黄山学院毕业论文王维 斑腿泛树蛙Polypedates leucomystax透明骨骼的制作及形态描述.docx
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黄山学院毕业论文王维斑腿泛树蛙Polypedatesleucomystax透明骨骼的制作及形态描述
本科毕业论文（设计）
（2013届）
题目
：
斑腿泛树蛙（Polypedatesleucomystax）
透明骨骼的制作及形态描述
学院
：
生命与环境科学学院
专业
：
生物技术
学生姓名
：
王维
学号
：
20909051056
指导教师
：
黄田
职称（学位）
：
讲师（学士）
合作导师
：
职称（学位）
：
完成时间
：
2013年5月25日
成绩
：
综合成绩：
等级：
黄山学院教务处制
学位论文原创性声明
兹呈交的学位论文，是本人在指导老师指导下独立完成的研究成果。
本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明确方式标明。
本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。
声明人（签名）：
年月日
目录
摘要……………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Ⅳ
英文摘要………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Ⅳ
1
引言………………………………………………………………………
1
1.1
斑腿泛树蛙基本特征………………………………………………
1
1.2
斑腿泛树蛙的生物学资料…………………………………………
2
1.3
斑腿泛树蛙在中国的分布…………………………………………
2
1.4
斑腿泛树蛙的分类地位……………………………………………
3
1.5
文献回顾……………………………………………………………
3
2
材料和方法………………………………………………………………
4
2.1
材料的选择………………………………………………………
4
2.2
器材…………………………………………………………………
4
2.3
药品的浓度及配制方法……………………………………………
4
2.4
制作步骤……………………………………………………………
4
3
结果………………………………………………………………………
5
3.1
制作斑腿泛树蛙透明骨骼标本……………………………………
5
3.2
斑腿泛树蛙骨骼结构………………………………………………
6
3.3
斑腿泛树蛙所有骨骼的测量结构…………………………………
7
4
讨论………………………………………………………………………
7
4.1
实验心得……………………………………………………………
7
4.2
透明骨骼的优点…………………………………………………
8
参考文献………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
8
致谢……………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………
9
斑腿泛树蛙（Polypedatesleucomystax）透明骨骼标本制作及形态描述
王维（20909051056）
导师：
黄田（讲师）
（黄山学院生命与环境科学学院，中国，黄山，245041）
摘要：
脊椎动物骨骼标本制作过程一般分为五大步骤：
动物的处死；肌肉的剔除；骨骼的脱脂；骨骼的漂白；骨骼的整形装架。
然而体格较小的动物（如蛙类），其骨骼比较软弱纤细，我们很难将它们制成完整的骨骼标本，但是我们却可以将它们制成透明骨骼标本。
采用阿利辛蓝（AlcianBlue8GS）和茜素红（AlizarinRedS）分别对软骨和硬骨进行染色，再经过酒精脱色，甘油透明，把蛙的全部骨骼在不受任何损伤的情况下完好的展示出来，使人们可以不通过一般的解剖，就可清楚的了解蛙的骨骼构造。
关键词：
斑腿泛树蛙；透明标本；骨骼；形态学
TheproductionoftransparentskeletalspecimenofPolypedatesleucomystaxanddescription
WeiWANG（20909051056）
Director:
TianHUANG（Lecturer）
（CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HuangshanUniversity,Huangshan,245041China）
Abstract:
Theprocessesoftransparentvertebrateskeletonsaregenerallydividedintofivestepstheanimalswerekilled;muscleswereremoved;fatweredehydrated;boneswerebleached;boneplasticpallet.Howeverbesmalleranimals,suchasfrogs,itsbonesisweakthin,itisdifficultforustomakethemascompletebonespecimens,buttheycanbemadeoftransparentwebonespecimens.ArleysymplecticBlue（AlcianBlue8gs）andAlizarinRed（AlizarinRedS）respectivelytodyeingofcartilageandbones,againafteralcoholdecolorization,glycerintransparent,allthebonesfrogsinthecaseofwithoutanydamagetoperfectshowcomeout,sopeoplecannotthroughthegeneralanatomy,canclearunderstandfrogskeletalstructure.
Keywords:
Polypedatesleucomystax;transparentspecimens;bone;morphology
1引言
1.1斑腿泛树蛙基本特征
根据刘明玉等《中国脊椎动物大全》（2000）对斑腿泛树蛙Polypedatesleucomystax的介绍：
体扁而长，头长与头宽差不多相等；树蛙吻端尖圆，突出于下颔，吻棱比较明显；鼻孔靠近吻端；鼓膜大而且很显著，距离眼后角较近；犁骨齿强。
指、趾端均有吸盘和横沟，外侧指间没有蹼。
皮肤很光滑，颞褶平置且长，达到肩的上方。
生活在自然界一般情况下背面的颜色是浅棕色，没有背侧褶，背部有纵纹或者“X”形斑，股部的后方以及泄殖孔的周围有黄、紫、棕等颜色形成的网状斑纹结构，所以称之为斑腿泛树蛙。
树蛙的个体颜色随着栖息环境的不同而不同。
雌蛙体长为60mm左右，雄蛙体长略小，具有内声囊。
栖息在海拔80-1600m的丘陵地带和山区灌丛、水塘杂草以及稻田等地方。
日伏夜出食多种昆虫和幼虫。
5-8月是斑腿树蛙的繁殖期，卵泡呈白色，卵径为1.5-1.8mm。
在繁殖的季节雄蛙是彻夜鸣叫。
蝌蚪颜色为黄绿色，尾鳍很薄且末端尖细，唇齿为I:
3-3/I:
1-1.我国的南方分布比较多，在云南主要分布于滇中、滇西和滇南这些地区。
斑腿泛树蛙的外形图片1如下：
图1斑腿泛树蛙外形图，幼体
1.2斑腿泛树蛙的生物学资料
斑腿泛树蛙（Polypedatesleucomystax）隶属于树蛙科、泛树蛙属。
分布在我国秦岭以南,常栖息在树林、稻田和池塘的附近,主要以农、林业害虫为食。
它们的繁殖习性不像一般蛙类将卵产在水中;而是与大泛树蛙等树栖息蛙类一样,将卵产于水外,受精卵在水外面进行发育,蝌蚪孵出来后,掉落在水中继续生长和发育,变态后的幼蛙登陆到营树栖进行生活。
山丘地带的水沟、稻田、水池、池塘、水库和鱼池等水域边上的灌木层，以及草丛、黄麻地和玉米地、芭蕉园和有积水的废粪坑等都是斑腿泛树蛙繁殖的理想环境。
斑腿泛树蛙的繁殖季节大致一样：
在四川和福建是4-8月,在云南则为4-9月。
繁殖季节是在4月上旬到9月的中旬,5月份的时候是产卵的高峰期.斑腿泛树蛙产出的卵群形态,不像蟾蛛的卵群形态-叭长带状，也和一般蛙类的片状不一样，堆块状或者是圆饼状，却是略呈梨形或者是球形的泡沫团T.面（称为卵泡团）。
1.3斑腿泛树蛙在中国的分布
斑腿泛树蛙在我们国家的南部分布非常广，尤其在秦岭以南的各省：
四川、浙江、福建、贵州、广西、广东、云南、江西、湖北、湖南、台湾、安徽等省区，其中在云南主要分布在滇中、滇西以及滇南这些地方，分布如图2。
图2斑腿泛树蛙在中国的分布图。
图中红点代表大致的分布地
1.4斑腿泛树蛙的分类地位
斑腿泛树蛙的分类地位如下所示：
动物界Fauna
脊索动物门Chordat
脊椎动物亚门Vertebrata
两栖纲Amphibia
蛙形目Raniformes
树蛙科Rhacophoridae
泛树蛙属Polypedates
斑腿泛树蛙Polypedatesleucomystax
1.5文献回顾
1）刘明玉、解玉浩、季达明《中国脊椎动物大全》对斑腿泛树蛙Polypedatesleucomystax的介绍，使我们对斑腿泛树蛙的生活特性以及形态等有了很仔细地了解（刘明玉等，2000）。
2）国内有一些透明骨骼标本制作的相关研究文献，刘万祥，蔡滢，王长月介绍了透明标本可显示用一般解剖方法难以观察清楚的结构。
它可以在保持标本外形完整的情况下显示出体内骨骼部分，显示出生物体的骨骼发育情况。
透明标本制作原理是应用化学药品和物理方法作用于肌体组织，是组织的折光率和透明剂的折光率相近，以达到透明的目的（刘万祥等，2002）。
3）吕建伟，徐兴军，王雪松，李铁在透明骨骼标本制作中提到：
透明骨骼标本在教学和科研上都有很大的价值，它更具有直观性。
一般小型的脊椎动物都适合做透明骨骼标本，因为小型动物骨骼纤细软弱，而且小型动物的骨骼各个关节部位没有完全骨化，制作单独标本很困难，制作透明骨骼标本就解决了这些难点，制作出来的透明标本清晰美观而且有立体感（吕建伟等，2001）。
4）霍丽荣在透明骨骼标本的制作、维护及反油和发黄的处理很有心得。
在维护标本封口时先将瓶盖和瓶口磨砂面上残留的石蜡清除，再盖严瓶盖。
在用熔化的石蜡密封之前，要先将涂蜡的地方用电吹风预热，这样就可以封牢（霍丽荣，2004）。
5）陈彬，王跃招介绍一种透明骨骼标本染色法中提到，透明骨骼标本，采用阿利辛蓝（AlcianBlue8GS）和茜素红（AlizarinRedS）分别对软骨和硬骨染色，再经甘油透明，使小型动物的全部骨骼在不受任何损伤的情况下清除的展现出来，
不经过一般的解剖，就可了解动物的骨骼结构（陈彬等，2002）。
2材料和方法
2.1材料的选择
斑腿泛树蛙。
2012年4月15日采自于岭南。
2.2器材
解剖刀，解剖剪，镊子，天平，量筒，烧杯等。
2.3药品的浓度及配制方法
固定液:
90%酒精。
软骨染色液:
无水乙醇60ml，冰乙酸40ml，加20mg阿利辛蓝。
硬骨染色液:
5mg茜素红，加0.3mol/L，氢氧化钾100ml。
脱色液:
梯度酒精（25%、50%、75%、100%）。
透明液:
梯度丙三醇（25%、50%、75%、100%）。
保存液:
丙三醇溶液。
2.4.制作步骤
1）材料的处理：
取出采集来的泛树蛙注射酒精处理致死，将钉子其固定在木板上浸泡于75%的酒精中。
2）剥皮去内脏：
从木板上取出蛙，用镊子，解剖刀，解剖剪，除去蛙的内脏、眼睛和有色素沉着的结缔组织。
注意在解剖过程中不能将泽蛙颚下的软骨破坏，肌肉也尽量保持完整。
剔除内脏过程中要求干净无损伤。
处理好的蛙将其浸泡于蒸馏水中。
3）软骨染色：
取出浸泡在蒸馏水中的泛树蛙放入软骨染色液中，染色2天，当表层软骨（如颌下、舌骨）染成蓝色即可。
4）脱色：
置标本于升序梯度脱色液（25%，50%，75%，100%）中，约24h换液1次，至肌肉变成白色。
5）硬骨染色：
将标本晾干后，浸于硬骨染色液中，至肌肉成冻状，并可见硬骨染成红色为止。
6）透明：
将染好的标本依次浸泡于升序梯度透明液中，每次24h换液1次。
7）保存：
将标本浸入保存液中，长期保存。
8）维护：
保存时应视泛树蛙大小来选择合适的标本存放瓶，并添加适量的丙三醇纯溶液。
当保存液浑浊或有沉淀物时要及时更换保存液。
更换保存液时，原保存液要用虹吸方式吸出，切不可用倾倒的方法，以防标本变形受损。
玻璃瓶装的标本，瓶盖多用石蜡密封，开启瓶盖要轻敲封口周围，也可以用电吹风烘烤。
更换或补充保存液时不可将容器注满，要留少许空隙。
封口时要先将瓶盖和瓶口磨砂面上残留的石蜡清除，再盖严瓶盖。
在用熔化的石蜡密封之前,要先将涂蜡的地方用电吹风预热，这样才能封牢。
有机玻璃瓶可在顶盖处钻1-2毫米的小孔，用注射器向容器内补充或更换保存液，然后用三氯甲烷将有机玻璃粉末溶解成液体滴在小孔处固化即可。
3结果
3.1制作斑腿泛树蛙透明骨骼标本
经过以上步骤，成功得到斑腿泛树蛙透明骨骼标本，如下图所示，基本清晰的展示斑腿泛树蛙的骨骼特征。
图1斑腿泛树蛙整体骨骼（背面图）
图2斑腿泛树蛙整体骨骼（腹面图）
3.2斑腿泛树蛙的骨骼结构
斑腿泛树蛙全身的骨骼分之为中轴骨骼和附肢骨骼两个大的部分。
除了头部的蝶筛骨、副蝶骨和脊柱的椎体还有胸骨外,其它的各骨块都为两侧对称结构。
头骨 头骨外廓略呈三角形状,有颅骨和咽骨两个部分
颅骨：
包括鼻骨、鼻腔骨、蝶筛骨、额顶骨、前耳骨、外枕骨、副蝶骨、犁骨、颅内软骨、鼻间软骨。
胸骨中骨、上喙骨、胸骨都为软骨，颜色为蓝色。
肩胸骨、中胸骨为硬骨成紫红色。
腰带:
由髂骨、坐骨和耻骨3对骨构成。
这些骨骼皆为硬骨。
前肢骨包括肱骨、前臂骨、腕骨、掌骨、指骨都为硬骨，但是各骨各以韧带密连着韧带部位皆染成蓝色。
后肢骨含股骨、胫腓骨、跗骨、足，都为硬骨，染成紫红色。
在头骨染色结果中，颅内软骨，鼻间软骨，咽骨局部都染成蓝色，其余骨骼为硬骨，染为紫红色。
脊柱由10块椎骨链接而成①颈椎：
即第1椎骨；②胸椎：
第2-4椎骨；③腰椎：
第5-8椎骨；④荐椎：
即第9椎骨；⑤尾杆骨。
脊柱骨骼全为硬骨组成，染色后均为紫红色，且颜色较深。
肩带：
包括肩胛区及喙区。
肩胛区中上肩胛骨的内缘与肩胛骨紧密平切相接,后缘由软骨组成染成蓝色，基部及前方边缘大半块区是硬骨，为状的耳柱骨，1对舌骨前角，还有1块方板状的舌骨体，1对舌骨后角。
喉头软骨包括有：
杓状软骨、前杓软骨、环状软骨。
附肢骨骼（肩带，胸骨紫红色。
下肩胛骨全为硬骨）。
喙区的前喙骨为一细长软骨，从锁骨内端沿后缘嵌入锁骨沟槽，染成蓝色。
锁骨、喙状骨都为硬骨。
3.3斑腿泛树蛙所有骨骼的长度测量结果如下:
表3-1斑腿泛树蛙透明骨骼量度表单位mm
项
头骨
肱骨
臂骨
指骨
股骨
胫骨
跗骨
趾骨
目
长
宽
左
右
左
右
左
右
左
右
左
右
左
右
左
右
16.69
16.55
13.02
12.81
10.13
9.18
12.10
11.35
24.30
24.11
26.22
25.91
13.19
11.63
18.93
19.07
4讨论
4.1实验心得
1）在解剖过程中要注意不能剪坏蛙的舌器。
因为舌器为软骨，易剪坏。
2）实验涉及光照条件条件，光照的强弱会影响染色的时间和程度。
3）温度影响制作周期。
适宜温度20℃-30℃，由于做实验季节正好在春季，不需要温箱设备。
4）染色时要经常察看,软骨染色时防止染色过度，不易褪色。
硬骨染色时因为KOH有强腐蚀性，容易产生腐蚀过度使标本骨骼脱落的现象。
一般可选用低浓度长时间的方法。
5）如果透明过程中在组织内出现气泡，可用针刺破。
因为在拍照过程中，气泡会产生折射率，影响拍照效果。
6）树蛙体积小，经过各种药液处理后的标本已经非常软弱，在更换各种药液过程中，用镊子时极小心，防止夹断或破坏肌肉，要注意不要把标本损坏。
7）最后标本存放时，避免阳光直接照射，否则影响保存液的清晰，影响观察标本透明度。
8）称取药品时，常以毫克计量，不精确导致溶液浓度或高或底，染色时间难以准确把握。
9）实验时要按时、按质、按量操作，不得丝毫马虎。
制作时要小心谨慎。
10）本实验的结果比较令人满意，但制作过程艰辛，总结为一句话：
细心、小心、决心、信心。
4.2透明骨骼的优点
1）此方法可以避免解剖工作中对骨骼的人为损伤，提供准确的数据；
2）制好的树蛙标本肌肉无色透明，软骨为蓝色,硬骨为紫红色，界限清晰,易于识别，能提供传统解剖方法不宜得到的信息；
3）本方法不仅可用于骨骼系统的研究,也可用于研究动物内脏器官、血管系统。
这在脊椎动物的解剖、胚胎发育的研究方面有一定的应用价值；
4）透明骨骼制作使肌肉完整的保存下来，可以保持骨骼的准确位置与整体形态，避免了在组装骨骼过程中的错误发生；
5）透明骨骼标本可用于教学研究，生动形象的展示动物骨骼的肌肉与骨骼，利于教学；
6）透明骨骼标本还存在着观赏价值，可以有经济方面的前景。
既作为收藏品，又可以体会制作过程的乐趣。
参考文献
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30-31．
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AlizarinredSandAlcianblue.Teratology,2000,61（4）:
73-276.
致谢
行文至此，我的这篇论文已接近尾声；岁月如梭，我四年的大学时光也即将敲响结束的钟声。
离别在即，站在人生的又一个转折点上，心中难免思绪万千，一种感恩之情油然而生。
本实验在选题及研究过程中得到杨典成同学悉心帮助，和积极指导，使我获益良多。
在此表示深深地谢意！
另外感谢黄田老师对我的实验指导与帮助。
他细心指导我的实验与研究，在此，我要向黄老师致以敬意。
感谢黄山学院四年来对我的辛苦培育，让我在大学这四年来学到很东西，特别感谢生命与环境科学学院为我提供了良好的学习环境、感谢领导、老师们四年来对我无微不至的关怀和指导，让我得以在这四年中学到很多有用的知识。
在此，我还要感谢在班里同学和朋友，感谢你们在我遇到困难的时候帮助我，给我支持和鼓励，感谢你们。
最后，对评审老师们在百忙之中抽出时间对我的论文进行评审表示诚挚的谢意。
再次谢谢你们！
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