凝胶固定技术的生物组织传感器研究doc 10页.docx

凝胶固定技术的生物组织传感器研究doc 10页.docx

《凝胶固定技术的生物组织传感器研究doc 10页.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《凝胶固定技术的生物组织传感器研究doc 10页.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

凝胶固定技术的生物组织传感器研究doc10页

凝胶固定技术的生物组织传感器研究（doc10页）

部门：

xxx

时间：

xxx

整理范文，仅供参考，可下载自行编辑

基于溶胶－凝胶固定技术的生物组织传感器

宣俊陈利兴许长流

（中山大学化学与化学工程学院2000级，广州51027500）

指导老师：

蔡沛祥教授

摘要：

报道一个关于制备生物组织传感器的新技术，将溶胶－凝胶与植物液汁按一定比例结合，使天然植物中的多酚氧化酶被固定于溶胶－凝胶中，将其滴涂于预先涂有一层Nafion膜的铂盘电极表面，构成带有Nafion－溶胶凝胶－植物液汁的复合修饰膜的生物传感器，用于测定神经递质多巴胺。

采用循环伏安法和线性扫描伏安法考察了传感器的电化学特性,比较了不同植物品种、不同组织位置的生物催化活性，研究了乙醇用量、水酯比、植物液汁用量等因素的影响，考察了Nafion膜的防干扰功能。

采用差示脉冲伏安法对多巴胺进行定量分析，线性范围为2ⅹ10-6～1ⅹ10-4mol/L,检出限为8.0ⅹ10-7mol/L。

与传统的组织电极相比，本传感器具有一系列特点。

关键词：

溶胶-凝胶，固定化技术，植物组织传感器，多巴胺

1、前言

多巴胺（DA）是人体一种重要的神经递质，其浓度的大小可直接引发起人体的一些精神性疾病。

如：

抑郁症、老年痴呆、帕金森等。

因此，为了更准确灵敏地检测多巴胺浓度的大小，人们从多方面对其进行研究。

生物传感器是化学传感器的一个分支。

生物传感器成功的关键是生物材料固定技术。

组织电极（包括植物组织电极、动物组织电极）是生物传感器的一种。

植物组织电极问世于八十年代初，是利用天然植物中存在的酶直接作为生物催化剂的一种生物传感器。

从文献可以看到，以往人们对植物组织电极的研究，从电极结构来看，主要有切片组织电极和碳糊电极两种类型。

切片的组织电极采用夹心面包式的物理固定法将植物组织切片固定，需要特定的基础电极（如O2电极、NH3电极等）作为转换器，组装时还需要在组织片与基础电极之间设置透气膜，在组织片外加上保护网等，电极的制作比较繁琐。

碳糊电极的制作比较简单。

只要将植物组织磨成浆，按一定的比例与石墨粉混合调成碳糊，填入电极杆下端，磨平后即可使用。

虽然碳糊电极制作简单，但是生物活性物质易从电极表面流失，而且碳糊在溶液中浸泡时容易松散脱落，更经不起搅拌时溶液的冲擦。

基于以上两种电极的存在问题，我们提出了关于植物组织电极固定生物材料的新技术——溶胶凝胶技术。

溶胶凝胶玻璃是由烷氧基硅烷（如Si（OCH3）4）或类似的有机金属烷氧化物（如异丙氧基钛或异丙氧基铝）在常温下水解和缩聚而成的透明的玻璃状物质。

网络结构的硅烷聚合物能包埋各种生物活性物质，并能让它们在孔隙中自由地移动或与孔隙内表面的硅醇基团进行某种程度上的相互作用。

溶胶凝胶材料具有物理刚性、化学惰性、高热稳定性和轻微溶胀性，它的低温聚合过程的特点更是有利于生物材料的固定。

实验中，我们对不同植物组织汁进行了比较实验。

结果发现在各种植物组织中，以苹果内部组织最好，且用同一根生物电极可多次重复检测不同浓度的待测样品，具有较好的实验研究价值。

2、研究内容

2.1仪器和试剂

CHI750A型电化学工作站（上海辰华仪器公司），超声波清洗器（明珠电器有限公司），

三电极系统：

所研制的多巴胺传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

正硅酸乙酯（TEOS，Aldrich公司），TritonX-100（Research公司），Nafion-117（5%的乙醇溶液，Fluka公司），盐酸多巴胺（DA，Sigma公司），盐酸多巴胺注射液（江苏林海药业有限公司制造分公司），盐酸肾上腺素注射液（EP，广州明兴制药厂），抗坏血酸（维生素C药片，AA，广东华南制药厂）。

以0.1mol/LNa2HPO4-0.1mol/LKH2PO4缓冲溶液（PBS，pH=7.4）为测试底液。

试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

2.2二氧化硅溶胶凝胶的制备

将60μLTEOS、410μL水、12μL0.1mol/LHCL和2滴TritonX-100混合，室温下超声振荡1h，使其形成均匀澄清的溶胶，然后在电冰箱中放置2～3h。

使用前用0.01mol/LNaOH中和约等于pH=7.4。

2.3多巴胺传感器的制备

将铂盘电极（ф1mm）在金相砂纸上打磨抛光，依次在HNO3（1:

1）、丙酮和双蒸水中超声清洗15min，清洗后的电极置于室温下晾干备用。

用微量注射器将5μL含体积分数为5%Nafion的乙醇溶液滴涂于电极表面，室温下晾干备用。

将100μL苹果汁加到已制好的二氧化硅溶胶中，充分振荡均匀。

用微量注射器吸取5μL苹果汁溶胶-凝胶，滴涂于已经用Nafion修饰的干燥的铂盘电极表面，室温下晾干待测。

2.4实验方法

电化学测量采用三电极系统，以所研制的植物电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极。

0.1mol/LNa2HPO4-0.1mol/LKH2PO4缓冲溶液（PBS，pH=7.4）为测试底液。

采用循环伏安法（CV）研究传感器的电化学特性，采用示差脉冲伏安法（DPV）对DA进行定量分析。

除另有说明外，实验所用的多巴胺溶液的浓度为CDA=1.05×10-3mol/L。

2.5实验原理

许多植物组织中都含有多酚氧化酶，它能催化多巴胺，在电极上氧化成醌式产物。

而氧化产物又能在电极上还原，当对电极进行电位循环扫描时可以获得多巴胺的氧化和还原电流峰。

实验表明用苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极对多巴胺溶液进行循环伏安法电位扫描时，得到氧化还原电流峰（图1，a,b），而不含植物组织的溶胶凝胶电极和裸电极所产生的CV曲线显得平缓（图1，c,d）。

又用苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极对PBS底液进行循环伏安法电位扫描，得到的CV曲线显得平缓（图1，e）。

从修饰电极对多巴胺溶液的循环伏安响应曲线可以看到，它的阳极峰电位是0.337V，阴极峰电位是0.154V。

证明苹果汁中的酶对多巴胺的电极过程起了催化氧化的作用。

图1多巴胺伏安图

aNafion-苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极对DA的响应

b苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极对DA的响应

c不含植物组织的溶胶-凝胶电极对DA的响应

d裸电极对DA的响应

eNafion-苹果汁-溶胶-凝胶修饰电极在PBS底液中

3、实验条件优化、选择及讨论

3.1植物组织的选择

（一）植物种类的选择

分别提取苹果、番茄、土豆、白菜、紫荆花、龙船花和琵琶果的液汁加入溶胶凝胶里面制成传感器，以循环伏安法观察响应电流，发现由以上各种植物制得的传感器都有响应电流，说明各种植物都含有能对多巴胺起催化作用的氧化酶。

测量数据如表1：

表1不同植物品种的催化效果比较

植物种类ipc/A

番茄2.588E-07

紫荆花3.475E-07

白菜3.926E-07

琵琶果4.218E-07

土豆6.358E-07

龙船花1.147E-06

苹果1.385E-06

从响应电流峰的高低来看，苹果和龙船花的提取液较适合作为研究对象，其他植物的提取液响应不够灵敏，而且有些植物（如土豆）提取不够方便，液汁中淀粉质过多，不利于溶胶凝胶对液汁中酶的包埋，影响修饰电极的使用。

而龙船花提取液虽然响应较好，但收集原料较困难，因此决定以苹果作为研究对象。

（二）苹果种类部位的选择

取两种不同种类的苹果：

香蕉苹果和红富士苹果，分别取其外、中、内层果肉做对比实验（表2）。

表2苹果中不同部位催化效果比较

苹果的不同部位ipc/A

香蕉苹果外层5.194E-07

香蕉苹果中层8.915E-07

香蕉苹果内层1.096E-06

富士苹果外层7.953E-07

富士苹果中层8.917E-07

富士苹果内层2.383E-06

红富士苹果提取液制得的修饰电极的响应峰电流普遍比香蕉苹果的高；而外、中、内层果肉提取液的修饰电极的响应依次增大，决定以红富士苹果的内层果肉作为植物组织液汁的来源。

3.2溶胶－凝胶配比的选择

（一）乙醇加入量的选择

在配制溶胶凝胶时加入乙醇量的多少与响应电流峰高低有关，通过对比实验，得到表3数据。

表3乙醇加入量对传感器性能的影响

乙醇加入量/μLipc/A

02.412E-07

201.402E-07

401.474E-07

乙醇量加得少，响应峰电流比较高，不加乙醇时的响应峰电流最高。

因此决定在配制溶胶凝胶时不加乙醇。

原因是乙醇会损害酶的活性。

（二）水酯比R的确定

水酯比R指凝胶中水和硅酯类量的比值。

据文献报道，水与硅酯的比值大于4时，能加速硅酯键的水解，易形成分子量大的网状聚合物，聚合物的空隙度和比表面积较大。

这类聚合物对生物活性物质的包埋与固定有利。

当比值小于4时，硅酯键水解不充分，易形成分子量小、链状的聚合物。

此时聚合物的网孔较小，不利于酶或蛋白质的固定。

当水酯比R在6～10的范围内，R值越大，酶的固定越好。

分别配置水酯比R为5～10的溶胶凝胶，制成传感器作平行测量对比如表4。

表4水酯比对传感器性能的影响

Ripc/A

47.637E-07

58.811E-07

61.042E-06

71.291E-06

81.184E-06

91.357E-06

109.634E-07

可见当R＝9时峰电流最大，决定采用这个比例。

（三）、溶胶凝胶中植物液汁包埋量的选择

向溶胶凝胶中加入苹果汁量的多少也会影响测定多巴胺的效果，苹果汁加入量的对比实验结果如表5。

表5苹果汁用量对传感器性能的影响

苹果汁加入量（占溶胶的比例）ipc/A

二分之一5.580E-07

三分之一7.329E-07

四分之一8.578E-07

五分之一1.039E-06

六分之一1.779E-06

八分之一1.234E-06

十分之一9.668E-07

在一定比例范围内，相应修饰电极的峰电流随苹果汁加入量的增多而增大，但苹果汁加得过多的时候相应的峰电流反而下降。

根据峰电流的高低决定苹果汁的加入量（V/V）为1/6（即若最后配得的溶胶凝胶体积为600单位，则所含苹果汁的量为100单位）。

3.3电位扫描条件的确定

（一）扫描速度的选择

讨论修饰电极工作时多巴胺在电极上的富集过程是靠扩散控制还是受吸附控制（因为若制备电极时所用苹果汁含淀粉质比较多时会出现吸附富集的现象）。

两种情况下扫描速度对峰电流的影响有所不同。

在不同的扫描速度下测得的实验结果见表6。

表6扫描速度的影响

v/Vs-1

v1/2

峰电流/A

0.050

0.22361

1.22E-06

0.075

0.27386

1.32E-06

0.100

0.31623

1.45E-06

0.125

0.35355

1.65E-06

0.150

0.38730

1.85E-06

0.175

0.41833

2.10E-06

0.200

0.44721

2.33E-06

可见峰电流与扫描速度的平方根的关系并不是正比关系，也就是说，多巴胺在电极上的富集是由吸附控制的。

本实验所选择的实验扫描速度为100mV/s。

（二）停留时间的影响

在进行阴极扫描之前，于0.6V下，停留时间对响应峰电流的峰高有影响。

设定不同停留时间（2s,5s,10s,15s,20s,25s）,分别测定同一多巴胺样品得表7数据。

表7静止时间对传感器性能影响

静止时间/s

ipc/A

2

6.059E-07

5

6.469E-07

10

7.214E-07

15

7.507E-07

20

7.551E-07

25

7.004E-07

停