最新RTPCR数据分析.docx

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最新RTPCR数据分析

RT-PCR数据分析

用2-△△Ct法分析real-timePCR数据

-----联合应用LightCyclerDataAnalysis软件和MSExcel

Bynetmee，netmee@

引用请注明作者。

1、打开存取的数据文件，点击

2、依次点击

，

，这是适合SYBRgreen为染料的选项。

点击step1：

Baseline下的“changegraphsettings”小图标

。

取消弹出的CustomizeGraph选项卡中的Logarithmis选项

，点击“OK”按钮，退出选项卡。

3、点击

下的“changegraphsettings”小图标

，取消弹出的CustomizeGraph选项卡中的Logarithmis选项

，点击“OK”按钮，退出选项卡。

4、在

选项卡中拖动红色标记线，选取个条曲线都为直线上升部位。

5、可以在

选项卡中观察是否需选取的是曲线直线上升部分。

观察绿线部分与S型曲线交叉的部分是否为直线。

6、如果确为直线，则左侧的“CrossingPoint”值为所需要的Ct值。

7、依次选取下图菜单：

将数据导出为文本文件。

8、打开所保存的文本文件，如图选取

9、将数据粘贴入新建的excel文件，“CrossingPoint”列即是Ct值，删除“Standard”和“CalculatedConcentration”列。

10、将目的基因，本例中为“iNOS”的Ct值按标本对应剪切入beta-actin值右侧一列。

分别标记两列数据为“beta-actin”和“iNOS”。

11、设置所有Ct值的单元格格式

12、数字选项卡，分类选择为数值，点击确定。

13、将E列（目的基因Ct值右侧一列）输入公式“=D4-C4”，求出目的基因与同管beta-actinCt值之差，即△Ct。

14、向下拉复制公式，将△Ct列数值计算出。

15、在△Ct列右侧一列插入公式“=POWER（2,（0-E4））”，此即目的基因相对beta-actin的相对表达量，即2-△Ct（2的-△Ct次方）。

16、在2-△Ct列右侧插入公式“=F4/$F$4”，此列即“2-△△Ct”列，复制公式填满所有标本对应的2-△△Ct空格。

17、至此，2-△△Ct法计算的各标本目的基因的相对表达量完成，2-△△Ct列的数据可以用统计软件进行分析。