基础生物化学核酸化学联系.docx
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基础生物化学核酸化学联系
第一章核酸化学
或
第一节核酸导言
一、核酸的发现
1868年,瑞士的科学家F.Miescher从外科绷带上的脓细胞的核中分离出一种富含磷元素的酸性化合物,称为“核素”(nuclein)。
1889年,Altman等人从酵母和动物的细胞核中制得了不含蛋白质的核酸,首次使用“核酸”(nucleicacid)一词。
二、核酸是遗传与变异的物质基础
1944年O.t.Avery等人通过细菌转化实验(肺炎双球菌转化实验)证明核酸是
遗传物质。
PPT部分如下:
S球菌:
有毒肺炎球菌,光滑、有夹膜。
R型球菌:
无毒肺炎球菌,粗糙、无夹膜。
二、核酸的种类及分布
核酸是生物体内的高分子化合物,包括DNA和RNA两大类。
1.脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA)
分布:
原核生物:
核质区、质粒。
真核生物:
95%在细胞核、5%在线粒体和叶绿体。
功能:
携带遗传信息,决定细胞和个体的基因型(genotype)。
2.核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)
分布:
原核生物:
细胞质
真核生物:
75%在细胞质
15%在线粒体和叶绿体
10%在细胞核
RNA种类:
mRNA(信使RNA,messengerRNA):
约占总RNA的5%,蛋白质合成模板。
rRNA(核糖体RNA,ribosoalRNA):
约占总RNA的80%,核蛋白体组分。
原核生物核糖体中有三类rRNA:
5S、16S、23S
真核生物核糖体中有四类rRNA:
5S、5.8S、18S、28S
tRNA(转移RNA,transferRNA):
约占总RNA的10%~15%,转运氨基酸。
hnRNA(核内不均一RNA):
成熟mRNA的前体。
snRNA(核内小RNA):
参与hnRNA的剪接、转运。
snoRNA(核仁小RNA):
rRNA的加工、修饰。
scRNA(胞浆小RNA):
蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分。
第二节核酸组成成分
一.元素组成
主要元素有C、H、O、N、P
与蛋白质比较,核酸一般不含S,而P的含量较为稳定,占9-11%。
核酸定量测定的经典方法-定磷法。
二.核酸的基本结构单元
嘌呤(A、G)
碱基(A、T、C、G、U)
核苷嘧啶(C、T、U)
核酸核苷酸戊糖(核糖、脱氧核糖)
磷酸
PPT附图:
1.戊糖
DNA中戊糖为脱氧核糖,RNA中戊糖为核糖,结构式如下:
核糖脱氧核糖
它们均以呋喃糖态存在,如下图:
2.碱基
核苷酸中的碱基均为含氮杂环化合物,它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。
嘌呤碱(purine):
鸟嘌呤(guanine,G)和腺嘌呤(adenine,A);
嘧啶碱(pyrimidine):
胞嘧啶(cytosine,C)、尿嘧啶(uracil,U)和胸腺嘧啶(thymine,T)。
DNA中的4种碱基:
G、A、C、T。
RNA中的4种碱基:
G、A、C、U。
PPT附图:
3.核苷
戊糖第1位碳原子上的羟基与嘌呤的第9位氮原子或与嘧啶的第1位氮原子形成的N-C糖苷键。
糖与碱基之间的C-N键,称为C-N糖苷键。
PPT附图:
有些核酸中还含有修饰碱基(modifiedcomponent),(或稀有碱基,unusualcomponent),这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化(methylation)或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。
一般这些碱基在核酸中的含量稀少,在各种类型核酸中的分布也不均一。
如:
假尿苷(ϕ),二氢尿嘧啶(DHU),Am,m26A。
PPT附图:
图片1
4.核苷酸
核苷上的戊糖羟基被磷酸酯化,形成核苷酸。
化学结构如下:
RNA中的核苷酸:
腺苷酸AMP、鸟苷酸GMP、胞苷酸CMP、尿苷酸UMP。
DNA中的核苷酸:
脱氧腺苷酸dAMP、脱氧鸟苷酸dGMP、脱氧胞苷酸dCMP、脱氧胸苷酸dTMP。
细胞内还有一些以游离形式存在的核苷酸及其衍生物。
它们具有重要的生物学功能。
比较重要的有:
多磷酸核苷(NDP、NTP),环化核苷酸(cAMP、cGMP等),辅酶或辅基(NAD、NADP、FAD、CoA等,均含有AMP),活性代谢物(UDPG、CDP-胆碱)。
举例附图:
ATP(去掉Figure7.2
(2)):
ATP分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。
ATP水解时,可以释放出大量自由能。
用于推动生物体内各种需能的生化反应。
环化核苷酸:
核苷酸的磷酸基团既与3'-OH又与5'-OH相连,从而形成环化的核苷酸,叫做3',5'-环核苷酸。
cAMP(3′,5′-环化腺苷酸)和cGMP(3′,5′-环化鸟苷酸)的主要功能是作为细胞的第二信使。
cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。
在pH7.4,cAMP和cGMP的水解能约为43.9KJ/mol,比ATP水解能高得多。
第三节DNA的分子结构
一.DNA的一级结构
1.概念
(1)DNA一级结构:
一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序及连接方式。
核苷酸的排列顺序代表了遗传信息。
(2)寡核苷酸(oligonucleotide):
指二至十个甚至更多个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段。
目前多由仪器自动合成而用作DNA合成的引物(Primer)、基因探针(probe)等,在现代分子生物学研究中具有广泛的用途。
2.DNA一级结构特点:
(1)核苷酸的连接方式:
5′位磷酸与下一位核苷酸的3′-OH形成3ˊ,5ˊ磷酸二酯键。
(2)不分支的线性大分子。
(3)磷酸基和戊糖基构成DNA链的骨架,可变部分是碱基排列顺序,形成侧链。
(4)核酸的基本结构形式:
多核苷酸链
信息量:
4n
末端:
5ˊ端、3ˊ端
多核苷酸链的方向:
5ˊ端→3ˊ端(由左至右)
3、表示方法:
结构式、线条式、文字缩写
二.DNA的二级结构
PPT附图:
1953年,Watson和Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型,揭示了遗传信息是如何储存在DNA分子中,以及遗传性状何以在世代间得以保持。
这是生物学发展的重大里程碑。
1.双螺旋模型提出的依据:
(1)碱基组成分析:
Chargaff规则:
[A]=[T];[G]=[C]
(2)碱基的理化数据分析:
A-T、G-C以氢键配对较合理
(3)DNA纤维的X-线衍射图谱分析
2.DNA双螺旋结构模型的特点:
(1)DNA分子由两条反向平行的多核苷酸链构成双螺旋结构。
两条链围绕同一中心轴形成右手螺旋。
螺旋中的两条链方向相反,即其中一条链的方向为5′端→3′端,而另一条链的方向为3′端→5′端。
当一条多核苷酸链的序列确定后,即可决定另一条互补链的序列。
(2)嘌呤碱和嘧啶碱位于双螺旋的内侧,磷酸与脱氧核糖在外侧,彼此通过3′,5′-磷酸二酯键形成DNA分子的骨架。
碱基平面与纵轴垂直,糖环平面与纵轴平行。
(3)螺旋横截面的直径约为2nm,每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm,每10个核苷酸形成一个螺旋,其螺矩(即螺旋旋转一圈的高度)为3.4nm。
(4)维持两条DNA链相互结合的力是链间碱基对形成的氢键。
碱基结合具有严格的配对规律:
A与T结合,G与C结合,这种配对关系,称为碱基互补。
A和T之间形成两个氢键,G与C之间形成三个氢键。
在DNA分子中,嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。
(5)螺旋表面形成大沟(majorgroove)及小沟(minorgroove),彼此相间排列。
小沟较浅;大沟较深,是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。
(6)氢键维持双链横向稳定性,碱基堆积力维持双链纵向稳定性。
3.双螺旋结构稳定性的因素
DNA双螺旋结构在生理条件下很稳定。
改变介质条件和环境温度,将影响双螺旋的稳定性。
(1)碱基堆积力形成疏水环境,是使DNA稳定的主要因素。
(2)互补碱基间形成的氢键。
GC含量越多,越稳定。
(3)介质中的阳离子(如Na+、K+和Mg2+)中和了磷酸基团的负电荷,降低了DNA链之间的排斥力等。
(4)双螺旋结构内部形成的疏水区,消除了介质中水分子对碱基之间氢键的影响。
4.DNA双螺旋构象的多态性
(1)B型:
相对湿度为92%的DNA钠盐纤维中。
(2)A型:
水合的DNA脱水时,含水量为75%。
螺旋粗短,大沟深窄,小沟宽浅。
(3)Z型:
左手螺旋。
螺旋细长,大沟平坦,小沟窄深。
类型旋转方向螺旋直径螺距每圈碱基对数碱基对间距碱基倾角
A-DNA右2.32.8110.255200
B-DNA右2.03.4100.3400
Z-DNA左1.84.5120.3770
三线表
三.DNA的三级结构
双螺旋DNA进一步扭曲盘绕则形成一种比双螺旋更高层次的空间构象。
形成包括:
线状DNA形成的纽结、超螺旋和多重螺旋;环状DNA形成的结、超螺旋和连环等。
超螺旋是DNA三级结构的主要形式。
超螺旋总是向着抵消初级螺旋改变的方向发展。
大多数原核生物:
1)共价封闭的环状双螺旋分子
2)超螺旋结构:
双螺旋基础上的螺旋化
正超螺旋(positivesupercoil):
盘绕方向与双螺旋方同相同
负超螺旋(negativesupercoil):
盘绕方向与双螺旋方向相反
所有的DNA超螺旋都是由DNA拓扑异构酶产生的。
拓扑异构酶I(解旋酶):
能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA。
拓扑异构酶II(促旋酶):
能使松驰环状DNA转变成负超螺旋形DNA。
四.DNA在真核生物细胞核内的组装
1.染色质
真核生物的染色体(chromasome)在细胞生活周期的大部分时间里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。
染色质是一种纤维状结构,叫做染色质丝,它是由最基本的单位核小体(nucleosome)成串排列而成的。
DNA是染色体的主要化学成分,也是遗传信息的载体,约占染色体全部成分的27%,另外组蛋白和非组蛋白占66%,RNA占6%。
组蛋白(histones)是一种碱性蛋白质,等电点一般在PH10.0以上,其特点是富含二种碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)。
2.核小体
核小体是构成染色质的基本结构单位,使得染色质中DNA、RNA和蛋白质组织成为一种致密的结构形式。
核小体由核心颗粒(coreparticle)和连接区DNA(linkerDNA)二部分组成,在电镜下可见其成捻珠状,前者包括组蛋白H2A,H2B,H3和H4各两分子构成的致密八聚体(又称核心组蛋白),DNA以左手螺旋在组蛋白核心上缠绕1.8圈,共146bp;后者包括两相邻核心颗粒间约60bp的连接DNA和位于连接区DNA上的组蛋白H1(如下图),连接区使染色质纤维获得弹性。
核小体是DNA紧缩的第一阶段,在此基础上,DNA链进一步折叠成每圈六个核小体,直径30nm的纤维状结构,这种30nm纤维再扭曲成襻,许多襻环绕染色体骨架(Scaffold)形成棒状的染色体,最终压缩将近一万倍。
这样,才使每个染色体中几厘米长(如人染色体的DNA分子平均长度为4cm)的DNA分子容纳在直径数微米(如人细胞核的直径为6-7μm)的细胞核中。
核小体的形成以及DNA超螺旋结构与功能的关系还不十分清楚,可能与基因的转录调节控制有关。
第四节RNA的分子结构
一、RNA的一级结构
结构特点:
1.RNA是不分支的单链分子,线性多聚核糖核苷酸;核苷酸之间以3’,5’-磷酸二酯键相连。
2.嘌呤的总数不一定等于嘧啶的总数。
3.部分区域能形成双螺旋结构,不能形成双螺旋的部分,则形成单链突环。
这种结构称为“发夹型”结构。
4.碱基配对规则:
A-U,G-C,不能配对区域形成突起。
G-U配对形成的氢键较弱。
5.tRNA中除了常见的碱基外,还存在一些稀有碱基,这类碱基大部分位于突环部分。
6.不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。
二、tRNA的结构
1.tRNA的一级结构
tRNA的一级结构特点:
(1)分子量较小,由70-90个核苷酸组成,沉降系数在4S左右;
(2)含有较多的稀有碱基10-20%,因而增加了识别和疏水作用,如DHU;
(3)3’-末端都为pCCA-OH,用来接受AA;
(4)5’-末端多为pG,也有pC的;
(5)具有TψC序列
(6)tRNA的一级结构中有一些保守序列,与其特殊的结构与功能有关。
双氢尿嘧啶(DHU)假尿嘧啶(ψ)
2、tRNA的二级结构
tRNA的二级结构呈三叶草形。
双螺旋区构成叶柄,突环区是三片小叶。
典型特征:
“四臂四环“
四臂:
氨基酸臂、二氢尿嘧啶臂、反密码臂、TψC臂
四环:
二氢尿嘧啶环(D环)、反密码环、额外环、TψC环
3、tRNA的三级结构
tRNA的三级结构为倒L型:
一端是-CCA,另一端是反密码子环。
*tRNA的功能:
活化、搬运氨基酸到核糖体,参与蛋白质的翻译。
三、rRNA的结构
原核生物(以大肠杆菌为例)
真核生物(以小鼠肝为例)
小亚基
30S
40S
rRNA
16S
1542个核苷酸
18S
1874个核苷酸
蛋白质
21种
占总重量的40%
33种
占总重量的50%
大亚基
50S
60S
rRNA
23S
5S
2940个核苷酸
120个核苷酸
28S
5.85S
5S
4718个核苷酸
160个核苷酸
120个核苷酸
蛋白质
31种
占总重量的30%
49种
占总重量的35%
*rRNA的功能:
组成核蛋白体,作为蛋白质合成的场所。
四、mRNA的结构
1.原核生物:
多顺反子(polycistronicmRNA)。
2.真核生物:
单顺反子,含有断裂基因(splitegene)。
断裂基因:
绝大多数真核基因的编码序列(exon)都被或长或短的非编码序列(intron)隔开。
真核生物mRNA的结构特点:
(1)大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷,同时第一个核苷酸的C´2也是甲基化,形成帽子结构:
m7GpppNm-。
(2)大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸(polyA)结构,称为多聚A尾。
帽子结构的作用:
(1)防止5´-核酸外切酶的降解作用;
(2)在蛋白质合成过程中,有助于核糖体与mRNA的识别与结合,使翻译得以正确起始。
多聚腺苷酸(polyA)尾巴的作用:
(1)绝大多数真核细胞mRNA3´端有一段长约20~250nt的聚腺苷酸poly(A);
(2)poly(A)是在转录后由poly(A)聚合酶催化形成的。
(3)poly(A)可能与mRNA从细胞核到细胞质的运输有关。
(4)poly(A)还可能与mRNA半寿期有关,通常新生mRNA的poly(A)较长,而衰老的mRNApoly(A)较短。
*mRNA的功能:
把DNA所携带的遗传信息,按碱基互补配对原则,抄录并传送至核糖体,用以决定其合成蛋白质的氨基酸排列顺序。
核酸的物理化学性质
一、溶解度
提纯的DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末,两者都微溶于水,不溶于一般有机溶剂。
二、核酸的酸碱性质
两性解离,酸性强。
通过等电点来沉淀核酸。
DNA等电点4~4.5,RNA等电点2~2.5
电泳行为泳向正极(pH7-8),进行核酸分离纯化。
三、高分子性质
沉淀行为加盐(中和电荷);
粘度DNA>RNA;
超离心沉降;
凝胶过滤;
分子大小单位:
分子量(道尔顿,D)、碱基对数目(bp)、离心沉降常数(S)。
四、核酸的紫外吸收性质
嘌呤和嘧啶具有共轭双键,能强烈吸收紫外光。
在260nm处有最大吸收峰。
对于纯的DNA或RNA,可以通过测得A260来测定核酸的含量。
OD260的应用
1.DNA或RNA的定量
OD260=1.0相当于
50μg/ml双链DNA
40μg/ml单链DNA(或RNA)
20μg/ml寡核苷酸
2.判断核酸样品的纯度
DNA纯品:
OD260/OD280=1.8
RNA纯品:
OD260/OD280=2.0
五、核酸的变性、复性及杂交
1、DNA的变性(denaturation)
(1)概念:
DNA变性指在理化因素作用下,DNA分子中的氢键断裂,碱基堆积力遭到破坏,双螺旋结构解体,双链分开形成单链的过程。
(2)引起变性的因素有:
加热、酸碱、变性剂(尿素、甲醛)等。
(3)增色效应(hyperchromiceffect):
核酸变性后,在260nm处的吸收值上升的现象。
增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。
(4)DNA的熔点(熔解温度,Tm):
加热变性使DNA双螺旋结构丧失一半时的温度。
DNA的Tm一般在82~95℃之间。
影响Tm值的因素:
DNA长度:
DNA越长,Tm越高;
DNA的均一性:
均一性高,变性的温度范围越窄,据此可分析DNA的均一性;
G-C含量:
测定Tm值,可以推知G-C含量。
(C-G)%=(Tm-69.3)×2.44;
介质中的离子强度:
离子强度高,Tm高,而且熔解过程发生在一个较小的温度范围内。
2、DNA复性(renaturation)
(1)概念:
变性DNA在适当条件下,可使两条彼此分开的链重新缔合成为双螺旋结构,使其物理、化学性质及生物活性得到恢复的过程。
(2)减色效应(hypochromiceffect):
当变性的DNA经复性重新形成双螺旋结构时,其溶液的A260值减小,这种现象称为减色效应。
影响复性的因素:
热变性DNA在缓慢冷却时可以复性,快速冷却不能复性;
DNA片段越大,复性越慢;
DNA浓度越大,复性越快。
3、核酸的杂交
两条来源不同但有互补关系的核苷酸单链分子(DNA单链分子之间或DNA单链分子与RNA分子之间),去掉变性条件后,能够复性形成双链DNA分子或DNA/RNA异质双链分子。
这一过程称为核酸的分子杂交。
第五节核酸研究中常用技术
一、核酸的分离提纯和定量测定
1、DNA的分离
2、RNA的分离
3、核酸含量的测定方法
二.核酸凝胶电泳技术
1.琼脂糖水平凝胶电泳
2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
二、核酸的核苷酸序列测定
1.链终止法
2.化学降解法
三、DNA聚合酶链式反应(PCR)
四、核酸的分子杂交
第六节核酸化学及以核酸为靶的药物研究