色氨酸发酵工艺原理及工业生产.docx

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色氨酸发酵工艺原理及工业生产

湖北大学

发酵工程与设备课程设计

题目色氨酸发酵工艺

专业年级08生物工程

学生姓名赵雄峰

学号****************

指导老师李亚东

2011年6月4日

1前言------------------------------------------------3

2发酵机制--------------------------------------------6

3发酵工艺及特点--------------------------------------7

4菌种的制备及种子的扩大培养--------------------------9

5培养基的组成及制备----------------------------------12

6无菌空气制备系统-----------------------------------13

7部分工艺计算----------------------------------------15

8三废处理--------------------------------------------17

9参考文献---------------------------------------------18

一.前言

L-色氨酸是种重要的氨基酸,广泛应用于医药、食品和饲料等行业。

近年来,各行业对L-色氨酸的需求量日益增加,而现有产量远不能满足国内外市场的需求。

因此,开发微生物酶法生产L-色氨酸的工艺路线具有广阔的应用前景。

目前我国市场上销售的[色氨酸主要依靠进口，我国国务院已于2004、2007年将I色氨酸生产列入"鼓励外商投资产业目录"之中。

直接发酵法生产[色氨酸的研究，对发展我国氨基酸发酵工业具有重大的意义。

本文对发酵液中色氨酸的快速测定、出发菌株的生理特征和产酸特性、I色氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化进行了重点研究。

1.1色氨酸的理化性质

色氨酸属于中性芳香族氨基酸，结构中含有吲哚基，在生物体中，色氨酸以结

合态或游离态存在。

其结构式如图1-1所示：

色氨酸是手性化合物，有[型和0型两种镜像结构。

[色氨酸是人体必须氨基酸，它参与人体与动物的蛋白质合成和代谢网络调节，并广泛的存在于自然界中；0-色氨酸不能合成蛋白质，在人体内几乎不发生代谢作用。

L-色氨酸化学名为L-2-氨基-3-吲哚基丙酸，别名为L-氨基吲哚丙酸、胰化蛋白氨基酸。

其分子式为C11H12O2N2，相对分子量为204.21，熔点为289℃，等电点PI为5.89，pKa（25℃）为2.38及9.39，微苦、呈绢丝光泽六角片状白色结晶，在水中溶解度1.147％（25℃）2.80％（75℃）,微溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿，在碱液中稳定，在强酸中易分解。

1.2L-色氨酸的用途

L-色氨酸在生物体内不能自然合成，需要从食物中摄取，是动物和一些真菌生命活动中的必须氨基酸。

L-色氨酸在蛋白质中含量很低，平均含量约1％或更少。

L-色氨酸能调节蛋白质的合成、调节免疫及消化功能，增加5-羟色胺代谢作用以及增强认知能力等，因此在人和动物的新陈代谢、生长发育中有重要作用L-色氨酸的这些营养和药用价值使其被广泛应用于医药、饲料和食品等行业。

1.2.1色氨酸在医学上的应用

在生物体内L-色氨酸是合成生理活性物质及某些激素的前体物（如烟酸、5-羟色胺、色素、吲哚乙酸、辅酶和生物碱等）。

这些生理活性物质和激素会参与生物体多种生命活动。

例如，吲哚乙酸可以调节植物生长；5-羟色胺是动物的一种神经递质，它可以调节祌经的抑制和兴奋状态、调节血管的收縮，具有抗抑郁、抗高血压、镇痛、促进睡眠等功能；褪黑素可以调节动物毛发生长及性成熟等多种生物节律，并可以选择性影响大脑内不同结构5-羟色胺代谢。

吲哚生物碱中的长春碱和长春新碱被广泛的用作抗癌性药物。

由于众多代谢途径中涉及到L-色氨酸，所以色氨酸和它的代谢产物在调节胃口、睡眠与清醒节奏和疼痛知觉等神经行为上起着重要作用，从而使其在医药领域的用途成为医学界的研究热门。

L-色氨酸代谢功能失调，可引起神经系统的功能障碍。

L-色氨酸常常被用作复合氨基酸制剂和氨基酸注射液，用来改善睡眠效果、消除精神紧张、预防、治疗嗜酸细胞增多性肌痛综合症和粗糙病等。

到目前为止，L-色氨酸作为治疗精神分裂症、髙血压、抑郁症、癩皮病和镇痛等用途已经得到很好的认可。

L-色氨酸还可以与维生素、铁剂等合用提高抗贫血疗效，或与组氨酸合用防治消化道溃疡等。

1.2.2色氨酸在食品和词料添加剂中的应用

由于植物蛋白中比较缺乏L-色氨酸，所以可用L-色氨酸做食品或词料添加剂，使植物蛋白质的利用率得以提高。

我国农业部已经将L-色氨酸确认为六种饲料级氨基酸之一，使得L-色氨酸成为继赖氨酸、蛋氨酸之后的第三大饲料添加用氨基酸。

L-色氨酸可以调节畜禽生产性能、釆食量以及饲料转化率；减少肝脏中脂肪的积累量、提高蛋白质合成率从而增加畜禽的瘦肉比例；减轻应激反应从而减少畜禽攻击行为；还可以转化为尼克酰胺促进畜禽生长并预防尼克酰胺缺乏症的出现〔等。

因此，在动物饲料中添加L-色氨酸，对动物的生长和健康起着重大的作用。

在食品方面，L-色氨酸可被用于水解蛋白质和酶解明胶制剂的营养强化剂。

L-色氨酸具有抗氧化作用，可以作为防腐剂防止奶粉变质；或是作为鱼类保鲜剂，用以阻止氧化发生，防止蛋白质分解、发霉等。

1.3色氨酸的生产方法

1.31水解法

废蚕丝、毛发和血粉等蛋白质原料含有相对相对丰富的L-色氨酸，可以通过酶水解或碱水解法来提取L-色氨酸。

由于蛋白质中色氨酸的含量不是很高、材料来源有限、生产周期较长、工艺及产品成分复杂等缺点，现在已经很少使用水解法来生产色氨酸.

1.3.2微生物法

1.3.2.1酶促转化法

酶促转化法是以廉价碳源来培养微生物，利用微生物产生的[色氨酸合成酶系转化前体合成1色氨酸的方法。

该法需要解除生物合成途径中相关酶所受到的反馈调节，使这些酶大量合成，才能使[色氨酸得以高浓度积累。

由于所添加的前体物大多对微生物生长有抑制作用，因此筛选前体物抗性突变株往往有利于提高前体物的添加量。

此外，采用分批少量添加前体物的方式也可以减轻高浓度前体物对微生物生长的抑制

酶促转化法的前体物可以通过化工来合成，从而能够利用有机合成技术优势。

该法产物浓度、纯度以及收率都较髙，同时反应周期短、分离提纯容易，副产物少，使得该法生产成本较低，是L-色氨酸的生产中较为广泛采用的一种方法。

在氨基酸生产大国日本，几家大公司如三乐、三井东压、味之素和三菱油化等均采用酶促转化法生产L-色氨酸.酶促转化法生产L-氨酸也有自身的缺点：

色氨酸合成酶会受到底物吲哚的强烈抑制，甚至会完全失活；底物L-酸价格较高；吲哚水溶性较差，转化率不高.

1.3.2.2直接发酵法

直接发酵法是指利用[L-色氨酸高产菌种，采用葡萄糖等廉价碳源做原料，控制在合适的发酵条件，直接发酵积累L-色氨酸。

由于L-色氨酸的生物合成途径的代谢流比较微弱，再加上L-色氨酸的合成需要多种前体物的供给（如[丝氨酸、磷酸核糖焦磷酸、L-谷氨酰胺等、只有提高这些前体物的量，才能有效的提高L-色氨酸产量，使得该法很长时间内不能达到工业化要求。

此外，L-色氨酸生物合成途径中存在这较为复杂的调节机制，弱化子系统以及多重反馈调节的存在使得L-色氨酸的发酵生产成为氨基酸发酵工业中的一大难题。

从自然界中分离到可以大量积累L-色氨酸的菌株的可能性极小，因此L-色氨酸高产菌种的选育是直接发酵法成功的关键。

直接发酵法几乎全是使用细菌的突变菌株。

不同技术分离得到的突变株主要是芳香族缺陷型或抗代谢突变株。

国内外对L-色氨酸生产菌株的诱变育种进行了大量的研究。

1.4论文的主要研究内容

L-色氨酸的发酵机制，发酵工艺及特点，菌种的制备及种子的扩大培养，，培养基的组成及制备，无菌空气制备系统，部分工艺计算以及三废处理。

正文部分

一.L-色氨酸发酵机制

谷氨酸棒杆菌中芳香族氨基酸的生物合成途径及其代谢调节机制如图1-2所示。

其中，在第一个在分支处倾向于邻氨基苯甲酸的优先合成；在第二个分支处倾向于对羟基苯丙酮酸的优先合成。

图1-21色氨酸的生物合成及调节机制

二.发酵工艺及特点

L-色氨酸发酵工艺包括从菌种的筛选，种子的制备，培养基的选择，种子罐培养，发酵装置，无菌空气制备，产品的分离纯化，检测，包装以及销售等部分。

以下是发酵条件影响色氨酸产量的

以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，经过紫外线诱变和磺胺胍的抗性平板筛选，定向选育出1株遗传性状稳定的L-色氨酸高产菌株FC22其遗传标记为Phe-十Tyr-十5MT-十SG-通过发酵培养基与发酵条件的优化，确定了该菌株的最佳培养基组成为葡萄糖8％，硫酸铵2.5％，玉米浆干粉，5，5％，磷酸二氛钾0，25％，磷酸氢二钾0.25％，硫酸镁0.05％，最佳的发酵条件为：

培养基初始PH6，8〜7，0，发酵温度30℃，摇床转速260r/min在此条件下摇瓶发酵3d，突变株FC22产色氨酸最高可达8，6g/l，比原菌株提高了约110％。

三.菌种的制备及种子的扩大培养

通过微生物直接发酵的方法过量生产L-色氨酸，必须打破芳香族氨基酸共同合成途径和L-色氨酸分支途径的特定代谢调节机制。

可以选取枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌等做出发菌株，通过定向选育，使这些突变株从遗传角度解除芳香族氨基酸合成途径和L-色氨酸分支途径的正常代谢调节机制，从而过量的积累L-色氨酸。

总的来说，高产L-色氨酸菌株的获得需要通过传统育种和重组L-入技术，逐级的积累菌株有利的遗传和表型特征。

选育缺陷型菌株

合适的缺陷型菌株有利于增加前体的积累，可以使碳源更多的流向芳香族途径和L-色氨酸分支途径，从而达到积累L-色氨酸的目的。

具体方法有：

选育有利于前体积累的菌株。

PEP和E4P是合成芳香族的共同前体，加强HMP途径有利于PEP和E4P的合成。

为了积累更多的PEP可以选育丧失丙酮酸激酶活力的突变株，或选育丧失磷酸烯醇式丙酬酸羧化酶活力的突变株，或选育丙酮酸羧化酶系辅酶硫胺素缺陷型菌株等。

为了积累更多的E4P，可以选育磷酸葡萄糖异构酶活力低的菌株。

选育切断其它支流代谢的菌株。

为了节约碳源，使中间产物分支酸更多地转向L-色氨酸的合成，可以切断由分支酸到COQ.VK.预苯酸的代谢支路。

支路的切断还可以解除L-酪氨酸、L-苯丙氨酸对合成途径中DAHP合成酶的反馈调节，使L-色氨酸得到进一步积累，因此可选育酪氨酸缺陷、L-苯丙氨酸缺陷、预苯酸缺陷、维生素K缺陷、COQ缺陷等突变株。

选育消耗L-色氨酸量少的菌株。

如选育色氨酸酶缺失突变株、色氨酸脱羧酶缺失突变株、色氨酰I皿合成酶缺失突变株以及不分解利用L-色氨酸的突变株等。

选育调节突变型菌株

选育L-色氨酸结构类似物的抗性突变株，可以解除其自身的反馈调节，使色氨酸得以积累。

L-色氨酸的结构类似物包括：

色氨酸氧肟酸盐、吲哚霉素、4-甲基色氨酸、6-甲基色氨酸、6-氟色氨酸、5-氟色氨酸以及5-甲基色氨酸等。

选育L-酪氨酸和L-苯丙氨酸结构类似物的抗性突变株，可以解除L-酪氨酸和L-苯丙氨酸对DS的反馈调节，有利于DAHP和分支酸的积累。

L-酪氨酸和L-苯丙氨酸的结构类似物包含：

肉桂酸、酪氨酸氧肟酸盐、苯丙氨酸氧肟酸盐、对氟苯丙氨酸、4-噻嗯基丙氨酸、3-氨基酪氨酸、对氨基苯丙氨酸和D-酪氨酸等。

选育磺胺胍抗性突变株有利于分支酸的积累。

分支酸可以与L-色氨酸竞争结合AS，降低L-色氨酸对AS的抑制，从而有利于L-色氨酸的积累。

种子的扩大培养

通过以谷氨酸棒杆菌FC22为出发菌株，经过紫外线诱变和磺胺胍的抗性平板筛选，定向选育出1株遗传性状稳定的L-色氨酸高产菌株FC22其遗传标记为Phe-十Tyr-十5MT-十SG-，再经过种子罐的发酵扩大培养以达到发酵所需的种子数量。

发酵设备以及过程见下图:

四.培养基的组成及制备

培养基

1、碳源：

淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烃

碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨基酸的转化率降低。

菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的发酵操作决定碳源种类

2、氮源：

铵盐、尿素、氨水；

同时调整pH值。

营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液。

需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源。

尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌。

可分批流加。

氨水用pH自动控制连续流加

3、合适C/N

氮源用于调整pH。

合成菌体

生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的C/N高

4、磷酸盐：

对发酵有显著影响。

不足时糖代谢受抑制。

5、镁：

是已糖磷酸化酶、柠檬酸脱氢酶和羧化酶的激活剂，并促进葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力。

6、钾：

促进糖代谢。

谷氨酸产酸期钾多利于产酸，钾少利于菌体生长。

7、钠：

调节渗透压作用，一般在调节pH值时加入。

8、锰：

是许多酶的激活剂。

9、铁：

是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基的组成分，可促进谷氨酸产生菌的生长。

10、铜离子：

对氨基酸发酵有明显毒害作用。

生长因子：

生物素

作用：

影响细胞膜透性和代谢途径。

浓度：

过多促进菌体生长，氨基酸产量低。

过少菌体生长缓慢，发酵周期长。

与其它培养条件的关系：

氧供给不足，生物素过量时，发酵向其它途径转化。

种类：

玉米浆、麸皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜为来源。

pH对氨基酸发酵的影响及其控制

作用机理：

主要影响酶的活性和菌的代谢。

控制pH方法：

流加尿素和氨水

流加方式：

根据菌体生长、pH变化、糖耗情况和发酵阶段等因素决定。

控制：

（1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素，避免pH过高

（2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些，以抑制菌体生长。

（3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。

（4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。

温度对氨基酸发酵的影响及其控制

菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度是不同的。

菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖耗慢，周期长，酸产量低。

采取措施：

少量多次流加尿素，维持最适生长温度，减少风量等，促进菌体生长。

五.无菌空气制备系统

在发酵工业中，绝大多数是利用好气性微生物进行纯种培养，空气则是微生物生长和代谢必不可少的条件。

但空气中含有各种各样的微生物，这些微生物随着空气进入培养液，在适宜的条件下，它们会迅速大量繁殖，消耗大量的营养物质并产生各种代谢产物；干扰甚至破坏预定发酵的正常进行，使发酵产率下降，甚至彻底失败。

因此，无菌空气的制备就成为发酵工程中的一个重要环节。

空气净化的方法很多，但各种方法的除菌效果、设备条件和经济指标各不相同。

实际生产中所需的除菌程度根据发酵工艺要求而定，既要避免染茵，又要尽量简化除菌流程，以减少设备投资和正常运转的动力消耗。

合理选择除菌方法，决定除菌流程以及选用和设计满足生产需要的除菌设备等。

发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是深层过滤器和玻璃纤维过滤纸过滤器，所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有用玻璃纤维、焦炭和超细玻璃纤维、维尼龙等。

对不同的材料、不同规格、不同填充情况，都会得到不同的过滤效果。

空气溶胶的过滤除菌原理与通常的过滤原理不一样，一方面是由于空气溶胶中气体引力较小，且微粒很小，常见悬浮于空气中的微生物粒子在0．5~2μm之间，深层过滤所用的过滤介质----棉花的纤维直径一般为16~20μm，填充系数为8％时，棉花纤维所形成的孔隙为20~50μm；超细玻璃纤维滤板因纤维直径很小，为1~1．5μm，湿法抄制紧密度较大，所形成的网格孔隙为0．5~5μm。

微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流直线前进，使气流无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进。

这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击、重力沉降、阻拦、布朗扩散、静电吸引等作用而将微粒滞留在纤维表面上。

过滤除菌装置工艺流程

空气过滤除菌设备一般是把吸气口吸入的空气先进行压缩前过滤，然后进入空气压缩机。

从空气压缩机出来的空气（一般压力在0.2MPa以上，温度120~160°C），先冷却至适当温度（20~25°C）除去油和水，再加热至30~35°C，最后通过总空气过滤器和分过滤器（有的不用分过滤器）除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭菌空气。

在上述工艺过程中，各种设备系围绕两个目的：

一是提高压缩前空气的质量（洁净度）；另一个是去除压缩空气中所带的油和水。

六.工艺计算

1.1饲料级最终产品规格

纯度95±2%，白色或略带黄色叶片状结晶或粉末，水中溶解度1.l4g（25℃），溶于稀酸或稀碱，在碱液中较稳定，强酸中分解。

微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚。

1.2医药级产品规格

·       USPXXX

·       干燥品含量:

                                ≥98.5%

·       pH（1%水溶液）:

                            5.5-7.0

·       干燥损失（105°Cx3hours）:

               ≤0.3%

·       炽灼残渣:

                     ≤0.1%

2.市场

 容量：

80,000吨/年（2004）,每年以10％速度增长。

 市场价格：

22美元/公斤

3.技术指标

菌株和专有技术可从清华大学国际技术转移中心获得。

终浓度（效价）：

             35±3g/L

发酵时间：

               50±5hrs

收   率：

                     饲料级≥85%

药品级≥70%

糖酸转化率：

                         12-15%

色氨酸通过液体培养制得，在完成实验室培养后，接入生产发酵罐（例如容积150m3,工作容积112.5m3）。

控制搅拌及通风保持溶解氧的最佳量。

需要进行补料来控制工艺过程。

进行pH自动控制，发酵后，发酵液进入回收阶段。

4.发酵工艺参数表

发酵类型

补料分批发酵

发酵时间hr

50±5

间歇hr

12

周期hr

62±5

发酵容积m3

150

发酵终体积m3

112.5

最终产品量（kg）

3712.5

最终产品浓度[g/l]

33

糖酸转化率[%]

12-15

饲料级收率[%]

85

医药级收率[%]

70

最大通风（VVM）

1

通风（kWh/kg）

12

最大安装功率（kW/m3）

3-3.5

能量:

搅拌+冷却（kWh/kg）

20

蒸汽（kg/kg活性单位）

20

七.三废的处理

八.参考文献

1.色氨酸工厂发酵与分离工艺过程控制司晶星著

2.L-色氨酸生产技术及市场行情调研报告（2011版）（报告编号：

D7767）

3.现代工业发酵调控学第二版化学工业出版社储炬李友荣编著

4.发酵过程优化原理与技术化学工业出版社陈坚刘立明编著

5.微生物重要代谢产物--发酵生存与过程分析化学工业出版社陈坚堵国成编著

6.微生物工程技术原理化学工业出版社程殿林主编

7.发酵工程中国农业大学出版社李玉英编著

8.发酵产品工艺学化学工业出版社陶兴无主编江贤君副主编

9.发酵工程关键技术及其应用化学工业出版社欧阳平凯曹竹安等编

10.发酵过程优化原理与实践化学工业出版社陈坚著

11.新编生物工艺学俞俊棠唐孝宣等编

12.微生物工程工艺原理姚汝华周世水主编

13.生物工程设备梁世中主编

14.XX文库

15.XX图片（以上所有图片）