细胞凋亡的几种检测方法.docx

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细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法

1、    形态学观察方法

（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：

凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

（2）丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：

活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

（3）台盼蓝染色：

如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。

如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。

此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

（4）透射电镜观察：

可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、    DNA凝胶电泳

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。

但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带

3、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。

核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

检测步骤

1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；

2、在微定量板上吸附组蛋白体’

3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘

4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’

4、加酶的底物，测光吸收制。

用途

该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。

可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。

该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。

3、    流式细胞仪定量分析

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。

利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。

应用价值

流式细胞仪检测具有以下特点：

1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确

2）、可以做许多相关性分析

3）、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期

（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法

细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。

（2）DNA片断原位标记法

凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。

DNA片段原位标记法有二种：

1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT）技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端

2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。

研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。

（3）检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法

原理：

在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。

磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。

因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。

故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。

结果判断：

正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。

应用价值：

细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin

V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。

又Annexin

V联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。

因此，Annexin

V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

方法及步骤

A.    直接标记抗体（FITC标记抗体）：

（1）  收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。

（2）  用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。

加2mlPBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。

（3）  用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。

加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗体（5×105个细胞/20ul抗体）的PBS,避光冰上放置30min,离心弃上清。

加入200ul1%多聚甲醛固定，待测即可。

（4）  用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。

B.未标记抗体间接免疫荧光标记法：

（1）收集2×106个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min。

（2）用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2mlPBS重悬细胞，800rpm离心5min；

（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。

（4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。

（5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。

（6）加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。

（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。

C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：

（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。

（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。

（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。

（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNaseA终浓度为20微克/毫升。

培养细胞染色体显示法

（1）    传代培养细胞染色体显示法

培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片

1．培养细胞：

取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。


2．加秋水仙素：

使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6～10小时；或用低温封闭法：

把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后，再于37℃温箱继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）。


3．采集分裂细胞：

可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。

应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。


4．离心：

收集培养液，1000转/分钟离心5～10分钟。


5．低渗处理：

吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液，在温箱中静置20～30分钟。


6．预固定：

向悬液中加新鲜1：

3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。


7．固定：

离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟。


8．重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。


9．制片：

用滴片法制片，按如下步骤：

彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。

滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。

滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。

如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。


10．染色和封片：

一般常用Giemsa染色：

取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。

如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。

（2）人末梢血微量全血培养染色体显示法
1．培养液准备：

取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH7.2），内含：

1640培养液（含10％～15％小牛血清），PHA0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升培养液
2．抽血针管准备：

取2～5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100U/mlBBS）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。


3．采血：

用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1～2ml。

无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。


4．培养和加秋水仙素：

37℃温箱中培养到60～72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液，再培养4～6小时。


5．低渗：

1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075MKCl溶液10ml，置温箱中低渗处理15～20分钟。


6．其余步骤与处理传代细胞法相同。


（3）羊水细胞培养
1.抽取羊水：

无菌抽取羊水10-20ml，立即注入无菌离心管
2.离心分离：

1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml.
3.培养：

加培养液4ml（含小牛血清1ml），用NaHCO3调PH至6.8，置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。


4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。


一般染色体制片程序
1、  取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。


2、  将培养基换成10mlDMEM（H）+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。


3、  将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。

当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。


4、  将上清液倒掉，剩余50ul左右的液在管中，并轻微震动，使细胞沉淀重新悬浮。


5、  加入10ml的低渗液（0.075MKCL），第一毫升要逐滴加入，并边加边摇晃。


6、  37℃水浴中低渗30min。


7、  再加入1ml冰冷的固定液（甲醇：

乙酸=3：

1的混合液），并马上摇匀，离心，1000r/min、10min。


8、  同步骤4。


9、  加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。


10、  室温下固定30min，然后离心，1000r/min、10min。


11、  同步骤4。


12、  加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。


13、  室温下固定15min，然后离心，1000r/min、10min。


14、  重复步骤11~13一次。


15、  将离心后的上清液倒掉，并加入50~100ul的新鲜固定液重悬细胞。


16、  滴片（玻片要求是湿冷的干净的，滴片高度要大于30cm。

玻片倾斜角度15~30度左右）
17、  镜检。



（六）细胞的冷冻保存与复苏（慢冻速溶）
•    当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：

细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。

      
•    如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。


•    在细胞冻存时加入保护剂，能大大提高冻存效果。


•    常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。


细胞冻存方法


（1）、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）、配制冷冻保存溶液（使用前配制）：

将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合  均匀，置于室温下待用。

（预先配制冻存液：

含20%血清培养基，10%DMSO加基础培养基）
（3）、按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；
（4）、将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
（5）、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；
（6）、按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
（7）、再冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。


冷冻保存方法1:

冷冻管置于4oC40分钟→-20oC30分钟→-80oC16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。


注意点：

（1）    细胞在-20度冰箱不能超过1h，以免冰晶过大破坏细胞，可跳过-20直接到-80，这样细胞活率低点。

（2）    DMSO稀释时会放出大量热，不可直接加到细胞液中要提前配制。


（3）    DMSO必须时细胞培养级别的，新买的本身是无菌的，第一次开瓶后立即少量分装于无菌瓶中，4度保存，避免反复冻容产生有毒物质。


  细胞复苏（要点动作要快，轻）
  

（1）、调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；


（2）、从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
（3）、将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液，轻轻吹打混匀；
（4）、将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
（5）、向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。


注意点：

（1）注意安全，以防冷冻管爆炸，带手套用镊子将冷冻管取出，不可用手。

（2）解冻时，液面不可超过冻存管面，以防污染。