周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖与CTGF表达的影响及其介导通路研究.docx

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周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖与CTGF表达的影响及其介导通路研究

周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖与CTGF表达的影响及其介导通路研究

摘要

目的：

本实验采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜成纤维细胞（humanperiodontalligamentfibroblasts，hPDLFs）施加不同时间的周期性张应力，观察周期性张应力对hPDLFs增殖及CTGF表达的影响；通过检测添加JNK、p38MAPK、PI3K信号通路特异性抑制剂后hPDLFs表达CTGF的变化，明确各通路是否在周期性张应力诱导hPDLFs表达CTGF过程中起作用。

方法：

采用多通道细胞牵张应力加载系统，以hPDLFs为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型。

观察细胞形态特征，绘制生长曲线，为细胞力学加载实验准备实验细胞。

加力组分别给予周期性张应力刺激1h、6h、12h、24h，加载的幅度10%（每一个循环包括3s-stretch/3s-relaxation），频率0.1Hz（6cycles/分），并以未加力组为实验对照组。

应用CCK-8法（CellCountingKit-8）检测hPDLFs增殖的情况；应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的CTGF蛋白；应用荧光定量RT-PCR技术检测细胞CTGFmRNA的表达；应用Westernblot技术检测细胞CTGF蛋白的表达。

应用JNK信号通路特异性抑制剂SP600125、p38MAPK信号通路特异性抑制剂SB203580，PI3K信号通路特异性抑制剂LY294002预处理的细胞作为对照组，检测CTGF的表达。

结果：

体外培养获得了典型的且具有稳定增殖特征性的hPDLFs，适于对细胞进行力学加载实验。

加载周期性张应力组与对照组相比较，在1h细胞开始增殖，6h增殖比较明显，12h细胞增殖达高峰，24h增殖降低；加载周期性张应力组与对照组相比较，1h细胞表达CTGF增加、6小时表达明显增加，12h细胞表达CTGF最多、24h细胞表达CTGF下降。

加入JNK信号通路特异性抑制剂后，细胞表达CTGF下降；而加入p38MAPK信号通路、PI3K信号通路的特异性抑制剂后CTGF表达不变。

结论：

加载幅度10%，频率0.1Hz的周期性张应力可以诱导hPDLFs增殖并表达分泌CTGF。

在一定时间范围内，周期性张应力引起CTGFmRNA和蛋白水平时间依赖性升高；随着时间的延长，CTGF表达下降；

周期性张应力通过JNK通路的介导促进了hPDLFs对CTGF的表达。

关键词：

CTGF周期性张应力牙周膜成纤维细胞JNKp38MAPKPI3K

EffectofCyclicTensileStressonCellsProliferationandExpressionofCTGFinHumanPeriodontalLigamentFibroblastanditsMediatedPathway

Abstract

Objective:

ToobservetheeffectofcyclictensilestressoncellsproliferationandexpressionofCTGFinthehPDLFsbyimposingcyclictensilestressonhPDLFsinvitroatdifferenttimeswithmulti-channelcellstretchstressloadingsystem;ToclarifytheroleofJNK,p38,PI3KpathwayinthecyclictensilestressinducedexpressionofCTGFinhPDLFsbyusingspecificinhibitorsofJNK,p38andPI3K.

Methods:

1.Aninvitroculture-tensilestimulatemodelsofhPDLFswereestablishedbyusingamulti-channelcellstretchstressloadingsystem.Cellmorphologywasobservedandthegrowthcurvewasdrawn,topreparetheexperimentcellsformechanicalloadingexperiments.

2.Thecellsofstressapplicationgroupweregivenstimulationofcyclictensilestressfor1h,6h,12h,24h.Theloadingextentwassetfor10%（eachcycleincluded3s-stretch/3s-relaxation）,withfrequencyof0.1Hz（6cycles/min）.Thecontrolgroupwasnotgivenanystimulationasthesametime.ThecellsproliferationwasdeterminedbyCCK-8assay（CellCountingKit-8）.TheconcentrationsofCTGFintheculturesupernatantweremeasuredbycommerciallyavailableenzymelinkedimmunosorentassay（ELISA）kitsaccordingtomanufacturer’sinstructions.TheexpressionofCTGFmRNAwasdetectedbyreal-timeRT-PCR.TheproteinexpressionofCTGFwasdetectedbyWesternBlot.

3.Thecellsofstressapplicationfor12hweregivenSP600125,SB203580andLY294002,thespecificinhibitorsofJNK,p38,PI3Krespectivelyatthebeginning,theCTGFexpressionofwhichwascomparedwiththegroupsofnoneinhibitors.

Results:

1.ThehPDLFsproliferatedtypicallyandstablyinvitro,andcouldbebegivencyclictensilestress.

2.Comparedwiththecontrolgroup,hPDLFsofstressapplicationgroupsbegantoproliferateat1h,andproliferatedmanifestlyat6h,andproliferationreachedthepeakat12h,thenproliferationdecreasedat24h.Similarly,theexpressionofCTGFbegantoincreaseat1h,andincreasedmanifestlyat6h,andreachedthepeakat12h,thendecreasedat24h.

3.TheexpressionofCTGFreducedbyusingthespecificinhibitorsofJNK,whilethespecificinhibitorsofp38,PI3Khadnotthesameeffect.

Conclusion:

1.Cyclictensilestresswithextentof10%andfrequencyof0.1HzcaninducehPDLFsproliferationandCTGFexpression.

2.Inacertaintime,cyclictensilestresscaninduceatime-dependentincreaseinCTGFmRNAandproteinlevels.Alongwiththeextendingoftime,CTGFexpressiondecreases.

3.Cyclictensilestress-inducibleexpressionofCTGFinhPDLFsismediatedbyJNKpathway.

KeyWords:

CTGFCyclictensilestresshumanPeriodontalligamentfibroblast（hPDLFs）ProliferationJNKp38MAPKPI3K

略词一览表

目录

引言1

第一部分建立人牙周膜成纤维细胞体外培养-力学刺激模型4

1.1材料和方法4

1.2结果6

1.3讨论7

1.4结论10

第二部分周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖及CTGF表达的影响12

2.1材料和方法12

2.2结果17

2.3讨论17

2.4结论18

第三部分JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力介导的人牙周膜成纤维细胞表达CTGF过程中的作用19

3.1材料和方法19

3.2结果20

3.3讨论20

3.4结论21

参考文献24

综述27

攻读学位期间的研究成果38

附录39

致谢42

学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明43

周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖与CTGF表达的影响及其介导通路研究

博士生姓名：

张月

指导教师：

教授

指导小组：

袁晓教授

专业名称：

口腔临床医学

引言

牙周病是危害人类口腔健康的两大常见疾病之一。

在我国，牙周病的患病率明显高于龋病，而且随着年龄的增长，患病率和严重程度均逐渐增高。

然而牙周病的致病机制至今仍未完全解决，目前公认牙周病是多因素疾病[1]。

咬合创伤是加重牙周炎症的一个重要的局部促进因素，它在一定程度上可影响炎症扩散至牙周支持组织的途径和破坏的程度。

正常的咬合力对牙周支持组织是一种功能性的刺激，对于保持牙周支持组织的正常代谢和结构状态是必需的[2]。

咬合力增加时牙周支持组织发生适用性改建，如牙周膜增厚，牙周纤维束增多，牙槽骨密度增高，当咬合力过大超过牙周支持组织的承受能力时，可引起牙周组织损伤，如牙周纤维破坏，牙槽骨吸收，牙骨质破坏及再生停止，进而导致牙齿松动终将脱落，因此在牙周病的治疗过程中，消除咬合创伤是牙周病系统性治疗中的重要内容之一，是牙周组织炎症得到有效控制后，促进组织修复使牙齿趋于稳固的有效方法。

当牙齿受到力学刺激时，牙周组织所处的力学环境即发生变化[3]，牙周组织内的各种细胞对这种力学改变作出应激反应，发生形态和功能的改变，并通过细胞内、外一系列级联信号传导机制使牙周组织发生适应性改建。

人牙周膜成纤维细胞（humanperiodontalligamentfibroblasts，hPDLFs）是牙周膜中主要的感受性细胞和效应性细胞，它的主要功能是合成胶原，同时具有吞噬并经酶的水解而降解陈旧胶原纤维的能力。

在一生中，牙周膜成纤维细胞不断形成新的主纤维、牙骨质和牙槽骨，它是牙周组织改建及修复过程中的主要细胞。

成纤维细胞在适宜的周期性应力作用下，可发生增殖、迁移、分化和凋亡，引起牙周膜的适应性改建[4,5]，它对维护牙周组织的健康和发挥正常功能起着非常重要的作用。

机械力作用下的牙周组织处于复杂的力学环境中[6]，就成纤维细胞而言，在承受正压力的同时还将承受来自不同方向的张应力。

力学因素直接影响成纤维细胞的形态、功能、基因表达等一系列生理病理过程，参与包括牙周组织改建在内的诸多过程的发生和发展。

力学因素直接影响成纤维细胞的形态、功能、基因表达等一系列生理病理过程，参与包括牙周组织改建在内的诸多过程的发生和发展。

而目前对机械刺激的复杂调控机制研究十分有限，机械力如何被细胞感受并传递至细胞内，最终导致细胞发生一系列生物学效应的确切机制仍处于探索阶段。

结缔组织生长因子（connectivetissuegrowthfactor，CTGF）是一种潜在的并无处不在的分子量为38-kD的蛋白质，属于CCN家族，包括cyr61/cef10、CTGF/fisp、nov、elm1/wisp-1、rcop-1/wisp-2、wisp-3。

Bradham等[7]于1991年在应用血小板源性生长因子（plateteriviedgrowthfactor，PDGF）抗体筛选人脐静脉内皮细胞cDNA（互补脱氧核糖核酸）文库时第一次发现。

CTGF在人类多种组织器官中广泛表达，由于其具有促进细胞增殖、介导细胞粘附、刺激细胞迁移、促进血管生成、诱导细胞凋亡、调节细胞外基质基因的表达、促进软骨增生和骨骼发育等生物学功能，在生物学领域受到广泛关注[8,9]。

在病理情况下，其过度表达与某些增生性或纤维化疾病及肿瘤的发生发展密切相关，如硬皮病、肾纤维化、肝硬化、肺纤维化、动脉粥样硬化、多种组织恶性肿瘤等。

近年研究发现，CTGF在牙周组织分化、牙龈纤维性变、牙齿发育和拔牙后牙槽窝愈合以及正畸牙移动牙周改建中起到了重要作用。

丝裂素活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPK）信号转导途径是哺乳动物细胞中重要的信号通路，能将多种细胞外刺激产生的信号通过级联反应从细胞膜传递到细胞核内，在细胞分化、增殖、凋亡、应激、炎症以及免疫反应等多种生理和病理过程中发挥着极其重要的作用[10]。

其任一环节的异常都可能导致细胞的异常增殖与分化。

MAPK信号转导通路包括MAPK激酶激酶（MAPKkinasekinase，MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKkinase，MAPKK）、MAPK，此通路主要为三级酶联反应模式：

激活因子作用于MAPKKK使其首先被激活，MAPKKK被激活后又能使MAPKK磷酸化而被激活，产生MAPK并激活一系列其它蛋白激酶，使细胞骨架成分磷酸化，亦可经核转位进入细胞核激活核内转录因子，调节转录因子的靶基因，完成对细胞刺激的反应。

细胞因子、生长因子、激素以及各种应激刺激都可以作为激活因子激活这个三级酶联反应。

MAPK是MAPK途径的核心，其底物绝大部分是核内转录因子。

目前发现该系统有5条MAPK信号通路，即细胞外调节蛋白激酶1/2（extracellularregulatedproteinkinases1/2，ERK1/2）通路、c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK/应激活化蛋白激酶（stress-activatedproteinKinase，SAPK）通路、p38MAPK（p38mitogen-activatedProteinkinase，p38MAPK）通路、ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶（bigMAPkinase，BMK1）通路和ERK3/4通路[11,12]。

其中，JNK和p38MAPK信号通路是MAPK家族的重要成员，两者能应答多种细胞外刺激，可被细胞因子、生长因子、应激（如机械力、电离辐射、渗透压、热休克和氧化损伤）等多种因素激活，大量实验提示JNK及p38MAPK信号通路在细胞增殖、分化、凋亡、应激反应、DNA损伤修复以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用[13]。

磷酯酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）家族，是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇（phos-phatidylinositol，PI）3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。

丝/苏氨酸激酶（serine-threoninekinase，Akt）通路主要负责由PI3K始动的生物信息的传导，AKT是PI3K的下游分子。

PI3K/Akt通路在细胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖转运、细胞周期调控等多种生物学过程中发挥着重要作用[14,15]。

近年来相关研究逐渐增多，成为研究的热点。

已有研究证实JNK、p38MAPK、PI3K信号通路参与了不同理化条件下内皮细胞、成骨细胞、肝星状细胞、成纤维细胞等CTGF的表达调控。

但是目前对于其是否介导了周期性张应力对hPDLFs表达CTGF的调控还不是很清楚。

近年来，随着细胞力学实验技术的迅速发展，有关细胞、组织在受到机械力作用后所发生的生物学变化的研究较多，但由于所采用的力学实验方法不同，以及机械力的施加方式和大小的差异，所获得的结果并不完全一致，目前对hPDLFs受到机械力作用后表达CTGF及其机制研究不多。

本研究采用多通道细胞牵张应力加载系统，以hPDLFs为对象构建细胞体外培养-力学刺激模型，并通过CCK-8法检测观察hPDLFs增殖状况，应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的CTGF蛋白，应用荧光定量RT-PCR技术检测细胞CTGFmRNA的表达，来研究周期性张应力对hPDLFs增殖及CTGF表达的影响。

通过观察加力前添加信号通路抑制剂后CTGF的变化来确定介导周期性张应力诱导的CTGF表达的信号通路，为全面阐明咬合创伤的致病机理以及探寻咬合创伤所致牙周炎“干预治疗”的关键靶点提供理论依据和新思路。

本实验分以下三个部分：

第一部分：

建立人牙周膜成纤维细胞体外培养-力学刺激模型

第二部分：

探讨周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖及CTGF表达的影响

第三部分：

探讨JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达CTGF过程中起的作用。

第一部分建立人牙周膜成纤维细胞体外培养-力学刺激模型

hPDLFs作为牙周膜中的主体细胞，在牙周组织的再生及改建过程中起着重要作用，深入研究牙周膜细胞的生物学特性对于牙周疾病的治疗有重要意义。

为了了解细胞结构功能关系和调节机制，就必须结合细胞学和细胞力学的方法对细胞加以研究。

最理想的情况是研究细胞在机体生理状态下对外界因素的各种反应，但体内众多的环境因素使体内研究难以区别单一效应或是特定的联合效应。

体外细胞培养可以排除体内复杂因素的干扰，进而研究单一因素对细胞的调节作用，从而阐明单一因素的作用机制。

由于牙周膜独特的解剖结构和取材难度使得hPDLFs的原代培养或培养后不能提供充足的细胞成为以往此类研究的难点之一。

本实验选用美国ScienCell公司提供的H2630人牙周膜成纤维细胞株，进行传代培养，达到实验对细胞质量及数量的要求。

本实验将以hPDLFs为研究对象，对hPDLFs在传代培养过程中的形态，发育生长速度进行观察。

运用袁晓博士与哈尔滨工业大学共同研制的多通道细胞牵张应力加载系统，对体外培养的hPDLFs施加周期性张应力，构建hPDLFs体外培养-力学刺激模型，为后续实验研究奠定基础。

1.1材料和方法

1.1.1主要试剂及配制

人牙周膜成纤维细胞株hPDLFs（H263美国ScienCell，上海锐聪生化公司进口分装）

胎牛血清（四季青，中国）

低糖DMEM培养液（solarbio，中国）

胰蛋白酶（0.02%EDTA）（solarbio，中国）

生长培养基：

10%FBS的低糖DMEM培养液

PBS缓冲液：

（KCL0.2g；KH2PO40.24g；NaCL8.0g；Na2HPO41.44g；加双蒸水800ml溶解后，用HCL调pH值至0.74并定容1L，灭菌后4°C保存）

冻存液（DMSO：

胎牛血清=1：

9）

1.1.2主要设备

CO2恒温培养箱（HealForce，中国）

超净工作台（HealForce，中国）

倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）

电子天平（Startorious，德国）

离心机（Eppendoff，德国）

Bioflex弹性基底膜6孔培养板（FlexcellInternationalcorp，PA，美国）

多通道细胞牵张应力加载系统（袁晓博士与中国哈尔滨工业大学共同研制，中国）

1.1.3细胞力学加载装置

本实验采用袁晓博士与哈尔滨工业大学共同研制的多通道细胞牵张应力加载系统（见图1-1）实现细胞牵张应力加载。

该系统应用Bioflex弹性基底膜6孔培养板（见图1-2）作为细胞培养单元。

动力加载单元使用微型真空泵，当真空泵工作，抽取真空室内的空气时，由于真空室形成负压，位于真空室上方的培养板的弹性膜就会向腔内部凹陷，向下拉伸形变；接种于弹性膜培养板内的细胞随弹性膜的形变受到拉伸作用，产生形变从而实现多通道细胞牵张应力的检测与控制。

细胞所受力值大小由培养板底部弹性膜拉伸应变率（%）表示，应变率越大，表示细胞所受张应力越大。

作用力值大小、时间和频率由单片机进行。

图1-1多通道细胞牵张应力加载系统

图1-2Bioflex弹性基底膜6孔培养板

1.1.4实验方法

1.1.4.1hPDLFs的培养

hPDLFs培养于含有10%胎牛血清的DMEM低糖生长培养基中，于37°C饱和湿度，5%CO2恒温培养箱内培养。

1-2天换液一次，倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状态。

1.1.4.2hPDLFs的传代

倒置相差显微镜下观察细胞生长铺满培养瓶80%时，进行细胞的传代培养。

倒掉培养瓶中的培养基，PBS冲洗3遍，加入适量胰蛋白酶消化液，覆盖细胞。

倒置显微镜下观察细胞的消化情况，大约一分钟后，见胞质回缩，细胞之间不再连接成片，吸弃胰蛋白酶液消化液，加入2ml新鲜生长培养基终止消化，用吸管吹打均匀成细胞悬液。

细胞计数后，5×104个/ml接种于聚苯乙烯培养瓶中，加入3ml生长培养基，于37°C饱和湿度、5%CO2恒温培养箱内培养。

1.1.4.3hPDLFs的冻存

细胞生长状态良好时，应该及时冻存部分生长状态良好的细胞，以备后续实验的使用。

细胞冻存的前一天需给细胞换液。

倒掉培养瓶中细胞密度大于80%的培养液，用PBS反复冲洗三次，加入0.25%胰酶1ml左右，消化1～2min，倒置相差显微镜下观察细胞，待细胞开始回缩时向培养瓶中加入生长培养液终止消化过程。

吸管反复轻轻吹打培养瓶壁上的细胞，并尽量避免在吹打过程中产生气泡损伤细胞。

收集细胞悬液至离心管中，室温1000rpm离心5分钟，弃上清液。

加入冻存液（90%FBS+10%DMSO）放4℃冰箱15分钟后将离心管移入超净台，吹散细胞沉淀，将细胞移入冻存管并标记好细胞类、代数和冻存日期，把冻存管依次放入4℃冰箱1小时，-20℃冰箱2小时，最后将冻存管移入-80℃冰箱或液氮中。

1.1.4.4hPDLFs的复苏

培养的细胞状态不好及数量不足时，应及时复苏细胞。

迅速将装有细胞的冻存管投入到已经预热37°C的水浴箱中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体在一分钟内迅速融化。

待冻存管内液体完全溶解后取出，用75%酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

将冻存液移入离心管