不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响.docx

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不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响

博士学位论文

新型猪用复合益生菌制剂的研制与开发

陆克文

指导教师

姜平教授

专业学位

兽医博士

研究领域

预防兽医

答辩日期

二○一一年十二月四日

DEVELOPMENTOFNEWCOMBINEDPROBIOTICSPRAEPARATUMUSEDINSWINE

By

LUKe-wen

Supervisor:

Prof.JiangPing

ADissertation

SubmittedtoNanjingAgriculturalUniversity

InPartialFulfillmentoftheRequirements

For

DoctorofProfessionalDegreein

VeterinaryMedicine

CompletedinOctober,2011

CommencementinDecember,2011

原创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。

对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者（需亲笔）签名：

年月日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。

保密□，在年解密后适用本授权书。

本学位论文属于不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者（需亲笔）签名：

年月日

导师（需亲笔）签名：

年月日

目录

摘要I

ABSTRACTV

符号及缩略语说明VII

前言VII

第一篇文献综述7

第一章益生菌制剂概述7

1益生菌制剂的定义7

2益生菌制剂的种类7

2.1按制品剂型7

2.2按制品所含有效微生物种类多少的不同7

2.3按制品使用目的7

2.4按微生物的菌种类型7

3饲料用益生菌的种类7

4常用菌及其功能特点7

4.1乳酸菌7

4.2芽孢杆菌7

4.3酵母菌7

参考文献7

第二章益生菌制剂的作用机制及生产工艺7

1益生菌制剂的作用机制7

1.1维持肠道微生态平衡（优势菌群学说）7

1.2生物夺氧7

1.3生物拮抗作用7

1.4增强机体的免疫功能7

1.5合成消化酶，促进营养物质的消化吸收7

1.6改善肠道内环境，减少氨、胺等有害物质的产生7

2影响益生菌制剂作用效果的因素7

2.1菌种本身的特性是发挥其效能的关键因素7

2.2宿主因素7

2.3生产条件及产品剂型7

2.4使用方法、使用剂量缺乏评价标准等因素7

3益生菌制剂的生产工艺及注意事项7

3.1益生菌制剂生产工艺研究7

3.2饲用复合益生菌制剂的生产工艺7

3.3益生菌制剂应用的注意事项7

参考文献7

第三章益生菌制剂在养猪生产中的应用7

1胃肠道益生菌系统7

2益生菌制剂在养猪生产中的应用7

2.1益生菌制剂在仔猪生产中的应用7

2.2益生菌制剂在生长肥育猪中的应用7

2.3益生菌制剂在母猪生产中的应用7

参考文献7

第四章饲用益生菌制剂的研究进展、问题及研究前景7

1国内外饲用益生菌制剂的研究进展7

2益生菌制剂在研究应用过程中存在的问题7

2.1益生菌安全性问题[10]7

2.2菌型单一活菌含量低7

2.3水分含量偏高、对胃酸和高浓度的胆盐不稳定7

2.4不耐抗生素7

3益生菌制剂的应用前景7

参考文献7

第二篇试验研究7

第五章猪源益生乳酸菌的分离鉴定7

1材料与方法7

1.1样本采集7

1.2培养基7

1.3猪源益生菌的分离和纯化7

1.4分离菌的鉴定7

2结果与分析7

2.1猪源乳酸菌的分离与鉴定7

2.2分子鉴定结果7

3讨论7

3.1乳酸菌的分离7

3.2细菌的自动微生物检测7

3.3细菌的分子鉴定7

参考文献7

第六章猪源乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体外抑制致病性大肠杆菌作用研究7

1材料与方法7

1.1菌株7

1.2耐酸试验7

1.3耐胆盐试验7

1.4产酸试验7

1.5抑菌能力试验7

1.6抑菌机理试验7

2结果与分析7

2.1耐酸试验与耐胆盐试验7

2.2产酸试验7

2.3抑菌能力试验7

2.4菌液、发酵滤液和菌体的抑菌效果7

2.5用碱处理发酵滤液对抑菌效果的影响7

2.6用乳酸脱氢酶处理发酵滤液对抑菌效果的影响7

3讨论7

3.1乳酸菌对酸耐受性的影响7

3.2乳酸菌对胆盐耐受性的影响7

3.3乳酸菌抑制致病性大肠杆菌的效果7

3.4乳酸菌抑制致病性大肠杆菌的机理7

参考文献7

第七章不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响7

1材料与方法7

1.1试验动物及其处理7

1.2饲养管理7

1.3采样7

1.4仔猪生长性能指标测定及腹泻频率的计算7

1.5仔猪抗氧化能力指标的测定7

1.6数据处理7

2结果7

2.1不同复合益生菌制剂对仔猪生长性能及腹泻率的影响7

2.2不同复合益生菌制剂对仔猪全血中GPX-PX活性的影响7

2.3不同复合益生菌制剂对仔猪血清中SOD活性的影响7

2.4不同复合益生菌制剂对仔猪血清MDA含量的影响7

3讨论7

参考文献7

第八章不同复合益生菌制剂对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响7

1材料与方法7

1.1试验动物及其处理7

1.2饲养管理7

1.3采样7

1.4仔猪肠道主要菌群的分布7

1.5MTT法测定ConA非特异性刺激T淋巴细胞增殖7

1.6血清细胞因子IL-2和TNF-α含量的测定7

1.7数据处理7

2结果7

2.1仔猪粪便中大肠杆菌计数7

2.2仔猪粪便中乳酸杆菌计数7

2.3T淋巴细胞增殖试验结果7

2.4血清细胞因子IL-2含量测定7

2.5血清细胞因子TNF-α含量测定7

3讨论7

参考文献7

第九章复合益生菌制剂发酵条件的优化7

1材料与方法7

1.1材料7

1.2方法7

1.3数据统计分析7

2结果7

2.1共生实验7

2.2在不同种类培养基上复合益生菌的生长状况7

2.3豆粉与面粉配比筛选7

2.4复合益生菌发酵工艺条件优化结果7

3讨论7

参考文献7

第十章猪源复合益生菌制剂在江苏地区猪场使用的案例报告7

全文结论7

本文创新点7

攻读博士学位期间发表论文和专利7

致谢7

新型猪用复合益生菌制剂的研制与开发

摘要

益生菌制剂以其无毒、无耐药性、无残留以及效果显著、成本低、能有效补充消化道内的有益微生物等诸多优点，已成为了理想的抗生素替代品而被广泛应用。

近来的研究表明，高活菌制剂的功效和安全性，其关键则是生产菌株的选择；另外多菌种混合剂型的研究也显得非常重要。

本论文通过从猪的粪便中分离鉴定益生菌，进行乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体外抑制致病性大肠杆菌试验，研究不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能、抗氧化能力、肠道菌群以及免疫功能等的影响，最后研究复合益生菌制剂的发酵工艺，对为实现其产品的产业化，推动饲料添加剂产品向高效、无公害的方向发展，实现畜产品的绿色化具有重要的应用意义。

各试验的研究内容如下：

试验1猪源益生乳酸菌的分离鉴定

从健康猪的20份新鲜粪便中分离到一定范围的乳酸菌共37株。

应用常规形态学、生化鉴定（自动细菌检测仪）和分子鉴定方法进行鉴定。

结果表明：

分离到的37株乳酸菌包括3株嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）、5株罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）、5株动物乳杆菌（L.animalis）、4株鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）、3株肠膜样明串珠菌（L.mesenteroides）、3株格氏乳球菌（L.garvieae）、3株乳酸乳球菌乳酸亚种（L.subsp.lactis）、2株嗜热链球菌（S.thermophilus）、5株屎肠球菌（E.faeciμm）和4株粪肠球菌（E.faecalis）。

这一结果为新型猪用复合微生态制剂的研制与开发提供了基础条件。

试验2猪源乳酸菌耐酸、耐胆盐试验与体外抑制致病性大肠杆菌作用研究

对从健康仔猪新鲜粪便分离的12株乳酸菌菌株进行耐酸试验和耐胆盐试验，筛选出4株有效菌株。

分别将这4株乳酸菌单独、混合与K88共培养；取4种乳酸菌单独和混合培养的菌液、发酵滤液和菌体用牛津杯做K88抑制试验；分别将培养滤液经过乳酸脱氢酶和碱处理做K88抑制试验。

结果表明：

4种乳酸菌皆具有抑菌功能，但相互之间有差异；用乳酸脱氢酶或碱处理后抑菌能力明显下降，说明乳酸菌是通过产生有机酸尤其是乳酸对K88进行有效抑制。

4种菌混合培养的抑菌能力强于单独培养。

试验3不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响

为了研究不同复合益生菌制剂对断奶仔猪生产性能及抗氧化能力的影响，选取4周龄健康杜×长×大三元杂交断奶仔猪60头，随机分成5组，每组3个重复，每个重复4头。

A组为饲喂基础日粮的对照组，B组为饲喂基础日粮加市售的某公司生产的猪用益生菌制剂组，C、D、E组为基础日粮分别加3种不同的自制复合益生菌产品试验组。

试验结果表明，添加C组、D组、E组益生菌制剂能显著改善仔猪的生长性能，提高断奶仔猪的日增重和饲料转化效率，其中试验组C组仔猪日增重与对照组相比提高18.03%（P＜0.05），料肉比下降了8.86%（P＜0.01），试验组D组仔猪日增重提高16.52%（P＜0.05），料肉比下降了8.12%（P＜0.05），试验组E组仔猪日增重提高15.34%（P＜0.05），料肉比下降了7.75%（P＜0.05）；添加C组、D组、E组益生菌制剂能显著改善仔猪全血中的GSH-PX的活性和血清中SOD的活性，显著降低血清中的MDA含量，说明提高了断奶仔猪的抗氧化能力，其中C组、D组效果较好。

试验4不同复合益生菌制剂对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响

为了研究益生菌对断奶仔猪肠道菌群及免疫功能的影响，选取4周龄健康杜×长×大三元杂交断奶仔猪60头，随机分成5组，每组3个重复，每个重复4头。

A组为饲喂基础日粮的对照组，B组为饲喂基础日粮加市售的某公司生产的猪用益生菌制剂组，C、D、E组为基础日粮分别加3种不同的自制复合益生菌产品试验组。

试验结果表明，添加益生菌的各试验组粪便中大肠杆菌的含量降低，乳酸菌的含量增加，显示了其对大肠杆菌等肠道致病菌有良好的抑制作用；在提高动物机体免疫力方面，C组、D组益生菌制剂能促进ConA非特异性刺激外周血液T淋巴细胞的转化，C组、D组T淋巴细胞转化水平分别提高了20.4%和17.53%（p<0.05），C组、D组、E组益生菌制剂还能有效提高仔猪血清中的细胞因子IL-2和TNF-α水平。

试验5复合益生菌制剂发酵条件的优化

本实验通过将4株益生菌单独和混合培养，测定各株益生菌的活菌数来评价了4株益生菌的共生关系；比较了复合益生菌在YEPD、MRS、麦芽汁和豆面粉培养基上的生长状况，筛选出了可用于工业化生产复合益生菌制剂的培养基；并对该培养基中豆面粉比例作了优化，筛选出最佳搭配比例；同时通过单因子试验和正交试验对复合益生菌制剂工业化生产的工艺条件作了优化，确定了最优的生产条件。

结果表明4株益生菌能较好的共生；豆面粉培养基为工业化生产复合益生菌制剂较为适宜的培养基；该培养基中豆面粉最适比例为2%：

8%；最佳的工业化生产条件为：

发酵时间32h，接种量5%，发酵温度34℃，恒定pH6.0，溶氧DO40%。

在上述最优培养条件下，4株益生菌活菌数均达到108CFU/mL以上。

关键词：

益生菌；乳酸菌；生产性能；抗氧化；免疫功能；断奶仔猪

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ABSTRACT

Probioticspraeparatumhasbecometheidealalternativesforantibioticandbeenwidelyapplied,withtheseriesadvantagesofnon-toxic,notolerance,noresidual,obviouseffect,lowcost,andwhichcanofferaeffectivesupplementofbeneficialmicroorganismindigestivetract.Recentresearchesshowedthatthekeyfortheefficacyandsafetyofhighlyactivefungus-preparationiswastheselectionofproducingstrain;Inaddition,thestudyofmulti-strainsmixturealsoappearsveryimportant.Basedonthepreviousresearch,studyontheisolationandidentificationofprobioticsfrompigmanure,theacidandbiletoleranceexperimentandinvitroinhibitionforpathogenicescherichiacoli,theinfluenceofvariouscomplex-probiotic-preparationontheperformance,antioxidantcapacity,intestinalfloraandimmunefunction,andthefermentationtechnologyofcomplex-probiotic-preparation,haspracticalsignificancefortheindustrializationofproducts,thedevelopmenttohighefficiencyandnon-pablichazardbio-feedadditives,andthegreenrevolutionofanimalproducts.Thecontentsofeachexperimentareasfollows:

Experiment1Isolationandidentificationofpigoriginlactobacillus

37strainslactobacilluswereisolatedfrom20portionfreshstoolbyhealthyswine.Conventionalmorphology,biochemicalidentificationandmolecularidentificationwereappliedtocharacterize.Results:

37strainsseparatedlactobacilluscontained3strainsLactobacillusacidophilus（L.acidophilus）,5strainsLactobacillusreuteri（L.reuteri）,5strainsLactobacillusanimalis（L.animalis）,4strainsLactobacillusrhamnosus（L.rhamnosus）,3strainsLactobacillusmesenteroides（L.mesenteroides）,3strainsLactobacillusgarvieae（L.garvieae）,3strainsLactobacillussubsp.lactis（L.subsp.lactis）,2strainsStreptococcusthermophilus（S.thermophilus）,5strainsEnterococcusfaeciμm（E.faeciμm）and4strainsEnterococcusfaecalis（E.faecalis）,whichprovidedabasicconditionfortheresearchanddevelopmentofthecombinedmicroecologypraeparatumonswine.

Experiment2Studyontheacidandbiletoleranceexperimentforpigoriginlactobacillusandtheeffectofinvitroinhibitionforpathogenicescherichiacoli

12strainslactobacillusseparatedfromhealthypigletintestinewereappliedfortheacidandbiletoleranceexperiment,and4availablebacteriumstrainswerescreenedtoculturetogetherwithK88aloneandincombination;bacterialliquid,fermentationfiltrateandthallusfromculture4strainslactobacillustogetherwithK88aloneandmixedwereappliedfortheK88inhibitiontestbythemethodofOxfordCup;culturefiltratewereappliedfortheK88inhibitiontestbythetreatmentoflactatedehydrogenaseandalkali.Results:

allthe4strainslactobacillusownedtheantibacterialabilitybutstillhadadifferencebetweenthem;theantibacterialabilitydecreasedsignificantlywhentreatedbylactatedehydrogenaseandalkali,whichindicatedthatlactobacillusownedtheantibacterialabilitythroughprovidedorganicacidsespeciallylacticacid.Theantibacterialabilityfor4strainslactobacilluswouldbeenhancedwhenmixedcultureratherthansolitaryculture.

Experiment3Effectsofprobioticsongrowthperformanceandanti-oxidationofweanedpiglets

Thistrialwasconductedtostudytheeffectofprobioticsontheintestinalfloraandimmunityofweanedpiglets.60Duroc×（Landrace×Largewhite）weanedpiglets（28d）wererandomlydividedinto5groupswith3replicationspertreatmentand4weanedpigletsperreplication,normalcontrolgroup（Agroup）whichfedwithabasaldiet,probioticsgroup（Bgroup）whichfedwithabasaldietaddedprobioticproductsfromacompany,andcomplex-probioticgroups（C,D,Egroups）whichfedwithabasaldietadded3differentself-madecomplex-probiotic-preparation.ResultsindicatedthatgroupC,D,Ecouldsignificantlyimprovetheperformanceofpigletsandtheaveragedailygain（ADG）andfeedtogainratio（F/G）ofweanedpiglets.ADGingroupCappeared18.03%（P＜0.05）higherandF/Gappeared8.86%（P＜0.01）lowerwhencomparedwithcontrolgroup.ADGingroupDappeared16.52%（P＜0.05）higherandF/Gappeared8.12%（P＜0.05）lowerwhencomparedwithcontrolgroup.ADGingroupEappeared15.34%（P＜0.05）higherandF/Gappeared7.75%（P＜0.05）lowerwhencomparedwithcontrolgroup.SupplementofprobioticingroupC,D,EcouldalsosignificantlyincreasetheactivityofSODinser