。
因为提取初期溶剂多糖浓度低，而原料中多糖含量高，两体系有较高浓度差，传质推动力大，所以多糖浸出速率快，多糖浓度逐渐升高，之后两个体系浓度差减小，传质推动力降低，多糖浸出速率减缓。
2.2.3提取温度对粗多糖提取率的影响
表6提取温度对粗多糖提取率的影响
温度（℃）
吸光值（A）
多糖含量（μg）
浸膏质量（g）
多糖提取率（%）
60
0.43
7.761
0.635
0.986
70
0.811
14.564
0.634
1.847
80
0.871
15.636
1.015
3.174
90
0.36
6.511
0.680
0.885
100
0.327
5.921
0.910
1.078
图4温度对多糖提取率的影响
图4和表6数据可知，当提取温度逐渐升高，多糖提取率逐渐升高，从0.986%升至3.174%，升幅为68.94%；当提取温度为80℃时，多糖提取率最高（18.52%）；其后随提取温度增加多糖含量逐渐降低，从3.174%降至1.078%，降幅为66.04%，以上结果表明：
随提取温度逐渐增加，短柄五加果实多糖提取率呈先增加后减少的趋势。
一般来说，温度升高分子运动加剧，溶解速度随之加快，同时高温引起细胞膜破裂，使多糖能够很快由样品细胞转移至溶剂中。
因此，随着温度升高，多糖提取率增加，但由于多糖为热不稳定物质，温度升高多糖被破坏而导致提取率不加。
2.2.5pH对粗多糖提取率的影响
表7pH对粗多糖提取率的影响
pH
吸光值（A）
多糖含量（μg）
干膏质量（g）
多糖提取率（%）
6
0.282
5.118
0.675
0.691
7
0.5905
10.627
0.168
0.357
8
0.317
5.743
0.074
0.085
图5pH对多糖提取率的影响
由图5和表7数据可知，当提取pH逐渐增加时，多糖提取率逐渐降低，从0.691%降至0.085%，降幅为48.34%。
由此确定最佳提取pH是7。
以上结果表明：
随着提取pH逐渐增加，短柄五加果实多糖提取率呈逐渐降低的趋势。
因为溶液pH值升高，多糖发生了碱水解。
2.2.6正交实验确定最佳提取工艺
表8正交实验结果表
试验号
A时间
（min）
B温度
（℃）
C（pH）
D料液比
多糖提取率（%）
1
45
70
8
1:
30
0.346
2
60
70
6
1:
25
0.279
3
75
70
7
1:
35
0.465
4
45
80
7
1:
25
0.289
5
60
80
8
1:
35
0.337
6
75
80
6
1:
30
0.470
7
45
90
6
1;35
0.296
8
60
90
7
1:
30
0.236
9
75
90
8
1:
25
0.362
K1
0.931
1.09
1.111
0.93
K2
0.852
1.096
0.99
1.052
K3
1.297
0.894
1.045
1.098
k1
0.310
0.363
0.370
0.31
k2
0.284
0.365
0.33
0.351
k3
0.432
0.298
0.348
0.366
R
0.148
0.067
0.04
0.056
最有水平
A3
B2
C1
D3
最优组合
A>B>D>CA3B2C1D3
表9正交实验结果
序号
平均OD值（A）
干膏质量（g）
多糖含量（μg）
多糖提取率（%）
1
0.222
0.428
4.046
0.346
2
0.299
0.258
5.421
0.279
3
0.468
0.276
8.439
0.465
4
0.237
0.335
4.314
0.289
5
0.235
0.393
4.279
0.337
6
0.315
0.411
5.707
0.470
7
0.256
0.319
4.648
0.296
8
0.268
0.242
4.874
0.236
9
0.244
0.408
4.439
0.362
根据正交实验结果短柄五加果实多糖提取的最佳工艺条件为：
料液比1:
35（W/V）、提取温度80℃、提取时间75min、pH6.0提取1次得到多糖样品提取率为4.243%
表10提取次数对多糖含量的影响
提取次数
质量
紫外OD值
多糖含量
多糖提取率（%）
1
0.675
0.233
4.243
4.243
2
0.168
0.119
2.207
2.207
3
0.074
0.136
2.511
2.511
图6提取次数对多糖提取率的影响
由上图和数据可知，当提取次数逐渐增加，多糖提取率逐渐降低，从4.243%降到2.511%，降幅为40.82%。
随着提取次数增加，提取液多糖浓度逐渐增强，到1次以后的增加量已经很少，但是在多糖溶出的同时，杂质也在不断溶出，所以确定最佳提取次数为1次。
综合以上最优工艺条件下得到多糖提取率为4.243%
2.3五加多糖除蛋白工艺：
2.3.1Severg法
表11Severge试剂脱蛋白
提取次数
260nm吸光值（A）
280nm吸光值（A）
原液的蛋白含量（mg/ml）
1
1.054
1.041
14.560
2
1.050
1.021
14.070
3
1.046
0.995
13.374
4
0.961
0.954
13.443
5
0.921
0.916
12.933
6
0.891
0.894
12.739
7
0.889
0.891
12.682
图7Severg试剂不同萃取次数对多糖溶液中蛋白质含量的影响
表12Severg试剂不同提取次数对多糖含量的影响
萃取次数
多糖吸光值（A）
多糖含量（ug/ml）
1
0.296
11.774
2
0.399
15.466
3
0.364
14.211
4
0.353
13.817
5
0.281
11.237
6
0.267
10.735
7
0.293
11.667
图8Severg试剂不同提取次数对多糖含量的影响
从以上数据可知，随着severg试剂萃取次数的逐渐增加，提取液中蛋白质含量逐渐降低，从萃取1时的提取液蛋白浓度为14.560μg/ml，到7次萃取后提取液蛋白质浓度为12.682μg/ml，当萃取到5次的时候，提取液蛋白质浓度降低幅度变缓，从萃取次数对多糖含量影响可以看出，当萃取到5次时，多糖含量降幅变缓，因此萃取5次为最佳萃取次数。
从萃取第1次时，多糖含量为11.774μg/ml，到萃取2次时，多糖含量为15.466μg/ml，这主要是因为severg试剂萃取后，多糖提取液总体积减少，从而使多糖浓度升高所致。
2.3.2三氯乙酸法
不同浓度的三氯乙酸对粗多糖除蛋白的影响
表13不同浓度三氯乙酸对粗多糖溶液中蛋白质含量的影响
浓度
吸光值（260nm）
吸光值（280nm）
蛋白质含量（μg/ml）
0%
0.782
0.707
8.930
1%
0.559
0.517
6.720
3%
0.522
0.500
6.774
5%
0.460
0.435
5.807
7%
0.456
0.430
5.721
10%
0.479
0.443
5.758
15%
0.580
0.516
6.380
图9三氯乙酸不同浓度对蛋白含量影响
表14三氯乙酸不同浓度对多糖含量的影响
浓度
多糖吸光值（A）
多糖含量（ug/ml）
0%
0.600
453.405
1%
0.092
89.247
3%
0.091
88.530
5%
0.079
79.928
7%
0.073
75.627
10%
0.073
75.627
15%
0.073
75.627
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