抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用.docx

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抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用

抗坏血酸对细菌脂多糖引起发育毒性保护作用

【摘要】目的研究抗坏血酸（AA）对细菌脂多糖（LPS）引起宫内胎儿死亡（IUFD）、生长发育迟缓（IUGR）和骨骼发育迟缓的保护作用。

方法实验1：

LPS组小鼠于妊娠第15～17d经腹腔注射LPS,LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。

所有孕鼠于妊娠第18d处死。

实验2：

LPS组小鼠于妊娠第16d注射LPS，LPS+AA组在LPS处理前和/或处理后经腹腔注射给予AA，对照组给予等容量的生理盐水或AA。

LPS处理后6h处死孕鼠。

结果LPS+AA预处理组平均每窝死胎数明显低于单纯LPS处理组，LPS+AA后和预+后处理组平均每窝死胎数与单纯LPS组比较差异无统计学意义；AA预、后和预+后处理均显着抑制LPS引起IUGR和枕骨骨化不全。

AA预和后处理均显着抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化，但AA预处理的作用强于后处理。

结论AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理对抗LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起的IUFD无明显保护作用。

【关键词】细菌脂多糖

　　细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性细菌细胞壁结构中的类脂多糖，广泛存在于人和动物的消化道内〔1〕。

LPS引起的胚胎吸收、宫内胎儿死亡（intrauterinefetaldeath,IUFD）和早产已经得到证实〔2〕。

本课题组前期研究发现，母鼠妊娠晚期接触LPS引起胎儿宫内生长发育迟缓（intrauterinegrowthretardation，IUGR）和骨骼发育迟缓，活性氧（ROS）可能参与了LPS引起的胚胎发育毒性〔3,4〕。

抗坏血酸（AA）是重要的水溶性抗氧化剂，本文重点探讨AA对LPS引起小鼠IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓的保护作用。

　　1材料与方法

　　11试剂细菌脂多糖（EschericlSiacoliLPS,serotyoe0127：

B8）和抗坏血酸（ascorbicacid，AA）（美国Sigma公司）。

　　12动物及实验方法清洁级ICR小鼠（7～8周，雄性30～32g，雌性26～28g）（北京维通利华实验动物公司）。

实验前适应性喂养1周（自由饮食，昼夜均衡，温度20～25℃，湿度（50±5）%。

交配时，按2∶4（雄∶雌）于21：

00合笼，次日7：

00检查雌鼠阴栓，查到阴栓者定为妊娠第0d。

分2个实验。

实验1：

孕鼠随机分为单纯LPS处理组，LPS+AA预、后和预+后处理组及对照组，所有孕鼠均于妊娠第15～17d给药。

单纯LPS处理组仅注射LPS（75μg/kg，ip）；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前05h给予AA（500mg/kg，ip）；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA（500mg/kg,ip）；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前05h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。

所有孕鼠于妊娠第18d处死，记录活胎、死胎、吸收胎数和流产数，秤量活胎体重，测量身长和尾长，并评价活胎鼠骨骼发育情况。

实验2：

分组同实验1，每组11只，所有孕鼠均于妊娠第16d给药。

单纯LPS组仅注射LPS（75μg/kg，ip）；LPS+AA预处理组孕鼠注射LPS前05h给予AA（500mg/kg，ip）；LPS+AA后处理组孕鼠注射LPS后3h给予AA（500mg/kg，ip）；LPS+AA预+后处理组孕鼠注射LPS前05h和后3h各给予500mg/kg的AA；对照组给予等容量生理盐水或AA。

LPS处理后6h处死孕鼠，取母肝、胎肝和胎盘，检测丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）水平。

　　13氧化应激水平测定用Griffith法〔5〕测定组织GSH含量。

通过测定脂质过氧化的羰基产物MDA含量反映组织的氧化应激水平，MDA含量测定采用硫代巴比妥酸反应底物（TBARS）比色法〔8〕。

蛋白含量用Lowry法〔7〕测定。

　　14统计分析采用SPSS120统计软件进行方差分析和两样本t检验。

　　2结果

　　21AA对LPS引起IUFD的影响单纯LPS处理组平均每窝死胎数显着高于对照组［（01±11）与（82±20），P001］，LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显着低于单纯LPS处理组［（31±45）与（82±20），P001］。

LPS+AA后处理组（54±63）和预+后处理组（62±52）平均每窝死胎数与单纯LPS处理组（82±20）比较差异无统计学意义（P005）。

　　22AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响（表1）母鼠妊娠晚期给予LPS引起胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌（趾）骨骨化不全；AA预处理、后处理和预+后处理均显着抑制LPS引起枕骨、后掌（趾）骨骨化不全。

　　23AA对LPS引起IUGR的影响（表2）母鼠妊娠晚期给予LPS显着降低活胎体重、身长和尾长，AA预处理、后处理和预+后处理均显着抑制LPS引起IUGR。

　　表1AA对LPS引起骨骼发育迟缓的影响

　　注：

e枕骨评分：

1=正常，4=上枕骨未见骨化点；与对照组比较，aP005，bP001；与LPS组比较，cP005，dP001

　　表2LPS和AA对宫内胎儿生长发育迟缓的影响

　　注：

与对照组比较，bP001；与LPS组比较，dP001

　　24AA对LPS引起组织MDA水平升高的作用（表3）母鼠妊娠晚期给予单剂量LPS，母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显着升高（P001）。

LPS+AA预处理组母肝、胎肝和胎盘组织MDA水平显着低于单纯LPS处理组（P001）；LPS+AA后处理组胎肝和胎盘组织MDA水平明显低于单纯LPS处理组（P005），但母肝组织MDA水平与单纯LPS比较，差异无统计学意义（P005）；LPS+AA预+后处理组母肝和胎盘组织MDA水平显着高于LPS+AA预处理组（P001）。

　　表3AA对LPS引起MDA升高的作用

　　注：

与对照组比较，bP001；与LPS组比较，cP005，dP001；与LPS+AA预处理比较，eP001

　　25AA对LPS引起组织GSH降低的影响母鼠给予单剂量LPS，母肝、胎盘和胎肝组织GSH含量分别为（225±21），（370±160），（124±12）nmol/（mgprot），显着低于对照组（P001）。

AA处理后，母肝、胎肝和胎盘组织GSH水平进一步降低。

　　3讨论

　　本研究结果显示，母鼠妊娠第15～17d经腹腔给予LPS，平均每窝死胎数显着增加。

此外，LPS显着降低活胎平均体重、身长和尾长，并延缓胎鼠枕骨、胸骨、尾椎骨、前指骨和后掌（趾）骨骨化。

结果表明，母鼠妊娠晚期接触LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。

进一步研究发现,LPS+AA预处理组平均每窝死胎数显着低于单纯LPS处理组，AA预处理显着抑制LPS引起活胎平均体重、身长和尾长下降，并逆转LPS，引起的枕骨骨化不全。

这些结果提示，AA预处理明显减弱LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。

AA是重要的水溶性抗氧化剂。

文献资料证实，AA能直接清除机体产生的氢氧自由基（·OH）和超氧阴离子自由基（O-·2），预防氧自由基引起的氧化性损伤〔8〕。

本研究发现，AA预处理显着抑制LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化。

结果提示，AA预处理可能通过清除LPS刺激机体产生的ROS，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓。

最近研究发现，AA具有双向作用，在有氧微环境下可通过自氧化反应产生去氢抗坏血酸负离子自由基（A-·）、O2-·和过氧化氢（H2O2）〔9〕，过多摄入AA或机体处于有氧状况下可诱导氧化应激并引起机体氧化性损伤〔10,11〕。

本研究结果显示，AA后处理和预+后处理对LPS引起母肝、胎肝和胎盘组织脂质过氧化的拮抗作用显着弱于AA预处理。

进一步观察发现，AA后处理和预+后处理显着减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。

综上所述，AA预处理通过抑制LPS引起的氧化应激，预防LPS引起IUFD、IUGR和骨骼发育迟缓；AA后处理和预+后处理显着减弱LPS引起IUGR和骨骼发育迟缓，但对LPS引起IUFD无抑制作用。

【参考文献】

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　　〔5〕Griffith　ofglutathioneandglutathionedisulfideusingglutathionereductaseand2vinylpyridine［J］.AnalBiochem,1980,106:

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