译The Mammalian Doublesex Homolog DMRT1 Is.docx

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译TheMammalianDoublesexHomologDMRT1Is

哺乳类动物的同系物DMRT1是决定雄性生殖细胞进行有丝分裂还是减数分裂的关键转录基因

ClintonK.Matson,1,2MarkW.Murphy,1MichaelD.Griswold,3ShoseiYoshida,4VivianJ.Bardwell,1,5andDavidZarkower1,5,*

1DepartmentofGenetics,CellBiology,andDevelopment,andDevelopmentalBiologyCenter,UniversityofMinnesota,Minneapolis,

MN55455,USA

2Molecular,Cellular,DevelopmentalBiology,andGeneticsGraduateProgram

3SchoolofMolecularBiosciences

WashingtonStateUniversity,Pullman,WA99164,USA

4DivisionofGermCellBiology,NationalInstituteofBasicBiology,andDepartmentofBasicBiology,SOKENDAI,5-1Higashiyama,

Myodaiji,Okazaki,Aichi444-8787,Japan

5UniversityofMinnesotaMasonicCancerCenter,Minneapolis,MN55455,USA

*Correspondence:

zarko001@umn.edu

DOI10.1016/j.devcel.2010.09.010

摘要:

从有丝分裂到减数分裂的转换是生殖细胞发育的一个特性。

在哺乳动物，减数分裂的启动需要维甲酸（RA），它和stra8一样，是激发减数分裂的诱导物，但在雄性生殖细胞（精原细胞）中这种到减数分裂的转换是如何控制的到目前为止知之甚少。

在这里我们在小鼠中用条件性基因锁定检测了两性相关转录因子DMRT1在成年动物精子发生中所扮演的角色。

DMRT1的丢失会导致精原细胞过早的跳出细胞程序而进入到减数分裂。

因此，DMRT1决定雄性生殖细胞经历有丝分裂和分化还是减数分裂。

DMRT1的丢失在精原细胞中同样会导致支持细胞周期性基因表达的障碍。

DMRT1在精原细胞中限制RA的应答，直接抑制stra8转录，并且激活精原细胞分化因子sohlh1的转录，从而抑制了减数分裂同时促进了精原细胞的发育。

DMRT1通过协调精原细胞发育，有丝分裂扩增和减数分裂之间的关系，使得精原细胞能大量持续的产生。

引言：

生殖细胞是遗传的机构，提供代间的遗传链接。

为了去履行生殖细胞的角色，它必须能够进行有丝分裂而保留和扩大干（祖）细胞数量和进行减数分裂为配子形成减半的染色体。

进入减数分裂的时机和配子的数量在哺乳动物中是有性别特性的（HandelandSchimenti,2010）。

减数分裂在雌性中的胎儿时期就开始，并且每个胚胎生殖细胞能最多产生一个卵母细胞通过减数分裂。

减数分裂在雄性动物中在青春期开始，并且精子发生贯穿整个生殖周期。

精子发生分三个阶段：

一个是有丝增殖阶段，两个减数分裂的减少阶段，然后有一个精子发生的减数分裂后阶段。

增殖阶段包括精原细胞，该细胞是祖细胞，通过减数分裂前的有丝分裂保留而高度扩增。

这种扩增让数量少的精原干细胞能支持精子持续大量地产生。

在睾丸的曲细精管中，未分化的精原细胞存在于生精上皮，和基底膜毗连。

未分化的精原细胞包括单细胞（（As精原细胞，在稳定的精子发生阶段形成干细胞主要成分）和由2-16个细胞连接起来的精原细胞链（我们把这叫做Apr和Aa）（deRooijandRussell,2000;Nakagawaetal.,2010）。

精原细胞分化从未分化的A1期精原细胞开始，A1精原细胞是一个出现在伴随种属特异性的周期中的过渡性细胞，在小鼠中出现在8.6天（deRooij,1998）。

从A1精原细胞到B精原细胞需要经历五个额外的有丝分裂和分化。

B精原细胞分裂和分化到前细线期的精母细胞接着进入减数分裂（deRooijandRussell,2000）。

尽管生精上皮循环每8.6天启动一次，成熟的精子细胞需要35天的分化，包括了4轮的循环启动。

结果，发育的生殖细胞在胚层中积累叠加在精原细胞上。

在那些胚层上准确的细胞补充在周期循环中一直发生变化，让这些细胞的一部分进入独特的阶段（I–XII在小鼠）（HessanddeFranca,2008;Oakberg,1956;Russelletal.,1990）.VII阶段是尤其重要的阶段，该阶段未分化的精原细胞进入生精上皮周期并且开始分化（deRooij,1998）。

这个循环沿着曲细精管被非同步的激发；结果，独特的阶段呈现在管的不同位置，使得功能性的精子能持续产生。

支持细胞是曲细精管中仅有的体细胞并且在整个分化阶段包绕着生殖细胞，支持精子发生。

在整个生精上皮周期中，支持细胞呈现出周期性的基因表达（deRooij,1998），可能是为了满足周边生殖细胞代谢的需要和（或）指导生殖细胞发育。

在哺乳动物，从有丝分裂到减数分裂的转换需要RA。

这种转换的调节在胎儿的性腺中最好理解：

RA在胎儿卵巢中富集，通过激发RA减数分裂诱导物独立转录受体（包括stra8）来启动减数分裂（BowlesandKoopman,

2007）。

雄性动物通过睾丸表达CYP26B1来避免减数分裂，CYP26B1能编码P450酶可氧化RA成一些不活动的代谢物（Bowlesetal.,2006;Koubovaetal.,2006）。

RA信号调节三个雄性精子发生的时期。

维生素A（RA的前体）为受精所必须的，维生素A的耗竭（VAD）将精原细胞阻留并使其优先进入分化阶段（McCarthyandCerecedo,1952;Thomp-sonetal.,1964）。

将维生素A补充到VAD小鼠可以重新激活生精上皮在第VII期的循环（vanPeltanddeRooij,1990）。

和雌性一样，在雄性动物中RA通过激活stra8促进减数分裂，stra8在生精上皮循环的第VII期健康表达并进入减数分裂前细线期（Oulad-Abdelghanietal.,1996;Vernetetal.,2006a;Zhouetal.,2008b）。

在stra8突变小鼠，大部分精母细胞前细线期不能进入减数分裂（Andersonetal.,2008;Marketal.,2008），表明stra8和RA控制着从精原细胞的分化到减数分裂的转换。

在精原细胞出现较弱的RA依赖性stra8表达，和RA对精原细胞分化一致（Ghyselincketal.,2006;Koubovaetal.,2006;Zhouetal.,2008b）。

这些发现表明RA水平的变化和（或）RA的应答控制精原细胞分化和减数分裂的激活，需要强调的是，VII期有可能是RA信号活动的高峰期。

生殖细胞很可能在生精上皮循环中扮演着极其关键的角色，尽管生殖细胞和支持细胞的相关作用并没有明确。

支持细胞的相关基因在生殖细胞耗竭的性腺中持续表达，（Timmonsetal.,2002;Yoshidaetal.,2006）提示一个支持细胞的内在循环。

然而，当支持细胞的循环基因表达被RA受体（RARa的支持细胞）特异性删除时，生殖细胞继续循环（Vernetetal.,2006a）,表明他们也存在一个内在的循环。

内在的基因循环更强有力的证据来自对小鼠精原细胞到家鼠睾丸的移植；尽管有家鼠的支持细胞的存在，那些异种移植的小鼠精原细胞移到到家鼠的睾丸后遵循13天的小鼠循环而不是8.6天的家鼠循环（Francaetal.,1998）。

因此，生殖细胞对其循环的内在控制比支持细胞控制更占主导地位。

生殖细胞对生精上皮周期的内在控制很可能包括RA信号的调制。

精原细胞表达RA受体（Vernetetal.,2006b），培养外源性的RA引起他们分化和进入减数分裂（Dannetal.,2008）。

然而，在体外未分化的精原细胞不像B型精原细胞那样在第VII期进入减数分裂。

相反，一小团这样的细胞过渡到A1-differentiating精原细胞并且进入一个同样需要RA的细胞周期。

这些在同样的管周期特异的行为表明不同水平的RA应答。

在这里我们为保守性的转录因子DMRT1通过两个特异的机制去控制有丝分裂到减数分裂的转换和调节RA在未分化的精原细胞中应答提供证据。

DMRT1是一个性腺独特性的转录因子，该因子和无脊椎动物性别调制因子Doublesex和MAB-3相关（Raymondetal.,1998）。

人类丢失或移去DMRT1会引起性别逆转，并且DMRT1同系物为鱼鸟和两栖动物等有多种性别决定系统的物种所必需（Matsudaetal.,2002;Raymondetal.,1999;Smithetal.,2009;Yoshimotoetal.,2008;Zarkower,2001）。

在小鼠，DMRT1为支持细胞的分化和细胞周期，以及生殖细胞保持胚胎生殖细胞特性和形成幼稚的精原细胞所必需（Kimetal.,2007a;Krentzetal.,2009;Raymondetal.,2000）。

这里我们使用条件性基因筛选在小鼠中检测DMRT1在成年动物精子发生的作用。

我们发现DMRT1通过RA依赖性转录和特异性地抑制stra8强健的转录诱导在未分化的精原细胞中抑制减数分裂。

DMRT1同样通过激活精原细胞分化基因（包括Sohlh1）来促进精原细胞发育。

因此我们认为DMRT1调节精原细胞分化和有丝无丝分裂转换三者在机体内的平衡。

结果:

1.DMRT1表达贯穿于整个精原细胞发育

DMRT1在生殖细胞和支持细胞中均有表达，他们的表达从性腺原基（生殖脊）形成的时候开始（Leietal.,2007;Raymondetal.,1999）。

评价DMRT1在成年动物精子发生的作用，我们得先检测它在成年动物生殖细胞中的表达活性。

DMRT1在未分化的精原细胞（包括以As和Apr为主的GFRA1阳性细胞和由As,Apr和Aal整群组成的PLZF阳性细胞）表达。

当然，它在分化的精原细胞中也表达（c-KIT-阳性A1-4,Intermediate,andB）。

在生精上皮周期的第VI阶段，DMRT1在B精原细胞中出现，然而它在处于减数分裂前期（前细线期）的细胞（前细线期细胞形成于上皮周期的第VII阶段）和减数分裂以及减数后分裂的生殖细胞消失。

DMRT1在未分化的精原细胞中强表达而在分化当中的精原细胞表达较弱。

总之，DMRT1在精原细胞的整个有丝分裂时期都表达，但是在精原细胞开始分化时出现表达减弱并且在减数分裂启动时消失。

DMRT1在支持细胞中持续表达。

2.DMRT1在未分化的精原细胞中剔除导致精子发生紊乱

DMRT1在胚胎中剔除会阻碍生殖细胞优先发育成精原细胞，从而导致精子缺乏（Kimetal.,2007a;Krentzetal.,2009;Raymondetal.,2000）。

我们通过一个Ngn3-cre转基因（该基因仅仅在成年动物睾丸的未分化的精原细胞中激活）进行条件性的剔除DMRT1来绕过DMRT1在胚胎中的需求（Sadaetal.,2009;Yoshidaetal.,2004）。

我们用一个cre转基因的应答报告基因YFP来证实Ngn3-cre在支持细胞中并不表达。

少于0.5%的支持细胞表达YFP（3/653支持细胞）。

由于Ngn3-cre在未分化的精原细胞中激活（这些细胞表达E钙粘素），所以我们首先检测DMRT1在那些细胞上的表达情况。

和预期的一样，来源于条件性目的的睾丸（将来的突变体）有缺乏DMRT1的ECAD阳性的未分化的精原细胞。

由于Ngn3在大部分的处于稳定期的精原干细胞不表达（Nakagawaetal.,2010），这些应该持续的产生未剔除DMRT1的精原细胞的突变的睾丸在发育过程中会突变。

的确，我们发现，我们对低于6个月的睾丸分析证实突变精原细胞在持续产生。

Figure1.DMRT1IsExpressedinSpermatogoniaandSertoliCells,butNotinMeioticandPostmeioticGermCells

IFoftestesfrom28daycontroltestes.（AandB）SectionIFshowingDMRT1inGFRA1-positiveundifferentiatedspermatogonia（filledarrowhead;primarilyAsandApr,andasmallproportionofAal）,andSertolicells（openarrowheads）.

（CandD）SectionIFshowingDMRT1inPLZF-positiveundifferentiatedspermatogonia（filledarrowheads）,butnotpostmeioticcells（spermatids;‘‘PM’’）.Arrowsindicatedifferentiatingspermatogonium.OpenarrowheadindicatesSertolicell.

（EandF）Whole-mountIFofseminiferoustubulesshowingDMRT1inc-KIT-positivedifferentiatingspermatogonia.SC,Sertolicells.

（GandH）SectionIFofDMRT1atdifferenttubulestages.DMRT1-positivegermcellsinstageVItubules（G）aremainlytypeBspermatogonia.InstageVIItubules

（H）,thesehavebecomepreleptotenespermatocytesandnolongerexpressDMRT1（DMRT1-positivecellsareSertolicellsandAspermatogonia）.

（I）SectionIFshowinghigherDMRT1expressionintypeAspermatogoniarelativetotypeBspermatogoniaandSertolicells.Scalebars,20m.

（J）Schematicdiagramshowingprogressionofspermatogonialdevelopmentandexpressionofmarkersusedin（A–F）

突变的睾丸相对于正常的体型小而且生殖细胞的数量也大量减少。

这种减少可能是因为细胞的程序性死亡升高或精子发生的某些方面的缺陷导致的。

末端转移酶缺口末端标记（TUNEL）表明：

相对于1,2和6月的对照组，程序性死亡在突变细胞中并没有升高。

我们推断在突变睾丸中的生殖细胞数量减少并不是因为不不合适的细胞死亡。

尽管大部分曲细精管有生殖细胞，但任然有部分是空的，并且空的部分比较稳定。

因为Ngn3-cre活跃在小部分的精原干细胞中（Nakagawaetal.,2010;Yoshidaetal.,2004）,那些空的精管部分可能是由精原干细胞的丢失或祖细胞扩充减少（或两者同时作用）引起的。

Figure2.LossofDMRT1inEarlySpermatogoniaDisruptsSpermatogenesis

（A–D）Whole-mountanalysisofseminiferoustubules.ECADIFalone（AandB）andmergedwithDMRT1IF（CandD）.DMRT1-positiveSertolicells（withdarkspots）arenotaffectedbyNgn3-creconditionalmutation.Scalebars,20m.

（E–H）SectionIFstainingforpan-germcellmarkerTRA98andDAPIatlowmagnification（EandF;scalebars,50m）andhighermagnification（GandH;scalebars,20m）.

（IandJ）H&Estaining.Scalebars,100m.

（KandL）TUNEL.Arrowsindicateapoptoticcells.Scalebars,20m.

（MandN）PAS-Hstainingofadult（8weekold）testes.Insetsshowdarklystain-

ingelongatingspermatids.Scalebars,20m

3.突变生殖细胞的减数分裂启动不受控制

为了确定突变睾丸中的生殖细胞减少的原因，我们检测了精原细胞发生。

成年动物突变睾丸中精原细胞，精母细胞，和精子细胞，表明突变的生殖细胞能完全的减数分裂。

可是，在突变动物中出现高度非正常的减数分裂启动。

一般而言，stra8在精原细胞中低表达在精母细胞前细线期表达水平提高（Vernetetal.,2006a;Zhouetal.,2008a）。

然而让人惊讶的是，突变睾丸中有单个的，成对的以及链状的ECAD阳性并有高的stra8表达的精原细胞。

同样，在有生殖细胞的突变睾丸中所有的曲细精管都有强的stra8表达，而在对照组的精管中仅仅在第七期的精管中存在。

Figure3.PrecociousandUncontrolledMeioticInitiationinDmrt1MutantGermCells（A–D）Whole-mountIFstainingofseminiferoustubulesforECADandSTRA8.Arrowsindicateexamplesofsingle,paired,andaligneddouble-positivegermcellsfoundonlyinmutant.Scalebars,20m.（EandF）SectionIFforSTRA8andTRA98.ControltubulesatstageVIIareindicated（‘‘VII’’）.Whitedotsrepresentmutanttubuleswithgermcells.Scalebars,50m.

（G–N）SectionIF2hrafterBrdUlabeling.ArrowsindicateSTRA8-andBrdU-positivecellwithspermatogonialDAPImorphology.Scalebars,20m.（O–T）SectionIF24hrafterBrdUlabeling.InsetsshowBrdU-labeledSYCP3-positiveleptotenespermatocytesincontrolandsimilarcellsinmutant.Scalebars,20m.（U–Z）SectionIF8daysafterBrdUlabeling.InsetsshowBrdU-labeledpachytenespermatocyteswithSYCP3localizedtosynaptonemalcomplexes.Scalebars,20m.（AAandAB）Whole-mountIFofseminiferoustubulesforc-KIT.Barsindicatediametersofseminiferoustubules.Scalebars,50m

突变睾丸中stra8阳性生殖细胞的广泛存在可能反映了减数分裂启动不受生精上皮周期的支配或是由于周期阻滞和stra8阳性细胞的累积。

为了区分哪些可能性，通过brdu检测DNA增殖，我们设法去弄清楚高表达stra8的突变细胞是否是被分开的。

由于进入减数分裂，对照组的stra8阳性精母细胞在第七期时有高的brdu参合。

突变体stra8阳性细胞中同样有高的brdu参合，但实际上它的参合出现在所有有生殖细胞的细管中以及一些有未分化精原细胞特征形态的标签细胞中而不是在精母细胞的前细线期。

Brdu和stra8阳性细胞在检测中所有时期（从2周到6个月）的突变睾丸中大量存在表明这种细胞的存在是因为Ngn-3-cre在未分化精原细胞中保留的活性。

我们推断dmrt1在未分化的精原细胞中的丢失会引起不受控制的简述分裂启动而不是阻滞在分化阶段，进而不受生精上皮周期的控制。

为了证实突变精原细胞的不受调节的减数分裂启动会导致真正的减数分裂，我们追踪了突变细胞的命运。

24小时后，brdu标识的对照组和突变生殖细胞已经进入减数分裂作为前细线期精母细胞并且已经在核中聚集sycp3.7天后，对照组和突变的brdu标识的生殖细胞已经到达粗线期，sycp3位于联会复合体中。

这些数据表明，尽管精原细胞从先前的发育阶段进入减数分裂在生殖上皮周期中的不合适时期，但是他们能够正常的进入减数分裂的程序。

4.过早的减数分裂启动导致精原细胞缩短分化和增殖

对于精原细胞表达stra8的同时表现ECAD阳性（表明细胞分化）并且在一周内到达减数分裂时期表明有丝分裂增殖程序和精原细胞分化在突变睾丸中有可能被缩短。

这种通过突变细胞跳过发育阶段，在精原细胞分化开始的前或后严重的减少分化经院系胞的数量。

确确实实，对突变精管的总量分析表明分化的精原细胞被大量的耗竭。

我们通过数对照组和突变组的ECAD阳性和c-KIT阳性生殖细胞来证实这种耗竭。

ECAD阳性未分化的精原细胞在突变体中相对正常（149±6cells/mmtubuleinmutantversus116±7cells/mmincontrol;p=0.03），但是C-KIT阳性生殖细胞被大量的耗竭（735±156cells/mminmutantversus2030±162cells/mmincontrol;p=0.015。

）。

这些结果能够解释为什么生殖细胞数量在突变体中严重减少，尽管生殖细胞发育并没被抑制：

分化的精原细胞群落的扩增阶段被突变细胞跳过，他们过早的放弃精原细胞程序有有