最新发酵工程复习资料.docx

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最新发酵工程复习资料

第一章

1发酵和发酵工程的概念

发酵

狭义：

利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动，来制备微生物菌体或其代谢产物的过程。

广义：

凡是培养细胞（动、植物和微生物细胞）来制得产品的过程。

发酵工程

研究发酵工业生产过程中，各个单元操作的工艺和设备的一门科学

2、发酵工程研究的内容

※发酵工业用生产菌种的选育：

◆自然选育◆诱变育种◆基因工程育种

※发酵条件的优化与控制

※生物反应器的设计

※发酵产物的分离、提取和精制

3、发酵类型

1按发酵产品的类型划分

2按发酵工艺是否需氧划分

※厌氧发酵：

如酒类发酵、酒精发酵、丙酮丁醇发酵、乳酸发酵和甲烷发酵

※通风发酵：

如酵母菌生产、抗生素发酵、有机酸发酵、氨基酸发酵和酶制剂生产等

3按发酵工艺培养基的状态划分

※固态发酵：

发酵是在固体状态下进行。

主要应用于传统酿造业。

※液态发酵：

发酵是在液体状态下进行，是目前发酵工业所采用的主要工艺。

4、发酵工艺培养方法

发酵工艺培养方法有：

固态发酵工艺和液态发酵工艺

1固态发酵工艺※固态薄层发酵※固态厚层（通风）发酵

2液态发酵工艺

※液态表面发酵（浅盘发酵）工艺

※液态深层通风发酵（Submergedfermentation）液态深层通风发酵是指在无菌条件下，在

液体培养基内部进行微生物培养，获得产品的过程。

它包括向发酵罐中通入大量无菌空气、搅拌使空气均匀、培养基灭菌和无菌接种。

液态深层通风发酵是发酵工业使用的主要工艺。

5、分批发酵，分批补料发酵

分批发酵（batch-process）：

在生物反应器内投入限量培养基后，接入微生物菌种进行培养，完成一个生长周期，获得产品的微生物培养方法。

是目前传统发酵工业所采用的主要发酵形式。

在分批补料发酵：

发酵的开始投入一定量的培养基，在发酵过程的适当时期，开始连续补加碳或（和）氮源或（和）其他必需基质，直至发酵液体积达到发酵罐最大操作容积后，将发酵液一次放出，这种操作方式称为补料分批发酵。

这种发酵方式能保持较高的活菌体浓度，目前，基因工程菌发酵常采用此方法

第二三章节

1、发酵工业常用的微生物的种类，主要的发酵产品。

发酵工业常用的微生物有细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。

细菌：

1、枯草杆菌与中性蛋白酶和α-淀粉酶；2、乳酸杆菌、双歧杆菌与酸奶、微生态剂；

3、醋酸杆菌与醋酸；4、棒状杆菌与谷氨酸5、大肠杆菌与基因工程受体菌；

6、目前正在研究和开发的重要细菌代谢产物枯草杆菌与溶栓酶；大肠杆菌与天冬酰胺酶

放线菌：

是一类呈分枝状生长，主要以孢子或菌丝体繁殖的单细胞原核型丝状微生物，是抗生素的主要生产菌，目前发现的近万种抗生素中，80%来源于放线菌。

如链霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、金霉素、土霉素、放线菌素D、红霉素、螺旋霉素、白霉素、制霉菌素等。

酵母菌：

是单细胞真核微生物，形态多种多样，个体大小差异较大，大多以出芽方式繁殖发酵后能形成多种代谢产物和自身含有丰富的蛋白质、维生素和酶

霉菌：

？

2、微生物的营养物质及生长和繁殖的条件

一、微生物的营养物质

1水：

细胞组成成分和进行生化反应的介质2碳源：

细胞和代谢产物中碳素骨架，能源

3氮源：

细胞和代谢产物中氮素来源4生长因子：

核酸和辅酶的组成成分

5无机元素：

酶的组成成分或维持酶的活性，调节渗透压、氧化还原电位。

6气体：

参与细胞新陈代谢过程。

二、微生物的生长和繁殖的条件

1、营养物质：

水、C源、N源、生长因子，矿质元素。

2、pH值：

通常细菌、放线菌在中性；酵母、霉菌在偏酸性条件下生长

3、温度：

通常细菌最适生长条件为370C；放线菌、酵母、霉菌在280C生长

4、湿度：

5、气体：

CO2、O2等

3、微生物纯培养生长曲线及在发酵工业中的应用

A、迟缓期（适应期）

特点:

※生长速率等于零※细胞合成新的成分适应新的培养基或别的培养条件

※细胞形态变大或变长※对外界不良环境敏感

实际意义：

※种龄:

1对数期“种子”，迟缓期较短；2迟缓期或衰亡期“种子”,迟缓期较长

※接种量：

1接种量大，迟缓期较短；2接种量小，迟缓期较长；

※培养基成分:

1培养基成分丰富的，迟缓期较短培养基

2成分与种子培养基一致,迟缓期较短

B、对数生长期

影响因素：

※菌种：

不同菌种的代时差异极大※营养物浓度：

影响微生物的生长速率和总生长量※培养温度：

影响微生物的生长速率※营养成分：

营养越丰富，代时越短

对数期的实践意义

※代谢、生理研究的良好材料※增殖噬菌体的最适宿主菌龄

※发酵生产中用作“种子”的最佳种龄※因工程菌发酵要尽量延长对数期

C、稳定期

特点：

※细胞生长速率为零;

※活细胞总数维持不变，即新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，菌体总数达到最高点。

※细胞生理上处于衰老，代谢活力钝化，细胞成分合成缓慢，G+染色发生变化

稳定期的实践意义

※发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期※导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改

※某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段，某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；

D、衰退期

特点：

※细胞以指数速率死亡，有时细胞死亡速率降低是由于抗性细胞的积累；

※细胞变形退化，有的发生自溶，G+染色发生变化。

影响衰亡期的因素及实践意义

※菌种的遗传特性有关:

有些细菌的培养经历所有的各个生长时期，几天以后死亡,有些细菌培养几个月乃至几年以后仍然有一些活的细胞；

※营养物质和有毒物质有关：

补充营养和能源以及中和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细菌培养物的存活时间

3、初级代谢产物和次级代谢产物的定义。

1初级代谢产物的定义：

微生物代谢产生的，并且是微生物生长与繁殖所必需的代谢产物

初级代谢产物种类：

有机酸、氨基酸、核苷酸、蛋白质（包括酶）、多糖、核酸等

2次级代谢产物的定义：

微生物代谢产生的，与微生物生长与繁殖无明确关系的代谢产物；

种类包括：

抗生素、激素、毒素、色素、信息素、生物碱等。

5、微生物合成次级代谢产物的基本特征。

A、次级代谢产物具有种属特异性B、次级代谢产物在菌体稳定期合成

C、次级代谢产物不少是结构相似的混合物D、次级代谢产物合成受多基因调控

6、提高次级代谢产物产量的方法。

A、补加前体类似物如青霉素生产补加苯乙酸能增加青霉素G；加苯氧乙酸得到青霉素K。

B、加入诱导物如加蛋氨酸能增加头孢霉素C的产生；加巴比妥可提高利福霉素产量

C、防止碳分解产物的阻遏或抑制：

如限量流加法发酵

D、防止氮分解产物的阻遏或抑制如限量氮源

E、选育耐前体物质的突变株、耐抗生素的突变株、毒性的突变株、营养突变株

第四章菌种选育

1、微生物纯种分离方法有哪些？

1、固体稀释平皿倾注法（混菌法）最常用的微生物纯种分离方法

2、涂布分离法3、平板划线分离法

4、单细胞挑取法5、组织分离法

6、利用选择培养基分离法7、其他方法

2、从自然界中分离和筛选微生物菌种的步骤

1.定方案：

首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。

2.采样：

有针对性地采集样品。

3.增殖：

人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。

4.分离：

利用分离技术得到纯种。

5.发酵性能测定：

进行生产性能测定。

这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

3、诱变育种和分子育种的定义。

诱变育种的含义

应用微生物遗传和变异理论，用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅度提高,然后采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株,以供生产实践或科学研究用

分子育种的含义

分子育种（分子克隆、基因工程）是分子水平上的育种方法。

根据需要，用人工的方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移到受体细胞使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传形状。

4、原生质体融合定义及主要步骤

定义用脱壁酶（细菌和放线菌用溶菌酶，酵母和霉菌用蜗牛酶和钎维素酶）去除微生物的细胞壁，制成原生质体，用聚乙二醇促进原生质体融合，从而获得异核体的这一技术叫原生质体融合。

步骤

①标记菌株的筛选:

营养缺陷型和抗药性标记

②原生质体的制备：

脱壁酶脱壁

③原生质体的融合：

聚乙二醇促进融合

④原生质体的再生：

再生培养基培养再生壁

⑤融合子的选择：

选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。

⑥生产性能筛选。

5、试述柠檬酸菌种分离和诱变育种的主要过程

6、菌种衰退的含义及菌种复壮的方法。

菌种的衰退：

生产菌株几乎都是人工诱变变异株，都是代谢调控失控菌株，遗传特性很不稳定，极易发生自然变异。

因此，在使用和保藏过程中，生产菌株会逐渐向不利于生产方向发生变化，这种变化称为菌种的衰退

方法A、纯种分离：

选取典型性状的单菌落

B、淘汰衰退个体

C、选择合适的培养条件

第五、六章培养基、灭菌

1、葡萄糖（转化）值（DE）；

DE值：

表示淀粉糖的葡萄糖组成，是指糖化液中的还原糖（以葡萄糖计）的含量占干物质的百分率。

DE值＝{还原糖（葡萄糖）含量（％）/干物质含量（％）}X100％

2、淀粉水解糖的生产工艺；

生产工艺有酸法、酶法、酸酶法三种

淀粉水解过程存在三种主要反应：

一是水解为葡萄糖；二是水解成葡萄糖后重新复合成异麦芽糖等复合糖；

三是葡萄糖分解生成5-烃甲基糖醛及酸丙酸色素物质。

酸水解

1200C以上盐酸或草酸

淀粉乳———————高温液化——————酸水解

其中盐酸的水解淀粉能力高，但酸法水解缺乏专一性，同时产生复合反应，温度愈高,复

合反应愈多，生成的有色物质多，颜色深，用酸量多，需中和碱量大，因之产生的灰分也多。

酸水解法淀粉乳的浓度不能太高一般淀粉含量在18％～20％（Bx10～12）,温度120～1500C

酶法水解

A－淀粉酶液化B－糖化酶糖化

淀粉——90～950C——寡糖——55～600C——葡萄糖

具有高度的专一性，副产物少，纯度高，糖色浅，与酸法相比，可以转化较高浓度的固

形物，淀粉乳淀粉含量在34％～40％（Bx18～20），提高效率，减少损耗，降低成本，所得母液还可以利用，而且在常温常压下进行，设备工艺都比较简单。

酸酶法

投料浓度，淀粉乳淀粉含量在34％～40％（18～20Bx）为酸法的两倍，节省费用，缩短

时间，DE值（糖化率）可达96%，纯度高，糖液色浅，容易结晶析出，用酸量少，仅为酸法的20%，产品质量高。

（注：

有先酸后酶法和先酶后酸法两种）

3、发酵培养基筛选原则；

总体原则：

根据微生物化学组成成分以及微生物生长和繁殖条件所需营养物质（水、C源、N源、生长因子以及pH值、温度、湿度、气体等）首先确定培养基C/N比，再用正交试验确定原材料的浓度的配比。

具体做到：

1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

2）有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。

3）有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

4）有利于提高产物合成速度，缩短发酵周期。

5）尽量减少副产物形成，便于产物的分离纯化。

6）原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

7）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。

8）有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。

4、培养基配制中各成分的定量方法；

理论计算法

设微生物生长和产物形成化学方程式为:

碳源和能源+氮源+其他所需物质→细胞+产物+CO2+H20+热量

将该方程进行定量表达,就可对培养基进行经济设计,计算出得到一定量菌体所需营养物质的最小量。

5、发酵过程灭菌对象包括那些；

为了保证培养过程的正常进行,防止染菌的发生,对大部分微生物的培养,包括实验室

操作和工业生产,均需要进行严格的灭菌。

工业上,培养基、发酵设备一般都采用蒸汽灭菌,而对空气则采用过滤的方法除菌，

6、培养基分批（间歇）灭菌概念及过程；

概念：

将配制好的培养基输入发酵罐内，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后，

维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度。

分为升温、保温和冷却三个阶段

7、发酵工业常用空气除菌的方法。

1、加热灭菌：

用蒸汽、电能、空气压缩过程中产生的热量进行灭菌。

2、静电除菌其原理是含有灰尘和微生物的空气通过高压直流电场,气体产生电离,产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体,载电体被捕集于电极上，达到除菌的目的。

吸附于电极上的颗粒、油滴、水滴等须定期清洗,以保证除尘效率和除尘器的绝缘效果

3、介质过滤除菌：

用一种介质将空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。

介质过滤除菌是目前发酵工业中最常用空气除菌方法。

第七、八章种子培养、工艺控制

1、种子的扩大培养概述及一般过程

菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序,该工序又称为种子制备。

将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁（茄子）瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

这些纯种培养物称为种子。

2、影响种子质量的因素

1、培养基2、培养条件3、种龄4、接种量

孢子质量的因素

1、培养基2、培养温度和湿度3、培养时间和冷藏时间4、接种量

3、发酵过程的主要控制的理化参数有哪些。

目前较常测定的参数有温度、罐压、空气流量、搅拌转速、pH、溶氧、效价、糖含量，前体（如苯乙酸）浓度、菌体浓度（干重、离心压缩细胞体积%）等。

不常测定的参数有氧化还原电位、粘度、排气中的O2和CO2含量等。

4、影响发酵温度变化的因素及其控制。

因素1、生物热（Q生物）：

菌体生长繁殖产生的热；

2、搅拌热（Q搅拌）：

搅拌时，液体与液体之间、液体与设备之间摩擦产生的热；

3、蒸发热（Q蒸发）：

排除气体引起水分蒸发所需的热。

4、发酵过程热量可用以下公式表示：

Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发

温度的控制

1、发酵最适温度的选择：

所谓最适温度是指在该温度下最适合菌的生长或产物的合成。

对不同的菌种和不同的培养条件以及不同的酶反应和不同时生长阶段，最适温度应有所不同。

在发酵的整个周期内菌体生长和发酵的最适培养温度是不相同的。

适合菌生长的温度不一定适合产物的合成。

温度的选择还要参考其它发酵条件应灵活掌握。

例如通气条件较差的情况下，最适的发酵温度也可能比在正常良好通气条件下低一些。

这是由于在较低的温度下，氧溶解度相应大些，菌的生长速率相应小些从而弥补了因通气不足而造成代谢异常。

选择温度时还应考虑培养基成分和浓度。

在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高培养温度则养料往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，使抗生素产量降低。

2、温度控制方法

夹层通入温水或冷却水来调节温度

5、控制pH方法。

1、将培养基调配成菌体生长和发酵产物产生的最适pH；

2、先将培养基调配成菌体生长的最适pH，再发酵的过程中通过补料的方法来调节发酵的最适pH，如加氨水、酸、碱；补加氮源如尿素等都可以达到稳定的pH作用。

6、影响供养的因素。

1、空气的流速（通风量）：

指每分钟内单位体积发酵液通入空气的体积，是需氧发酵主要控制参数之一。

一般控制在0.5～1.0v/vmin范围内,即1：

0.5～1vvm。

2、罐压：

发酵过程中发酵罐维持的压力。

罐压的高低还与氧和CO2在培养液中的溶解度有关。

一般控制在0.05～0.10mp范围内。

3、搅拌：

搅拌形式、搅拌转速；4、发酵液的粘度

5、发酵液的理化性质6、泡沫：

7、空气的分布：

8、发酵罐的结构：

（最主要是搅拌转速和通风量）

7、补料分批培养、作用及适用范围。

1、补料分批培养的含义：

是指在分批培养过程中，间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。

2作用1、可以控制抑制性底物的浓度，使底物浓度保持在发酵最适浓度范围；

2、可以解除或减弱分解产物对代谢过程的阻遏；

3、可以使发酵过程最佳化。

3适用范围1、高菌体浓度培养即高密度培养系统；

2、存在高浓度底物抑制系统，特别是用甲醇、苯酚等作底物的系统；

3、受代谢物阻遏的系统

4、希望延长反应时间的系统

8、发酵过程中泡沫对发酵的影响和消除的方法

影响1、使发酵罐装量减少；2、大量逃液，导致产物的损失；

3、泡沫顶罐，培养基从搅拌轴封渗出，增加了染菌的机会；

4、影响通气搅拌的正常进行，造成发酵异常；

5、使微生物菌体提前自溶，又使更多泡沫产生；

6、迫使加入消泡剂，这将对发酵工艺和产物的提取带来困难。

消除泡沫的方法

1）机械消泡：

通过机械强烈振动或压力变化

2）消泡剂消泡：

消泡剂为表面活性剂，主要有油脂类、高碳醇、脂肪酸、聚醚类、硅酮类等

第九、十章测定、发酵研究的一般过程

1、生物传感器的组成、类型（按识别元件）及特点

生物传感器一般有两个组成部分：

其一是分子识别元件（感受器），其二是信号转换器（换能器）。

当待测物与分子识别元件特异性地结合后，所产生的复合物（或光、热等）通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号等，从而达到分析监测的目的。

按所用分子识别元件的不同，可分为：

酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细

胞器传感器、免疫传感器等；

特点？

2、产物得率和转化率的概念

1．得率（或产率，转化率Y）：

包括生长得率（Yx/s）和产物得率（Yp/s），是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。

2、转化率：

往往是指投入的原料与合成产物数量之比。

3、工业发酵过程研究的一般规律

1、实验室研究：

菌种的选育、培养基的组成成分和发酵最适条件的研究；

2、中试规模：

确定菌种培养和发酵的最佳工艺条件；

3、工厂规模：

规模化生产，取得经济效益。

通常又可将它们称为小试、中试、工业

性试验

4、发酵过程实验室研究的内容

1、研究菌种保藏方法；

2、研究菌株在固体培养基上培养和繁殖条件；

3、考查培养基最适组成；

4、实验室规模的培养条件。

5、摇瓶发酵概念

摇瓶试验：

在一定大小的三角瓶中（150ml、250ml、500ml）装入一定量的培养基，配上瓶塞，经灭菌后接入菌种，在摇瓶机上进行震荡培养，一定时间后，取出分析培养液中有关参数和产物得量。

由于这种方法能在短期内可获得大量的数据，所以被广泛应用于实验室研究。

6。

最佳配方的确定

第十一章现代发酵技术

1、用于工业发酵的工程菌应具备的条件；

1）菌株最好是分泌型的；

2）发酵产品是高浓度、高转化率和高产率；

3）能利用常用的碳源，并可进行连续发酵；

4）发酵温度适当，发酵所产生热量和需氧量都较低；

5）代谢控制容易进行；

6）菌株是不致病的；

7）重组的DNA稳定，DNA不易再发生重组、突变和质粒脱落。

（重要条件）

2、提高工程菌培养中质粒的稳定性方法；

（1）培养方法：

采用两阶段培养法,第一阶段先使菌体生长至一定密度,第二阶段诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因未表达,从而减小了重组菌与质粒丢失菌的比生长速率的差别,

增加了质粒的稳定性。

在培养基中加入选择性压力如抗生素等,以抑制质粒丢失菌的生长,

也是工程菌培养中提高质粒稳定性的常用方法。

（2）采用适当的操作方式

调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度等，可以提高菌株质粒的稳定性。

这是因为有些含质粒菌对发酵环境改变比不含质粒菌反应慢,因而通过间歇改变培养条件可以改变这两种菌的比生长速率，达到改善质粒稳定性作用。

例如表达干扰素ω大肠杆菌随着稀释率增加,质粒稳定性增加,干扰素比效价明显增大

3、基因工程菌培养发酵的特点；

1、培养装置：

摇瓶、10～200L发酵罐；

2、培养基：

合成培养基，氮源主要有酵母提取物、蛋白胨、碳源主要为甘油；

3、加入诱导剂如异丙基－β－D-硫代半乳糖苷（IPTG）等，诱导工程菌表达；

4、质粒必须稳定：

5、采用高密度发酵工艺

高密度发酵是指工程菌在短时间内迅速分裂增殖，菌体密度迅速升高，在短时间获得高

浓度的菌体的发酵工艺。

与传统发酵工艺比较，发酵周期可缩短一半以上，而菌体产量和产物表达量是非高密度发酵的10～50倍，表达产物的生理活性也可提高2～4倍。

4、实现高密度发酵应采取的措施；

1、选择合适培养基：

1）选择容易被工程菌利用的营养物质2）选择较高浓度的培养基

2、培养方式

（1）分批补料（流加式培养）

（2）补料时间和培养基的量

3、发酵期间溶氧的控制密度发酵通风量一般在0.9～1.1vvm，搅拌速度500rpm以上，需保持9O%以上的溶氧饱和度。

同时，还要考虑通风和搅拌速度的增加，对泡沫和发酵液粘稠度的影响。

4、其他因素如ph值等

5、基因工程菌培养发酵的一般步骤。

以TNF-α（肿瘤坏死因子）大肠杆菌工程菌生产TNF-α为例

1、菌株：

TNF-α工程菌，含氨卞青霉素抗性基因

2、仪器设备：

恒温振荡摇床；10L发酵罐；分光光度计；高速冷冻离心机

3、培养基：

1）发酵培养基（g/L）：

蛋白胨240g，酵母膏120g，甘油40ml，KH2PO412g，K2HPO4122.5g。

2）补料培养基（g/L）：

甘油170，酵母膏71，蛋白71。

4、发酵类型：

高密度分批补料发酵

5、培养发酵

1）菌种活化:

保存菌种在含Amp100mg/L的平板上划线分离获得单菌落，取平板上单菌落接种到含Amp100mg/L的LB培养基中（4OmL/250mL三角瓶）,37，190r/min摇瓶培养过夜。

2）三角瓶种子：

按4%接种量接种到含Amp100mg/L的LB培养基中（10OmL/500mL三角瓶），220r/min，370C培养6小时作为发酵用种子；

3）发酵罐发酵

（1）培养基的配制及灭菌：

10L体积的发酵罐,装7L发酵培养基,121℃高压灭菌20min。

温度降到100℃以下，设定搅拌转速150r/min,通气量0.9～1.0vvm。

（2）接种及发酵：

冷却后,恒温37℃,将转速和通气设定为搅拌转速250r/min,通气量1.0vvm，

为100%。

调试好各发酵参数。

接种700mL己预培养好的种子菌液，进行发酵

培养。

（3）诱导表达：

发酵2h左右，发酵液OD600约0.80，加入IPTG至终浓度为20μmol/L,继续发酵培养5h，发酵4～5h后开始提高转速,每0.5小时提高大约50r/min,至发酵停止时达到大约500r/min,发酵过程中根据菌体生长和溶氧变化情况及时调整。

4）菌体收集

发酵完毕后，4℃4000r/min离心10min,收集菌体,用生理盐水洗涤2～3次，-20℃保

存备用。

5）发酵过程中的分析

菌体浓度测定：

OD测定：

用分光度计测定OD600重量测定：

发酵菌液经5000r/min离心30分钟，称菌体湿重，650C烘至恒定，称细胞干重。

OD值、菌体湿重、细胞干重之间的关系通常为：

一个单位的OD值约为干菌0.4g/L，1g湿菌体相当于0.2g干菌体。

第十二章