海大1号长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研.docx

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海大1号长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研

海大1号”长牡蛎新品种四倍体的诱导及单体牡蛎培育模式的优化研

前言

　　牡蛎又称海蛎子，蚝等，是一种世界性分布性的贝类，在大多数海域都有分布，牡蛎营养丰富肉质细嫩被赞誉为"海中牛奶";，牡蛎富含蛋白质、胆固醇、钙、铁维生素等营养成分，深受人们的喜爱，是重要的养殖贝类，我国具有广阔的海上疆域，拥有长达18000km的海岸线，广阔的海区条件和丰富的饵料使我国的贝类资源丰富，并为我国贝类养殖业的发展提供了良好的条件，我国的牡蛎养殖业可以追溯到宋代的插竹养殖，经过多年的发展牡蛎养殖已成为是我国养殖业的重要组成部分，我国的牡蛎养殖业发展已经较为成熟，自然海区的半人工采苗和工厂化室内人工育苗为牡蛎养殖业提供了充足的苗种供应，筏式养殖滩涂播养等养成技术保证了成体牡蛎的供应，消费者的认同保证了牡蛎的销路，牡蛎养殖业创造了巨大的经济效益和社会效益，但是随着养殖业的蓬勃发展，种质衰退、海区自然资源减少、养殖海区污染，引种混乱，发展路线低端牡蛎单位价值较低等问题日益凸显，制约了我国牡蛎养殖业的发展。

培育出生长更快，风味更好，抗逆能力更强的养殖新品种成为解决上述问题的理想方法。

2014年3月24日，农业部公布了第五届全国水产原种和良种审定委员会审定通过的15个水产新品种，由中国海洋大学水产学院贝类遗传育种研究室培育的长牡蛎"海大1号";获得了水产新品种证书。

长牡蛎"海大1号";是我国培育的第一个牡蛎新品种，填补了我国牡蛎良种培育的空白，对实现海水养殖良种化，推动牡蛎养殖业持续、稳定、健康发展将起到重要促进作用。

"海大1号";是来以从山东乳山海区养殖的长牡蛎为基础群体，使用群体选育的方法经过连续6代选育而成的，主要的选育指标是生长速度和壳形，该新品种具有生长速度快、壳型规则等特点，在相同的养殖条件下，15月龄平均壳高比普通长牡蛎苗种提高16.2%，总湿重提高24.6%，出肉率提高18.7%，壳形较美观，整齐度明显的高于普通商品长牡蛎，由于其生长快、个体大、壳形规则的特点，一经推广就被养殖户广泛接受，创造了良好的经济效益。

但是在繁殖季节，由于牡蛎的性成熟及精卵的排放会导致牡蛎的生长停滞，肉质下降等问题，在繁殖过后，又会因为体质虚弱导致大量死亡，影响了牡蛎在繁殖季节的口味和产品供应，而由于三倍体牡蛎的育性差，不会出现类似的情况（王昭萍等，2000；曾志南等，1999；），可以弥补传统二倍体牡蛎养殖过程中在繁殖期出现的问题，同时三倍体牡蛎生长速度较快，个体较大可以缩短养殖周期具有较高的经济价值（王昭萍等，1998；胡庆明等，1997；曾志南等，1999AllenSKandDowningSL；StanleyJGetal1984；DavisJP，1989），目前可以通过多种理化方法直接诱导牡蛎三倍体，常采用的化学诱导剂有6-二甲基氨基嘌呤、细胞松弛素B、咖啡因等，或者使用温度休克法或水静压等物理方法诱导，但是大多数方法三倍体诱导率无法达到100%，而且直接诱导获得三倍体的方法不稳定，诱导过程易受到外界环境以及操作者水平的影响,各种理化处理方法还会对受精卵的存活产生影响，影响幼虫的孵化。

而且三倍体牡蛎不能进行自群繁殖，想要获得三倍体苗种需要进行重复操作，工作量较大。

对此理想的解决方法就培育出四倍体牡蛎，理论上四倍体牡蛎和正常的二倍体牡蛎杂交可以获得100%的三倍体后代（GuoXetal，1996；阙华勇等，2003王昭萍等，2004），而且四倍体牡蛎可以正常繁殖,可以建立稳定的四倍体群体（施坤涛等，2006）,可以更加简单有效的获得三倍体，有利于三倍体贝类的产业化推广。

　　由于养殖环境、品质等因素,我国的牡蛎价格相对较低,仅为国际市场价格20%左右，为了提高牡蛎的经济价值，人们逐渐开始关注单体牡蛎的养殖，单体牡蛎具有形状规则，大小均匀，方便收获、加工和运输的优点，而且单体牡蛎可以充分的利用水体，方便控制养殖密度，目前,国际上发达国家的牡蛎养殖主要采用单体牡蛎养殖的方式,而我国单体牡蛎的研究起步相对较晚，单体牡蛎发展较为缓慢，单体苗种的供应和配套的养殖设施和技术都不甚完善。

本次实验将以"海大1号";长牡蛎新品种为研究对象，通过多种方式，探讨"海大1号";长牡蛎新品种四倍体的诱导方式，为海大1号长牡蛎新品种的多倍体育种提供理论依据，同时实验以肾上腺素诱导获得的对海大1号长牡蛎新品种单体牡蛎稚贝为实验材料，从培育密度、水循环方式等方面入手寻找一种适宜的单体养成模式，提高单体牡蛎稚贝的存活率和生长速度。

　　第一章文献综述

　　第一节"海大1号";长牡蛎新品种四倍体的诱导

　　1贝类育种的研究现状

　　为了创造更高的经济效益，解决牡蛎养殖业中暴露出来的一系列问题，科研工作者一直致力于具有优良性状的新品种的培育和推广，目前常见的新品种培育手段有选择育种技术、杂交育种技术、雌核发育育种技术、雄核发育育种技术、多倍体育种技术等。

　　选择育种技术：

选择育种又称系统育种，是一种最基本的育种方法，通过对原始品种进行有目的有计划的反复淘汰选择，选择出性状可以稳定遗传的符合人们需要的新品种，是以现有品种在繁殖过程中的自然变异作为原始材料的育种方法。

在贝类选择育种研究方面选择的目标大都是选择出生长快速、规格大、抗逆性强、外形美观的品种。

我国比较成功的选择育种的案例主要有包振民等选育出的栉孔扇贝新品种"蓬莱红";，李琪教授选育的长牡蛎新品种"海大1号";等。

　　杂交育种技术：

杂交育种指不同种群、不同基因型个体间进行杂交，并对其杂种后代进行培育和选择最终育成新品种的方法。

杂交育种是一种经典的育种方法，其应用非常广泛，在农作物方面全球约有90%的育种是杂交育种近年来国内外的专家做了大量的工作，取得了一定成果，1995年Heath研究发现虾夷扇贝和西北盘扇贝的杂交后代的抗派金氏虫病能力较强，吕豪开展了大连湾牡蛎和太平洋牡蛎杂交的实验，实验结果证明两种牡蛎间的杂交是可行的（吕豪等，1994）。

　　雌核发育育种技术：

雌核发育是指用遗传失活的精子激活卵，卵仅靠雌核发育成胚胎的现象，精子并不参与合子的形成，因为这种胚胎只有正常个体一半的染色体，所以胚胎并不能正常存活，但通过抑制极体的释放或者抑制卵裂的方法等可以使细胞核核恢复到正常的染色体，从而可以正常的存活，雌核发育技术中主要使用紫外线照射使精子的遗传物质失活，通过雌核发育得到的二倍体是纯合的，有利于快速的建立高度纯合的品系，因此受到了科学家的关注。

雌核发育育种技术在鲶鱼、罗非鱼、真鲷等经济鱼类中取得了成功，在贝类中雌核发育的研究相对滞后，但也取得了一些成果，李琪等成功诱导出了太平洋牡蛎雌核发育二倍体。

但是人工诱导牡蛎雌核发育得到的幼虫存活率较低，培养至成体的难度较大。

　　雄核发育育种技术：

与雌核发育相似，雄核发育是卵子失去遗传活性仅靠精子的遗传物质进行发育的方式，诱导后可以通过抑制第一次卵裂获得可存活的二倍体个体，也可以通过两个精子融合获得二倍体个体在贝类中，雄核发育的诱导研究已经在长牡蛎和栉孔扇贝中开展，但是没有获得可以成活的雄核发育二倍体。

　　多倍体育种技术：

多倍体通常指体细胞中含有三个或三个以上染色体组的生物个体，真核生物形成配子时进行减数分裂，得到四个染色体数目减半的配子，贝类的精子在排放时已经完成了整个减数分裂的过程，但是卵子并没有完成整个减数分裂的过程，在排放时一般处于减数第一次分裂的前期或中期，在受精后才能继续进行减数分裂，最终才能受精，这一特殊现象为贝类的多倍体育种操作提供了可能性。

　　目前贝类多倍体育种的研究已经取得了很大的进展（GuoXandAllenSK，1994a；GuoXandAllenSK，1994b；StanleyJGetal，1981；ShenYPetal，1993，QuilletE,PanelayPJetal，1986；NellJAetal，1995；MasonKMetal，1988；ChaitonJAetal，1985；KomaruAandWadaKT，1989），诱导技术也日渐成熟，目前贝类三倍体主要通过各种理化学方法来抑制受精卵第二极体的释放获得，化学诱导方法主要是使用细胞松弛素B、6-二甲氨基嘌呤、咖啡因等化学诱导剂，常用的物理诱导方法有温度休克法和水静压化学方法，在太平洋牡蛎（王昭萍等，2000；AllenSKetal，1986；YamamotoSetal，1988；AllenSKandBushekD，1992，于瑞海等，2002a；于瑞海等2002b；于瑞海等，2003；AkashigeSandFushimiT，1992；隋锡林等1997；田传远等，1998；田传远等，2000；田传远等，1999a；田传远等，1999b；田传远等，1999c；田传远等，1999d；王菊生等，1999；于瑞海等，1994；于瑞海等，2001）、美洲牡蛎（StanleyJGetal，1981）、近江牡蛎（杨春玲等，1981）、大连湾牡蛎（梁英等，1994）、栉孔扇贝（王清印和杨爱国，2000，王子臣等，1990；杨爱国等，2000）、虾夷扇贝（王昭萍等2009；常亚青等2001a；常亚青等2001b）僧帽牡蛎（曾志南等，1994）皱纹盘鲍（AraiKetal，1986；顾勇杰等2010）多等种贝类中这些诱导方式都有被研究，但是这些诱导方式都存在一定的缺陷，而四倍体牡蛎和二倍体杂交可以产生三倍体，理论上讲这种方式可以获得100%的三倍体后代，而且操作简便易行，避免了使用理化处理对胚胎造成的不良影响，理论上讲可以为贝类三倍体产业化提供一条简便易行的途径，但是这种方法需要培育贝类四倍体，人们对贝类四倍体育种的研究比贝类三倍体的研究要晚,贝类四倍体的诱导难度也更大。

1988年,Stephens等通首次过抑制太平洋牡蛎受精卵第一极体的释放获得了四倍体幼虫（StephensLBandDowningSL，1988），而后国内外学者对太平洋牡蛎、美洲牡蛎（SupanJEetal，2000）、栉孔扇贝、近江牡蛎（AllenSKetal，2003；容寿柏等，1992）、虾夷扇贝、合浦珠母贝（孙振兴等，1998）、贻贝（蔡国雄，1996）、地中海贻贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍（孙振兴等，1998）、食用牡蛎（GendreauSandGrizelH1990）等10余种贝类进行了四倍体育种研究，虽然在实验中都获得了四倍体胚胎或幼虫,但有四倍体成体存活的仅在栉孔扇贝、地中海贻贝、和菲律宾蛤仔中有报道（王昭萍等，2004）。

1994年,Guo和Allen成功的获得了存活的四倍体太平洋牡蛎（GuoXandAllenSK，1994），他们对之前诱导四倍体失败的原因进行了分析，并尝试利用太平洋牡蛎三倍体的卵子与正常精子受精后抑制第一极体来诱导四倍体，最终获得了成功,并将四倍体与二倍体杂交生产全三倍体的方法应用于生产中。

此后,利用这种方法又在合浦珠母贝和美洲牡蛎（GuoXetal，2002）中培育出存活的四倍体。

　　2贝类多倍体育种原理

　　一般情况下，贝类都是二倍体生物，既体细胞内包含有两个染色体组，而多倍体指体细胞中含有多个染色体组的个体，通常使用物理或者化学方法改变正常二倍体受精卵的染色体组数目，经过发育后获得多倍体。

贝类的精子在排放时己经完成了整个减数分裂过程,而卵子在排放时一般停止在第一次减数分裂的前期或中期，并没有完全完成减数分裂,只有在受精后才会完成剩余的减数分裂过程，完成两个极体的释放、雌雄原核的融合，然后进入第一次有丝分裂阶段，正是卵子的这种独特的减数分裂过程为贝类多倍体育种操作提供了有利的时机和条件。

　　基于贝类独特的减数分裂过程人们可以方便的通过抑制极体的释放来影响受精卵体内染色体的行为方式获得贝类多倍体，除抑制极体的释放外还可以通过各种理化手段抑制卵裂、细胞融合，人工雌核发育等方式影响细胞内的染色体数获得多倍体。

　　2.1抑制受精卵第一极体的释放：

　　抑制第一极体的释放会导致第二次减数分裂过程中染色体行为的复杂化，会产生三倍体、四倍体、非整倍体的个体，以太平洋牡蛎为例，抑制第一极体的的释放后，在随后的过程中染色体分离有以下几种方式：

联合二级分离；随机三级分离；非混合三级分离；独立二级分离。

　　2.1.1联合二极分离：

两组二分体联合成一体以二级分离的方式进行减数第二次分裂，20条染色单体以第二极体的形式被排出，另外20条染色单体保留在细胞核中。

其结果是产生了MI三倍体。

　　2.1.2随机三极分离：

染色体分离过程中会形成三个纺锤体，两组二分体合成一群后被随机的分成三组，每组6至7个，在第二次减数分裂中期三组二分体分布在三极纺锤体的三个分裂面上，随后进入减数第二次分裂后期，至末期时每一极都接受来自相邻两组的二分体分离出来的染色单体，最后最靠近卵子边缘的染色体组作为第二极体排出，导致了非整倍体的产生。

　　2.1.3非混合三级分离：

分裂过程中形成三个纺锤体，两组二分体在进入三极分离之前不结合或者重叠，其中一组二分体等分到两个靠近边缘的分裂面中另外一组二分体位于靠近内侧的分裂面中仍然保持在一起，其中一套染色单体可能移动到边缘一极作为第二极体被排出，其余的母本染色体和父本染色体结合而形成四倍体。

　　2.1.4独立二级分离：

分裂过程中形成四极纺锤体，两组二分体各自以二极分离方式独立进入第二次减数分裂，到第二次减数分裂末期时所有染色体被均分到四个极，然后排出不定数目的染色体作为第二极体，将会导致二倍体、三倍体、四倍体的产生。

　　2.2抑制受精卵第二极体的释放：

　　抑制受精卵第二极体的释放后，染色体的行为相对简单，可以使受精卵保留一组额外的染色体，产生三倍体个体。

　　2.3抑制卵裂：

　　使用理化方法抑制受精卵的卵裂，使已经完成染色体加倍的细胞不能分裂，从而产生多倍体贝类。

　　2.4细胞融合：

　　使用物理或化学物质对细胞进行处理，使其细胞膜融合成为一个细胞，最终会产生多倍体贝类，通常以聚乙二醇作为细胞融合剂，或者通过电脉冲等方式诱导细胞融合。

　　2.5人工雌核发育：

　　雌核发育是指用遗传失活的精子激活卵，卵仅靠雌核发育成胚胎的现象，精子并不参与合子的形成，因为这种胚胎只有正常个体一半的染色体，所以胚胎并不能正常存活，但是可以将其和其他化学方式结合，通过抑制极体的释放或者抑制卵裂的方法使获得多倍体贝类，通常使用紫外线、Y射线辐射处理或甲苯胺兰、乙烯脲、二甲基硫酸盐等化学物质处理使精子染色体失活。

　　3贝类多倍体常用诱导方法

　　贝类多倍体的诱导研究主要集中在如何获得三倍体和四倍体两方面，通过各种理化方法干预受精卵的发育过程从而获得预期的效果。

贝类三倍体诱导的研究已经相对成熟，而对于诱导四倍体的研究起步相对较晚。

　　3.1贝类三倍体的诱导方法：

　　3.1.1化学方法：

采用能够抑制分裂的化学物质来干预细胞分裂的过程，从而获得预期的效果，常用的化学药品有细胞松弛素B，6-二甲氨基嘌呤，咖啡因等。

　　细胞松弛素B（CB）：

真菌的代谢产物，一般认为细胞松弛素B可以特异性的破坏微丝，抑制细胞的分裂，一般认为细胞松弛素B的有效的使用浓度是0.5-1.0mg/L，处理时间一般为10-15min，一般溶解到0.1%的二甲亚砜中使用，虽然细胞松弛素B可以有效的诱导贝类三倍体但是因为其是剧毒物质有一定的致癌性所以在生产上已经禁止使用。

　　6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）：

嘌呤霉素的类似物，是一种蛋白质磷酸化抑制剂，可以作用于特定的激酶，破坏微管的聚合中心，使微管无法形成。

一般认为6-DMAP的适宜浓度范围为300-450umol/L，处理持续时间10-20min，因为6-二甲基氨基嘌呤毒性较低且易溶于水，被认为是能够替代细胞松弛素B的诱导剂。

　　咖啡因：

细胞分裂过程中构成纺锤丝的微管对Ca2+浓度非常敏感Ca2+浓度极低或者高于10-3时会引起微管二聚体的解聚，阻止分裂。

一般认为咖啡因的有效浓度为5-15mmol/L,处理时间10-15min。

　　秋水仙素：

秋水仙素不会影响合子或细胞内染色体的复制和分离,但是它可以抑制微管的组装过程,并且会使已有的微管解聚,这样就阻止了分裂过程中新纺锤体的形成并破坏己经形成的纺锤体,使得细胞的染色体加倍而不分离从而获得多倍体。

　　3.1.2物理方法：

常用的物理方法包括温度休克法和水静压法，近年来王昭萍等又发现了采用渗透压诱导同样可以诱导产生多倍体。

　　温度休克法：

温度休克包括冷休克和热休克两种，温度休克可以引起细胞内酶构型的变化，从而影响酶促反映的进行，使分裂过程中形成纺锤丝所需要的ATP供应途径受阻，影响细胞的分裂,由于温度休克法成本较低、操作相对简单,经常被用于多倍体的诱导。

　　水静压：

使用液压机等加压设备对处理对象施压，可以阻碍纺锤体微管和微丝的形成，抑制细胞的分裂。

　　低渗诱导：

是近年来提出的诱导多倍的方法，通过将处理对象放置到低渗环境中的方法抑制细胞的分裂，王昭萍等认为低渗可能会引起能量代谢的紊乱，影响微管微丝的形成，可以组织极体的释放从而形成多倍体。

　　姜卫国等诱导合浦珠母贝多倍体的研究表明，在实验所设的范围内，使用细胞松弛素B诱导三倍体适宜的处理时间为15min左右，适宜的处理浓度为1.2-2.0mg/L，各个实验组的结果表明在水温27.9℃-29.9℃的环境下，受精后3min使用浓度为1.2-2.0mg/L细胞松弛素B处理受精卵15min时可以获得的三倍体率为40.4-47.2%，但是处理后的受精卵孵化率较低，低于8%，在水温为28℃的环境中在受精后17min进行诱导时，使用1.2mg/L的细胞松弛素B诱导15min就可以获得76.8%的三倍体率（姜卫国等，1987）。

李永仁等在使用细胞松弛素B抑制第二极体释放从而获得菲律宾蛤仔三倍体的实验中发现：

0.5mg/L与0.75mg/L细胞松弛素诱导率较高，分别达到89.4%和89.2%，实验过程中以极体释放的比率为参考确定诱导时机和时间，在对照组受精卵出现第一极体的比例达50%时加入细胞松弛素B处理，处理至对照组出现第二极体的受精卵比例达到50%止，实验发现细胞松弛素B浓度和胚胎发育速度呈负相关，与各发育阶段的畸形率呈正相关，综合考虑下认为0.5mg/L是诱导菲律宾蛤仔三倍体的适宜浓度。

林岳光等人研究发现使用0.5mg/L的细胞松弛素B抑制华贵栉孔扇贝第一极体的释放时可以获得44.1%的三倍体，而抑制第二极体的释放可以获得90.2%的三倍体。

杨蕙平等使用细胞松弛素B诱导虾夷扇贝多倍体的研究表明在0.6mg/L的细胞松弛素的作用下，通过抑制第一极体获得了3.96%的三倍体，同时抑制第一极体和第二极体的释放获得的三倍体率为2.42%，实验过程中出现了大量的五倍体和非整倍体。

秦艳平等对香港巨牡蛎的研究表明在温度28~30℃，盐度为15-25，受精卵密度为2x108时，采用0.5mg/L的CB在受精后15~18min处理，诱导持续时间为20min，可产生100%三倍体。

李霞等人对细胞松弛素B，咖啡因，6-二甲基氨基嘌呤诱导皱纹盘鲍多倍的机理进行了研究，实验中使用的药物浓度分别为细胞松弛素0.5mg/L，6-二甲基氨基嘌呤90umol/L，咖啡因50mmol，诱导时间分别为20min、15min、10min，在染色观察诱导处理后染色体行为的过程中发现了联合二级分离、独立二级分离等分离方式，可以诱导产生三倍体。

容寿柏等人分别使用冷热休克的方法诱导获得了近江牡蛎的三倍体，其中低温休克温度为10℃，高温休克温度为35℃，在受精后25min开始诱导，诱导处理20min，获得的三倍体率分别为69%和64%，严正凛等利用冷休克规模化诱导杂色鲍三倍体时，在受精后15min后处理，处理温度为13.5-14℃，处理持续时间为10至15min，这些组合中获得稚贝在两年的检测中三倍体率分别为51.7%和70%，诱导九孔鲍时使用的组合为处理时间13.5min，处理温度为13-13.5℃处理持续时间为15-18min，稚贝阶段两年的三倍体率分别为54.5%和63.3%，田传远等采用低温休克诱导太平洋牡蛎三倍体时发现，采用4-5℃的处理温度，在授精15min之后处理15min可以获得较好的诱导效果，三倍体诱导率为36.8%AraiK等对皱纹盘鲍的研究表明，在受精之后12min或者32min使用3℃冷休克诱导处理15min或者使用35℃诱导处理15min都可以抑制第一极体或者第二极体的释放获得三倍体，或者在受精后7min或22min后使用200kg/cm2的压力抑制极体的释放也可以获得三倍体。

　　3.2贝类四倍体的诱导方法：

　　贝类四倍体诱导所用的方法和三倍体诱导的原理大致相同，都是通过各种理化手段改变受精卵内的染色体数，然后经过胚胎发育获得四倍体个体。

　　在初始研究阶段人们试图通过直接通过抑制第一极体、同时抑制两个极体的释放、抑制第一次卵裂、细胞融合和人工雌核发育等方法由二倍体贝类直接诱导获得四倍体贝类,这些方法都能诱导出四倍体的胚胎或者幼虫但是培育出存活的四倍体少有报道。

　　1988年Stephers等首次使用1mg/L的细胞松弛素B诱导太平洋牡蛎四倍体获得了四倍体幼虫，诱导率达91%。

Scarpa等在地中海贻贝受精后7min到35min的时段内使用1mg/L的细胞松弛素B进行处理，同时抑制了第一极体和第二极体的释放获得了18%的四倍体，并且在一个月之后的检测中仍检测到了四倍体。

Gendreau等在诱导欧洲食用牡蛎四倍体时，使用细胞松弛素浓度为1mg/L，处理时间为20min，分别选在受精后5min及260min进行诱导处理，分别的获得了40%和53%的四倍体率。

田传远等在使用6-二甲基氨基嘌呤诱导太平洋牡蛎四倍体的过程中发现，人工授精20min后，使用450umol/L的6-二甲基氨基嘌呤处理10min后可获得40%的四倍体诱导率。

常亚青等在研究虾夷扇贝四倍体的过程中使用了多种化学物质进行实验，实验采用观察正常受精卵发育情况的方法确定诱导时机及诱导时间，实验发现使用细胞松弛素B、A-二甲基氨基嘌呤秋水仙素抑制第一次卵裂诱发四倍体的比例低于25%,使用细胞松弛素B在抑制第一极体可有效的产生四体，在12℃时在授精后20-22min开始处理在62-67min终止处理可以获得56.5%的四倍体率。

杨蕙萍等使用细胞松弛素B诱导栉孔扇贝四倍体时发现在20℃的条件下，卵子受精后10min，分别诱导10min、20min抑制第一极体的排出获得的四倍体率为39.75%和30.24%，在授精后1h分别处理10、15、20、25min以抑制第一次有丝分裂获得的四倍体率分别为21.36%、27.57%、28.41%、29.35%，XimingGuo等使用0.5mg/L的肾上腺素诱导美洲牡蛎四倍体时，从受精后10min开始处理，处理至受精后30min成功的获得了四倍体，容寿柏等人研究了使用温度休克抑制第一次卵裂来诱导近江牡蛎四倍体的方法，实验结果表明冷休克组的最佳诱导温度为10℃，热休克组以39℃为最佳，获得的早期胚胎的四倍体率分别为30%和28%，Guo等利用35-40℃的温度通过抑制第一次卵裂的方式成功的获得了45%的四倍体。

Guo等使用聚乙二醇（PEG）为融合剂,利用细胞融合的方法诱导太平洋牡蛎四倍体,结果表明:

合子间融合的效果较好,但是四倍体比例较低，精子间融合效果不理想，2细胞分裂球间的融合产生了30%的四倍体,但是未能成活（GuoXandHershbergerWK，1988）。

包振民等利用PEG和脂质体进行了皱纹盘鲍的合子融合实验,获得的四倍体率分别为25%和12%（包振民，199