中性粒细胞跨内皮迁移机制.docx

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中性粒细胞跨内皮迁移机制

中性粒细胞跨内皮细胞迁移机制

摘要：

中性粒细胞的募集是感染以及炎症性疾病的免疫反应过程中一个不可缺少的组成部分。

中性粒细胞外渗过程包含一个通过紧密协调血管壁内皮细胞间的粘附作用的顺序所安排的复杂的多步级联反应。

中性粒细胞和内皮细胞包含的粘附受体和信号分子可调节进入炎症或感染部位的嗜中性粒细胞的募集。

本综述将集中讲述嗜中性粒细胞募集的最后一步,也就是通过内皮细胞的中性粒细胞的迁移。

在血液和固有免疫的第一条防线中，短命的中性粒细胞是最丰富的白细胞。

中性粒细胞可以通过特异性受体检测到细菌组成成分如脂多糖（LPS）和fMLP；这些特异性受体包括Toll-样受体和G-蛋白偶联受体

（1）。

这个过程导致中性粒细胞迁移活动的上调，使中性粒细胞在几小时之内积聚到急性炎症部位。

除了对细菌和真菌病原体起到防御作用之外，中性粒细胞也是一种辅助性T型1细胞（Th1细胞）相关

（2）炎症浸润的标志。

中性粒细胞的释放可能导致组织损伤的部位募集细胞毒性介质，从而促进自身免疫和慢性炎症。

中性粒细胞浸润是类风湿关节炎，血管炎，炎性肠道疾病和慢性肺疾病的一种特征性标志（3;4）。

因此，中性粒细胞外渗到炎症，血管损伤或感染部位需要有一个严密的调节过程。

中性粒细胞的募集需要一个粘附和迁移的多级级联反应，这个过程需要三种粘附受体，即选择素，整合素和免疫球蛋白超家族黏附受体，所介导的。

这些步骤是：

（一）最初选择素介导的轧制，

（二），趋化因子诱导激活（三）整合素依赖性的稳定的粘附和随后的跨内皮迁移（5-7）。

然而，最近的证据已经促使原来的三步粘附级联反应的扩展，包括新独立的步骤，如整合素介导的紧随中性粒细胞逮捕的血管内爬行。

此外，跨内皮迁移（也称为血细胞溢出）可发生在旁细胞和跨细胞活动中（10）。

在炎症组织中进一步的内皮下间质白细胞的迁移主要由β1和β2整合素家族成员介导，β1整合素成员包括：

与间质连接的α1β1-，α2β1和αsβ1-整合素；β2整合素成员包括：

纤维蛋白原结合的Mac-1（11-13）。

白细胞相关膜结合蛋白酶或分泌蛋白酶以及粘多糖降解酶促进这一过程，这些酶帮助中性粒细胞浸润细胞外基质（11;14）。

在介绍了中性粒细胞内皮的相互作用的不同步骤之后，本综述将集中在讲述嗜中性粒细胞募集的最后一步，即跨内皮迁移。

中性粒细胞募集的多步过程

在轧制过程中，中性粒细胞与内皮细胞表面之间经历了一个短暂的相互作用，这可使作用慢下来。

轧制相互作用的最后一秒是可逆的，由于它们受弱的选择素结合的介导，如E-，P-或L型选择素以及它们的碳水化合物配体和P-选择素糖蛋白-1（PSGL-1），轧制相互作用的最后一秒是可逆的，（15）。

内皮细胞选择素的表达和曝露，如顶点内皮细胞表面的P-和E-型选择素，是一个紧密调节过程。

P-选择素存储在Weibel-Palade小体，而且可以迅速易位到由几种刺激物激活的内皮细胞的细胞腔表面。

截然不同的，E-型选择素不是连续表达的，它是每隔几个小时之后再重新合成的（15）。

P-选择素/PSGL-1相互作用主要参与了最初的共享（16），而缓慢的和更稳定的轧制由E-选择素介导（17）。

有证据表明，最初的轧制和随后粘附在功能上至少在两个层面是相互关联的：

（一）有证据表明相关抗原-1整合素，尤其是当它处于低亲和力构象时，参加缓慢轧制粘连。

随后相关抗原-1的活性构象促进轧制状态的逮捕（18，19）。

（二）第二，除了对于流动中性粒细胞来说的“刹车”功能之外，轧制作用允许中性粒细胞感觉到趋化因子的作用，与硫酸乙酰肝素蛋白多糖通过内皮细胞的细胞膜有关。

该趋化因子衍生信号对启动强烈的粘附步骤（20）是至关重要的。

在激活步骤中，趋化因子包括白细胞介素-8；化学刺激物包括补体C5a，白三烯LTB4，血小板活化因子和细菌的衍生的甲酰化肽基，通过转换低亲和力，选择素介导进入高亲和力作用，整合素介导的强烈的粘附，诱导快速的中性粒细胞粘附（6;20;21）。

中性粒细胞粘附于血管内皮细胞是由整合素，VLA-4（α4β1）

Mac-1的（αMβ2）和LFA-1（αLβ2）的相互作用介导的，作用于中性粒细胞的免疫球蛋白超家族成员如细胞ICAM-1和ICAM-1和VCAM-1，或作用于内皮细胞表面的高级糖基化副产物受体（22）。

这些内皮反受体是组成型表达（细胞ICAM-1和ICAM-2，RAGE）或进一步上调（ICAM-1，RAGE），或者被诱导（VCAM-1）（22，23）。

中性粒细胞外渗和免疫反应过程中整合素介导的粘附的重要性已由几个从事小鼠一个或多个白细胞整合素缺陷（24-27），或白细胞粘附缺陷综合征在男性中缺乏β2整合素研究的研究人员所证明（22，28）。

在外渗过程中，白细胞整合素的活动主要由构象变化和集群调节，然而白细胞整合素的表达只会受到轻微影响。

通过“内至外”的信号激活整合素，这个过程主要受趋化因子介导，涉及几条路径，包括小GTP酶，（29），以及整合素的胞质尾巴的与肌动蛋白结合蛋白相互作用，从而诱导整合素构象的改变（30）。

小GTP酶Rap1调节调节相关抗原-1亲和力（32-35）。

鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs），如CALDAG-GEFI（钙anddiacylglycerolregulatedGEFI）（36，37），VAV1（38），激活Rap1的参与调制白细胞整合亲和力。

CALDAG-GEFI缺陷导致在人类和小鼠体内趋化因子诱导的中性粒细胞的捕捉的减少（36，38）。

此外，肌动结合蛋白如塔林蛋白（30;39）或α-辅肌动蛋白（40）以及14-3-3蛋白（41）已显示以β链为目标来激活整合素。

塔林蛋白是一种包含两个功能区，一个球状头部和棒状域的细胞骨架蛋白。

塔林蛋白的头部被认为可诱导相关抗原αL和β2细胞质尾巴的分离以及导致相关抗原-1高亲和力的构象的产生（42，43）。

中性粒细胞粘附到血管内皮细胞能通过整合素介导由外到内的信号进一步增强，该信号因整合素聚类和构象改变或因整合素结扎而发生。

在起初的捕捉之后，两个Src样蛋白酪氨酸激酶可以介导相关抗原-1和Mac-1诱导粘附稳定性，因为他们的抑制加速了处于流动条件下壁中性粒细胞（44）的分离。

GEFsVAV1andVAV3也有相似的功能（38）。

此外，在Wiskott-Aldrich综合征蛋白（WASp）缺陷中的中性粒细胞显示肌动蛋白的缺陷，细胞骨架的缺陷和紧随初始逮捕的整合素的积聚。

只有在流动条件下，WASp-缺陷表型才可见（45）。

被牵连到白细胞后粘附增强过程中的另外一个因素是桩蛋白，它与α4-整合链的细胞质功能区相互作用（46）。

中性粒细胞跨内皮迁移

经过强烈的粘附反应之后，中性粒细胞爬过内皮细胞表面到最近的利用整合素Mac-1和LFA-1的交界处，这个过程被称为运动（8）。

最近，关于中性粒细胞在体内爬行已提出证据（9）。

跨内皮迁移主要以旁路方式发生，即在胞间交叉点处。

特别是，三个细胞交界处，以及内皮交叉点处的地方基底膜表达较低水平的基质蛋白（48）,已被提议作为迁移的中性粒细胞在体内的外渗优先领域。

此外，最近证据表明，中性粒细胞和其他的白细胞可能以一跨细胞的方式进入血管外组织，即通过内皮细胞（12，49，50）。

事实上，当血管内爬行在体内禁用时，跨细胞通路可能会变得更加突出（9）。

体外研究结果指出了对于中性粒细胞来说，旁路途经占主导地位，然而，5％的中性粒细胞被发现使用发跨细胞途经（49）。

有趣的是，在中性粒细胞的迁移过程中，长寿命的TNF-α预处理和ICAM-1的超表达导致跨细胞途经的相对贡献增加（51）。

对于旁通路，轮回中性粒细胞内皮交界处代表着主要障碍。

至少有两种类型的交界处都参与了轮回：

（一）由能促进钙依赖性的，同种细胞间的接触维生素E-钙粘蛋白形成的粘附交界处（zonula粘着）。

细胞之间的膜相关VE-钙粘蛋白和肌动蛋白细胞骨架的链接受细胞内连环的介导。

（二）紧密连接（闭锁小带），最重要的交界处，形成了密切的细胞间黏附和由三种类型的跨膜蛋白组成，occludin,claudins和交界处粘附分子（JAM），这是与细胞内如闭锁小带-1（ZO-1）的细胞骨架信号分子相链接的（52）。

（1）维生素E-钙粘蛋白

维生素E-钙粘蛋白充当过路白细胞的看门人，在体内，抗体抵抗维生素E-钙粘蛋白的抗体增加内皮细胞单层通透性和中性粒细胞率外渗（53），而在体外研究表明，在血球渗出过程中，维生素E-钙粘蛋白的缺口瞬间形成（54）。

不过，目前还不清楚，在中性粒细胞的迁移位点，维生素E-钙粘蛋白是否从细胞交界处消失对于该过程或结果是不是一个先决条件的。

一个可能的解释是，中性粒细胞粘附血管内皮细胞导致由维生素E-钙粘蛋白的磷酸化调节的维生素E-钙粘蛋白介导的粘附部分的减少。

维生素E-钙粘蛋白以及丝氨酸665的胞质尾的酪氨酸658and731的磷酸化已表明与维生素E-钙粘蛋白的功能障碍有关（55;56）。

最近，ICAM-1介导中性粒细胞粘附内皮细胞可诱导维生素E-钙粘蛋白酪氨酸磷酸化进而推进中性粒细胞轮回（57）。

包括可以使β-连环蛋白磷酸化的GTP酶Rac1，活性氧，活性氧激活富含脯氨酸的酪氨酸磷酸化激酶2的其他途经已经被认为是信号传导介质（58;59）。

有趣的是，中性粒细胞弹性蛋白酶的产生能够降解细胞外部分的维生素E-钙粘蛋白。

因此，中性粒细胞可能参与这一机制，以便他们通过内皮细胞间交界处（60，61）。

然而，因为弹性蛋白酶缺陷或MMP-9缺陷中性粒细胞在无流动跨内皮迁移中没有缺陷，使得中性粒细胞蛋白酶参与的维生素E-钙粘蛋白的蛋白水解的重要性不是很清楚（62）。

（2）JAMs和相关分子

JAMs是免疫球蛋白超家族成员，包括两个细胞外免疫球蛋白样功能区域（63，64），由于最后羧基端的二类PDZ结构域结合基序，他们在内皮细胞和上皮细胞紧密连接处被发现，这使他们与交界处相关的PDZ-功能区相连的分子预先发生相互作用（63，64）。

包括血小板，中性粒细胞，单核细胞和淋巴细胞（65）在内的不同的循环血细胞中发现JAM-A，而JAM-B和JAM-C的表达方式更多的限制表达在血小板和B细胞亚群上的JAM-C（66-69）。

除了通过细胞膜末端区域的保守序列使他们的倾向在同种交互方式中相互作用（70-72），JAM-A也担任白细胞整合素的反受体：

特别是，连接LFA-1的JAM-A（73;74）,与VLA-4相关的JAM-B（75）和与Mac-1相互作用的JAM-C（68）。

在中性粒细胞溢出过程中，JAM-A假设性作用的第一证据来源于实验，该实验证明脑膜炎JAM-A的抗体抑制中性粒细胞募集（76）。

在腹膜炎实验模型中，JAM-A缺陷的小鼠表现出中性粒细胞募集能力的下降。

但是，在这种模型中，骨髓细胞/中性粒细胞上专一的JAM-A在迁移过程中是必不可少的，而发现并不需要血管内皮细胞上的JAM-A（77;78）。

截然不同的是，在灌注损伤模型肝模型中，内皮细胞JAM-A介导中性粒细胞的外渗（78）。

JAM-C与Mac-1的异嗜连接被发现可介导，特别是在低转换速率的，强烈的血小板-中性粒细胞的相互作用（68）。

此外，可溶性的JAM-C阻断中性粒细胞穿过内皮细胞和上皮细胞（79-81）。

在一肺部炎症模型中中性粒细胞聚集受到针对JAM-C的阻断抗体的抑制，内皮细胞特异性超表达的JAM-C可使积聚增加（81）。

然而，这些JAM-C的功能可以和JAM-C的缺陷小鼠证实仍存在争议（82;83）。

除了结合到Mac-1，JAM-B的有效结合JAM-B型（84），以及在血管内皮细胞间接触过程中针对JAM-C的游离的JAM-C/JAM-B异性抗体，从而将易接近的JAM-C呈递给整合素Mac-1（85）。

最近，我们展示了JAM-C的功能是可以调解意想不到的内皮细胞渗透性的增加。

JAM-C的敲除可增加smallGTPaseRAP1在血管内皮细胞的活性，促进维生素E-钙粘蛋白介导的内皮细胞之间的连接，提呈内皮细胞中紧密交界处于粘附交界处最初的功能的相互影响（72，86）。

与此相反，JAM-A能促进上皮细胞RAP1的活性（87）。

总之，在中性粒细胞轮回中JAM-C作用的潜在机制是相当的复杂。

这还有待确定在体内中性粒细胞外渗中过程中起到介导JAM-C的作用的其他途径。

JAM-A相关的内皮选择粘附分子（ESAM）与JAMs不同，她有一个较长的以Ⅰ型PDZ结构域结合基序（63）结束的胞质尾。

在最近的一次研究中，ESAM缺陷小鼠显示中性粒细胞减少，在硫乙醇酸盐引起腹膜炎中延迟中性粒细胞的积聚，以及对肿瘤坏死因子-α或IL-1β的刺激（88）。

一个可能的解释是ESAM表达调节RhoAGTPase的活性，她参与调节内皮屏障和中性粒细胞轮回（89，90）。

这是耐人寻味的，据推测，JAMs和相关的分子如ESAM调节内皮细胞内小GTPases的活性，从而参与中性粒细胞的轮回。

然而，基础机制的细节尚未定义和值得进一步研究。

（3）血小板内皮细胞粘附分子-1（PECAM-1）和CD99

PECAM-1是含有六个Ig功能区的免疫球蛋白超家族成员，在血管内皮细胞间的边界处还有血小板，中性粒细胞，单核细胞和某些T细胞（91，92）上表示。

PECAM-1的Ig功能区的两个氨基末端参与了同种抗原的相互作用，该作用被认为在中性粒细胞跨内皮迁移过程中发生。

阻塞PECAM-1的同种抗原相互作用抑制体内和体外的中性粒细胞的跨内皮细胞迁移（93-97），并在PECAM1-依赖的步骤，阻断白细胞仍然附着在血管内皮细胞的顶面。

内皮细胞PECAM1在细胞质膜的交界处于亚交界处之间循环，以活性白细胞轮回（97）区域为目标。

在小鼠品系C57BL/6中PECAM-1敲除小鼠中性粒细胞的募集量没有减少（98），但是，养殖成不同的品系小鼠出现在腹膜发炎部位募集的中性粒细胞数量的减少现象（99）。

有趣的是，我们发现PECAM-1缺陷影响IL-1β，但对肿瘤坏死因子-α诱导的炎症无影响（100）。

除了阳离子独立免疫球蛋白域1和2依赖同种约束力的粘附分子1，由免疫球蛋白域6的分子介导的阳离子依赖粘附分子-1异嗜性相互作用已被指出参加中性粒细胞外渗的最后一步，即通过基底膜的迁移（94）。

在这个方面，我们最近发现了Ly-6家族的一员，CD177,作为一种新的异型合子PECAM-1的结合的合作伙伴。

CD177是长度为58-64kDa的糖基磷脂酰肌醇（GPI）的锚定糖蛋白，它在中性粒细胞上专一性表达，但在其他血细胞上不表达。

与此相反的同种PECAM-1的相互作用，CD177和PECAM-1之间的异嗜性相互作用能被抗PECAM-1的Ig区域的抗体阻断。

此外，我们证明了中性粒细胞跨内皮细胞迁移过程中的异噬性相互作用功能（101）。

另一个有趣的发现是，PECAM-1同种连接导致迁移中的中性粒细胞的层粘连蛋白受体α6β1-整合素的上调从而增强了的中性粒细胞基底膜随后渗透性。

因此，应对抗α6β1-整合素抗体的中性粒细胞被困在内皮细胞和基底层之间（102）。

这些调查结果还指出一个事实就是PECAM-1作为一种信号受体。

PECAM-1包含两个免疫受体酪氨酸抑制碱基序列，这些序列参与含有磷酸酶的Src-同源-2介导的信号，如SHP-1和SHP-2（103-105）。

此外，PECAM-1的抗体交联已

显示可上调中性粒细胞和其他白细胞中β1-和β2-整合素的活性（106，107）。

CD99是一种在中性粒细胞和其他白细胞和内皮细胞间交界处表达的高度O型糖化分子，它以同种方式进行调解中性粒细胞的轮回（108）。

它控制血细胞外渗的一个步骤，该步骤有别于和朝向PECAM-1介导的步骤，阻断在CD99相关步骤的细胞在穿越内皮细胞交界的中途被捕捉（108;109）。

最近，克隆出小鼠CD99和抗小鼠CD99的抗体抑制抗原特异性T细胞的募集到皮肤的炎症部位和水肿的形成（110）。

此外，我们发现内皮细胞CD99蛋白参与体内中性粒细胞的外渗（110）。

CD99L2是最近确定表达在白细胞和含有32％氨基酸的VD99蛋白的内皮细胞的分子。

在体内CD99L2特异性参与中性粒细胞外渗而不参与淋巴细胞外渗，阻断的CD99L2抑制中性粒细胞以穿过血管周围基底膜的方式穿过血管壁（110）。

（4）ICAM-1

此外，完善的证据表明LFA-1与ICAM-1的相互作用介导中性粒细胞强烈的粘附在血管内皮细胞，最近的证据指出，该作用的重要性对跨内皮迁移也有影响。

在中性粒细胞的轮回，LFA-1迅速重新分布，在中性粒细胞内皮交界接口形成环形集群，在那里有中性粒细胞轮回的发生。

内皮细胞ICAM-1与此环状LFA-1集群共定位（50）。

此外，在中性粒细胞外渗是，含有ICAM-1丰富的微绒毛样的预测结果的“杯状“的结构被迁移中的中性粒细胞包围（49）。

粘附在内皮细胞和ICAM-1链接上的中性粒细胞被认为以依赖于皮肌动蛋白方式诱导和ICAM-1集群相关的细胞骨架重构（111）。

在迁移的中性粒细胞中形成ICAM-1的聚集需要皮肌动蛋白及其酪氨酸磷酸化（112）。

最近，从抗ICAM-2的抗体和ICAM-2缺陷小鼠中证明了ICAM-2参与体内中性粒细胞的募集。

活体显微镜证明了ICAM-2参与了中性粒细胞的外渗过程但没有参与轧制和黏附过程（113）。

结论

尽管近年来，我们对跨内皮过程的机制的理解取得重大进展，但是我们仍有很多东西需要学习。

特别是，体内相关的每一个重要的分子需要建立。

我们应该设计不只一种粘附途径的对比实验。

此外，可想而知，参与中性粒细胞轮回的不同粘附途经可能参与不同层次的合作而该层次可能在他们中间存在。

然而，这些概念需要进一步研究。

未来的实验也需要把重点放在上述描述的组织，血管床和炎症刺激特异性的每一个途径上。

详细的了解中性粒细胞和白细胞轮回分子贡献者将提供在炎症性疾病具体的治疗方法的设计的平台。