TSVD54701氨咖黄敏胶囊 微生物限度检查方法.docx
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TSVD54701氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法
非无菌产品微生物限度
检查方法适用性试验文件
文件名称
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性试验（2015版）
文件编号
TS-VD-547-01
重庆天致药业股份有限公司
2017年
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性试验方案
试验报告的起草：
日期：
试验报告的审核：
日期：
试验报告的审核：
日期：
试验报告的批准：
日期：
1.概述
通过试验以确认所采用的方法适合于该药品的需氧菌、霉菌和酵母菌的测定，确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品的特性制定检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据试验结果判断是否符合试验标准。
若符合，按试验的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行试验，直至试验结果符合设立的试验标准。
2.目的：
确认所采用的方法适合该药品的需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌的测定。
照此检查法和检验条件进行供试品需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌检查能保证检验结果的准确、可靠。
3.职责
3.1.QC：
负责起草试验方案和报告，并负责本方案的实施。
3.2.QC主管、质量部长：
负责试验方案、试验报告的审核。
3.3.质量授权人：
负责方案、偏差和报告的最后批准。
适用于本公司生产的氨咖黄敏胶囊微生物限度检查：
微生物计数法和控制菌检查法。
5.培训：
在本方案实施前，已对方案实施过程中涉及人员进行培训，以保证方案顺利实施，并做好培训记录，培训记录见附表1。
6.试验条件
6.1.供试品规格：
批号：
6.2.培养基及试剂
培养基名称
培养基批号
生产厂家
6.3.试验用菌株
菌种名称
菌种编号
菌种来源
6.4.检验仪器及相关设备
仪器名称
仪器型号
仪器厂家
7.计数方法适用性试验
7.1.需氧菌总数及霉菌和酵母菌计数方法适用性试验
7.1.1菌液制备
7.1.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌的新鲜培养物至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.1.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.1.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，取1ml菌液加0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.2.试验操作方法
试验分3组，进行3次独立的平行试验。
7.1.2.1.供试液的制备
取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，作为1:
10供试液。
7.1.2.2.试验组：
取上述制备好的供试液，加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌悬液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。
取1ml分别注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，30～35℃培养三天，白色念珠菌、黑曲霉30～35℃培养五天，计数；取上述制备好的供试液，加入白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml分别倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，20～25℃培养五天，计数。
7.1.2.3.供试品对照组：
取供试液100ml，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，混匀。
7.1.2.4.菌液对照组：
取各试验菌液1ml，分别加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混匀，使每1ml供试液中菌落数不大于100cfu，每株试验菌平行制备2个平板，置规定温度培养。
7.1.2.5.试验组：
试验可接受标准：
试验组菌落数减去供试品对照组菌落的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2.0范围内。
7.1.2.8.测定结果：
阳性菌
次数
活菌组菌数（cfu/ml）
试验组菌数（cfu/ml）
供试液对照菌数（cfu/ml）
比值
1号皿
2号皿
均值
1号皿
2号皿
均值
细菌数
霉菌数
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌
黑曲霉
白色念珠菌
黑曲霉
白色念珠菌
结论:
检查人/日期：
复核人/日期：
8.控制菌检查法的试验
8.1大肠埃希菌方法适用性试验
8.1.1.供试品的处理：
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，混匀，作为1：
10的供试液。
8.1.2.增菌培养
8.1.2.1.试验组：
取供试液10ml和不大于100cfu/ml大肠埃希菌液1ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时。
8.1.2.2.阳性对照组：
取试验稀释液10ml和不大于100cfu/ml大肠埃希菌液1ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时。
8.1.2.3.阴性对照组：
取试验稀释液10ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时，
8.1.3.选择和分离培养：
取上述增菌培养的培养物各1ml，分别接种至麦康凯液体培养基100ml中，于42～44℃中培养24～48小时，取各麦康凯液体培养物分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～72小时后观察菌落形态。
（所加菌液均不得大于100cfu/ml）
8.1.4.试验可接受标准：
阴性对照组应无菌落生长，试验组和阳性对照组应有菌落生长，且试验组的菌落形态应与阳性对照的相同。
8.1.5.大肠埃希菌测定结果
名称
检测结果
试验组
阳性对照
阴性对照
8.2.沙门菌方法适用性
8.2.1试验组：
取供试品10g接种胰酪大豆胨液体培养基至100ml中，加入不大于100cfu/ml乙型副伤寒沙门菌1ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
8.2.2阳性对照组：
取不大于100cfu/ml乙型副伤寒沙门菌1m接种胰酪大豆胨液体培养基至100ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
8.2.3阴性对照组：
取胰酪大豆胨液体培养基至100ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时后。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
（所加菌液均不得大于100cfu/ml）
名称
检测结果
试验组
阳性对照
阴性对照
结论:
检查人/日期：
复核人/日期：
附表1：
微生物限度检查方法试验培训签名表
方案名称
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性试验培训
培训时间
年月日
序号
姓名
序号
姓名
序号
姓名
1
11
21
2
12
22
3
13
23
4
14
24
5
15
25
6
16
26
7
17
27
8
18
28
9
19
29
10
20
30
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性试验报告
试验报告的起草：
日期：
试验报告的审核：
日期：
试验报告的审核：
日期：
试验报告的批准：
日期：
1.概述
通过试验以确认所采用的方法适合于该药品的需氧菌、霉菌和酵母菌的测定，确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查，根据样品的特性制定检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据试验结果判断是否符合试验标准。
若符合，按试验的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行试验，直至试验结果符合设立的试验标准。
2.目的：
确认所采用的方法适合该药品的需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌的测定。
照此检查法和检验条件进行供试品需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌检查能保证检验结果的准确、可靠。
3.职责
3.1.QC：
负责起草试验方案和报告，并负责本方案的实施。
3.2.QC主管、质量部长：
负责试验方案、试验报告的审核。
3.3.质量授权人：
负责方案、偏差和报告的最后批准。
4.适用范围：
适用于本公司生产的氨咖黄敏胶囊微生物限度检查：
微生物计数法和控制菌检查法。
5.培训：
在本方案实施前，已对方案实施过程中涉及人员进行培训，以保证方案顺利实施，并做好培训记录，培训记录见附表1。
6.试验条件
6.1.供试品规格：
批号：
6.2.培养基及试剂
培养基名称
培养基批号
生产厂家
胰酪大豆胨液体培养基
20171020
北京奥博星生物科技有限公司
胰酪大豆胨琼脂培养基
20160830
北京奥博星生物科技有限公司
沙氏葡萄糖琼脂培养基
20161102
北京奥博星生物科技有限公司
麦康凯琼脂培养基
20151105
北京奥博星生物科技有限公司
麦康凯液体培养基
20161102
北京奥博星生物科技有限公司
PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液
20161108
北京奥博星生物科技有限公司
RV沙门菌增菌液液体培养基
20151030
北京奥博星生物科技有限公司
木糖赖氨酸脱氧胆酸钠琼脂培养基
20160222
北京奥博星生物科技有限公司
三糖铁琼脂培养基
20151018
北京奥博星生物科技有限公司
6.3.试验用菌株
菌种名称
菌种编号
菌种来源
大肠埃希菌
CMCC（B）44102
中国食品药品检定研究院
乙型副伤寒沙门菌
CMCC（B）50094
中国食品药品检定研究院
铜绿假单胞菌
CMCC（B）10104
中国食品药品检定研究院
金黄色葡萄糖菌
CMCC（B）26003
中国食品药品检定研究院
白色念珠菌
CMCC（F）98001
中国食品药品检定研究院
枯草芽胞杆菌
CMCC（B）63501
中国食品药品检定研究院
黑曲霉
CMCC（F）98003
中国食品药品检定研究院
6.4.检验仪器及相关设备
仪器名称
仪器型号
仪器厂家
电子天平
YB2002
上海力能电子仪器公司
超净工作台
SW-CJ-2FD
苏州净化设备有限公司
生物安全柜
BSC-B00IIA
上海搏讯实业有限医疗设备厂
生化培养箱
LRH-250-II
广东省医疗器械厂
霉菌培养箱
MJ-160B
上海悦丰仪器仪表有限公司
7.计数方法适用性试验
7.1.需氧菌总数及霉菌和酵母菌计数方法适用性试验
7.1.1菌液制备
7.1.1.1接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、沙门菌的新鲜培养物至100ml胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.1.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至100ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养18～24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.1.3.接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，取1ml菌液加0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，制成适宜浓度的菌悬液，备用。
7.1.2.试验操作方法
试验分3组，进行3次独立的平行试验。
7.1.2.1.供试液的制备
取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，作为1:
10供试液。
7.1.2.2.试验组：
取上述制备好的供试液，加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌悬液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu。
取1ml分别注入平皿中，倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，30～35℃培养三天，白色念珠菌、黑曲霉30～35℃培养五天，计数；取上述制备好的供试液，加入白色念珠菌、黑曲霉菌悬液，混匀，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，取1ml分别倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，待凝固后，20～25℃培养五天，计数。
7.1.2.3.供试品对照组：
取供试液100ml，加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，混匀。
7.1.2.4.菌液对照组：
取各试验菌液1ml，分别加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，混匀，使每1ml供试液中菌落数不大于100cfu，每株试验菌平行制备2个平板，置规定温度培养。
7.1.2.5.试验组：
试验可接受标准：
试验组菌落数减去供试品对照组菌落的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2.0范围内。
7.1.2.8.测定结果：
阳性菌
次数
活菌组菌数（cfu/ml）
试验组菌数（cfu/ml）
供试液对照菌数（cfu/ml）
比值
1号皿
2号皿
均值
1号皿
2号皿
均值
细菌数
霉菌数
金黄色葡萄球菌
1
86
92
89
75
71
73
0
0
0.8
2
90
94
92
76
74
75
0
0
0.8
3
3
99
97
98
80
82
81
0
0
0.8
铜绿假单胞菌
1
89
85
87
70
76
74
0
0
0.9
2
88
84
86
69
73
71
0
0
0.8
3
91
89
90
82
87
85
0
0
0.9
枯草孢杆菌
1
85
93
89
80
78
79
0
0
0.9
2
82
90
86
77
72
75
0
0
0.9
3
88
94
91
80
82
81
0
0
0.9
黑曲霉
1
63
70
67
55
59
57
0
0
0.9
2
66
62
64
49
51
50
0
0
0.8
3
70
67
69
44
53
49
0
0
0.7
白色念珠菌
1
96
94
95
82
79
81
0
0
0.9
2
99
97
98
85
80
83
0
0
0.8
3
95
98
97
87
81
84
0
0
0.9
黑曲霉
1
63
66
65
50
48
49
0
0
0.8
2
72
63
68
46
58
52
0
0
0.8
3
70
64
67
59
55
57
0
0
0.9
白色念珠菌
1
89
91
90
86
82
84
0
0
0.9
2
93
97
95
83
87
85
0
0
0.9
3
88
96
92
80
84
82
0
0
0.9
结论:
本品按<<中国药典>>2015版四部微生物限度检查方法验证，结果表明可按常规法进行
需氧菌、霉菌和酵母菌检查。
检查人/日期：
复核人/日期：
8.控制菌检查法的试验
8.1大肠埃希菌方法适用性试验
8.1.1.供试品的处理：
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇使溶解，混匀，作为1：
10的供试液。
8.1.2.增菌培养
8.1.2.1.试验组：
取供试液10ml和不大于100cfu/ml大肠埃希菌液1ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时。
8.1.2.2.阳性对照组：
取试验稀释液10ml和不大于100cfu/ml大肠埃希菌液1ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时。
8.1.2.3.阴性对照组：
取试验稀释液10ml加入胰酪大豆胨液体培养基100ml中，于30～35℃中培养18～24小时，
8.1.3.选择和分离培养：
取上述增菌培养的培养物各1ml，分别接种至麦康凯液体培养基100ml中，于42～44℃中培养24～48小时，取各麦康凯液体培养物分别划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～72小时后观察菌落形态。
（所加菌液均不得大于100cfu/ml）
8.1.4.试验可接受标准：
阴性对照组应无菌落生长，试验组和阳性对照组应有菌落生长，且试验组的菌落形态应与阳性对照的相同。
8.1.5.大肠埃希菌测定结果
名称
检测结果
试验组
+
阳性对照
+
阴性对照
-
8.2.沙门菌方法适用性
8.2.1试验组：
取供试品10g接种胰酪大豆胨液体培养基至100ml中，加入不大于100cfu/ml乙型副伤寒沙门菌1ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
8.2.2阳性对照组：
取不大于100cfu/ml乙型副伤寒沙门菌1m接种胰酪大豆胨液体培养基至100ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
8.2.3阴性对照组：
取胰酪大豆胨液体培养基至100ml，混匀，于30～35℃中培养18～24小时后。
取培养物0.1ml接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中，于30～35℃中培养18～24小时后。
取少量RV沙门增菌液体培养基划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，于30～35℃中培养18～48小时。
（所加菌液均不得大于100cfu/ml）
名称
检测结果
试验组
+
阳性对照
+
阴性对照
-
结论:
本品按<<中国药典>>2015版四部微生物限度检查方法验证，结果表明可按常规法进行控制菌
检查。
检查人/日期：
复核人/日期：
9.适用性试验总结报告
9.1.方法适用性试验结论及评价分析：
9.1.1.按照批准的方法适用性试验方案对氨咖黄敏胶囊需氧菌、霉菌和酵母计数方法和大肠埃及菌的方法进行了适用性试验。
9.1.2.已对适用性试验过程中的所有数据及评价分析进行了审核。
适用性试验项目无遗漏，适用性试验实施过程中未对适用性试验方案作修改，适用性试验记录完整，适用性试验结果符合适用性试验标准要求，未出现偏差，方法适用性试验合格，准予此方法用于本实验室检验。
9.2.建议：
在生产工艺及原辅料变更时，应重新进行微生物限度（微生物计数法和控制菌检测法）方法适用性试验。
附表1：
微生物限度检查方法试验培训签名表
方案名称
氨咖黄敏胶囊微生物限度检查方法适用性试验培训
培训时间
年月日
序号
姓名
序号
姓名
序号
姓名
1
11
21
2
12
22
3
13
23
4
14
24
5
15
25
6
16
26
7
17
27
8
18
28
9
19
29
10
20
30
升级会员 