整理微生物方法学验证范本.docx

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整理微生物方法学验证范本

编码：

VP-C01-MM-01

XXXX软膏微生物限度检查

方法学验证方案

起草人：

年月日

审核人：

年月日

年月日

年月日

批准人：

年月日

1.验证立项表

2.验证内容

2.1验证目的

2.2验证范围

2.3验证要求

2.4验证方法

2.4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物

2.4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容

2.4.3金黄色葡萄球菌验证内容

2.4.4铜绿假单胞菌验证内容

3.验证报告

验证立项表（REC）

立项题目

立项部门

申请人

申请日期

要求完成日期

验证类别

负责部门

参与部门及人员

验证原因

质量部审核意见

审核人：

日期：

验证领导小组

审批意见

审批人：

日期：

备注

XXXX软膏微生物限度检查方法学验证方案

编码：

VP-C01-MM-01

品名

验证依据

2005版药典

规格

验证日期

年月日

数量

报告日期

年月日

验证项目

细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌

1.验证目的XXXX软膏配方中含水杨酸、硼酸，该两种物质具有一定的抑菌性。

根据《中国药典》（2005年版）微生物限度检查标准规定，对XXXX软膏进行细菌、霉菌及酵母菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的验证试验，以确认供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性。

2.验证范围本公司XXXX软膏的微生物限度检测。

3.判定标准

3.1验证小组成员

姓名

职务

职责

组长

负责验证方案、报告的批准

项目负责人

负责验证方案、报告的起草与具体实施

验证小组成员

负责验证试验及填写记录

3.2细菌、霉菌及酵母菌在3次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%；产品的试验组与阳性菌组的菌落数差异不超过30%，假定产品试验组的平均值与阳性菌组的平均值之比为Q，则0.7≤Q≤1.3。

3.3金黄色葡萄球菌在3次平行试验中，供试品组：

结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌；试验组：

结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌；阴性对照组：

结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：

结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

3.4铜绿假单胞菌在3次平行试验中，供试品组：

结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌；试验组：

结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌；阴性对照组：

结果应为阴性，未检出阴性对照菌；阳性对照组：

结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.验证方法

4.1.试验原料、稀释剂和标准微生物

4.1.1试验样品：

XXXX软膏三批，批号为、、。

4.1.2稀释剂：

PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。

配法：

照（05版药典附录XIIIC）配制；0.9%无菌氯化钠溶液的配制：

取氯化钠9.0g，加1000ml使完全溶解，分装，灭菌。

4.1.3实验仪器：

无菌培养皿（直径9.0cm）、净化室、灭菌锅、无菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴锅，试管（18×180）,具塞三角瓶。

4.1.4验证用培养基营养琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、溴化十六烷基三甲铵培养基、玫瑰红钠培养基。

4.1.5验证用微生物名称及编号

菌珠名称

传代次数

大肠埃希菌MCC（B）44102

金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003

枯草芽孢杆菌CMCC（B）63501

白色念珠菌霉CMCC（F）98001

4.1.6菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时；上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

4.1.7供试品溶液的制备称取XXXX软膏10g，置灭菌三角瓶中，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，45℃下使之全部溶化，摇匀，作为1：

10的供试品溶液。

4.2细菌、霉菌及酵母菌验证内容

4.2.1试验组：

分别取1:

10供试品溶液0.2ml注入两个平皿，接种50-100个挑战微生物，每株试验菌平两行制备两个平皿（分别注入以上四种菌悬液），向平皿内倒冷却至45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml：

并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2.2菌液组：

不加供试液，直接将试验菌株接种于2个平皿中，其余操作步骤同样品试验组操作。

4.2.3供试品对照组：

取1:

10供试品溶液0.2ml分别注入两个平皿，向平皿内倒冷却到45℃的营养琼脂培养基（细菌）或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌霉）15～20ml,并混合均匀凝固后，置于所需温度下培养。

4.2.4上述操作，应做三次平行试验，分别计算各次试验的菌的回收率。

试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%。

4.2.5培养：

营养琼脂培养基平皿倒置于30-35℃下培养48h，玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基倒置于23-27℃下培养72h。

4.2.6观察和计数：

对每个平皿逐日检查计数，结果以培养终至的计数为准，并将每组试验中接有相同试验菌株的两个平皿计数进行平均，取平均值。

观察微生物的菌落形态并做革兰氏染色，以确认生长菌与接入的微生物相同。

4.2.7验证用微生物的稀释度和接种量

菌珠名称

浓度（CFU）/ml

稀释度

接种量

大肠埃希菌

约50-100cfu

10-6

0.1ml

金黄色葡萄球菌

约50-100cfu

10-6

0.1ml

枯草芽孢杆菌

约50-100cfu

10-5

0.3ml

白色念珠菌霉

约50-100cfu

10-4

0.1ml

4.2.8试验结果

C.可能造成较大环境影响的建设项目，应当编制环境影响报告书4.2.8.1品名：

批号：

（2）生产、储存危险化学品（包括使用长输管道输送危险化学品）的建设项目；（供试品注入量:

每皿注入0.2ml）

（三）环境价值的定义

菌珠名称

试验组

菌液组

定性评价方法有：

安全检查表、预先危险分析、故障类型和影响分析、作业条件危险性评价法、危险和可操作性研究等。

供试品对照组

1）采取防护措施。

试验组菌回收率%

对于不同的评价单元，可根据评价的需要和单元特征选择不同的评价方法。

碟1

碟2

平均

碟1

碟2

平均

碟1

1.规划环境影响评价的技术依据碟2

（3）公众对规划实施所产生的环境影响的意见；平均

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：

检验人：

4.2.8.2品名：

批号：

（供试品注入量:

每皿注入0.2ml）

菌珠名称

试验组

菌液组

供试品对照组

试验组菌回收率%

碟1

碟2

平均

碟1

碟2

平均

碟1

碟2

平均

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：

检验人：

4.2.8.3品名：

批号：

（供试品注入量:

每皿注入0.2ml）

菌珠名称

试验组

菌液组

供试品对照组

试验组菌回收率%

碟1

碟2

平均

碟1

碟2

平均

碟1

碟2

平均

大肠埃希菌

金黄色葡萄球菌

枯草芽孢杆菌

白色念珠菌

验证结果：

复核人：

检验人：

4.3铜绿假单胞菌验证内容

4.3.1供试品组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（铜绿假单胞菌）进行检查，结果应为阴性，未检出铜绿假单胞菌。

4.3.2试验组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入铜绿假单胞菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。

结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.3.3阴性对照菌组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，加入大肠埃希菌菌液1ml,35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。

结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。

4.3.4阳性对照菌组取铜绿假单胞菌对照菌液1ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，培养24小时，其余同供试品组。

结果应为阳性，检出铜绿假单胞菌。

4.3.5验证结果

4.3.5.1品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

4.3.5.2品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

4.3.5.3品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照菌组

溴化十六烷基三甲铵

革兰氏染色

氧化酶试验

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

4.4金黄色葡萄球菌验证内容

4.4.1供试品组供试品组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，按中国药典2005版二部附录XJ微生物限度检查法中控制菌检查项下（金黄色葡萄球菌）进行检查，结果应为阴性，未检出金黄色葡萄球菌。

4.4.2试验组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入金黄色葡萄球菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。

结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

4.4.3阴性对照组取1：

10的供试品液10ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，加入大肠埃希菌对照菌液1ml，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。

结果应为阴性，未检出大肠埃希菌。

4.4.4阳性对照菌组取金黄色葡萄球菌对照菌液1ml加入100ml无菌营养肉汤培养基中，35-37℃培养24小时后取培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72小时，其余同供试品组。

结果应为阳性，检出金黄色葡萄球菌。

4.4.5检验结果

4.4.5.1品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照菌组

甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

4.4.5.2品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照菌组

甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

4.4.5.3品名：

批号：

试验组

阴性对照组

供试品组

阳性对照菌组

甘露醇氯化钠琼脂

革兰氏染色

血浆凝固酶

单项结论

验证结果：

复核人：

检验人：

验证报告（REC）

验证项目名称

验证实施日期

年月日至年月日

验证类别

验证依据

《中华人民共和国药典》2005版

负责部门

参与人员签字

参与部门

参与人员签字

验证结果

与评价

结论

项目负责人签名：

年月日

备注

复核人：

批准人：

年月日