动物细胞工程 复习资料副本.docx

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动物细胞工程复习资料副本

动物细胞工程思考题

1.<<动物细胞工程>>的基本概念和主要研究内容

细胞工程:

是通过对细胞及组分的人工程序操作,研究生命活动的规律,实现对动物的遗传改造,结合非生物材料的手段,生产用于治疗人类疾病或缺陷的人工器官,组织,细胞及代谢产物或用于深入研究的材料等为主要研究内容的一门学科.

CellEngineeringhasbeendefined:

Bymanipulatingcellorcellparts,asstudyoflifesciencephenomenon,geneticimprovementofanimals,makingthingswithandfromcells,oftencombiningthesewithnon-livingcomponents,toproducedevicesusefultomankindinthetreatmentofdiseaseanddefectorinthefurtherprogressofscience.

主要研究内容:

1>转基因动物（Trangeneticanimals）2>试管婴儿（Test-Tubebaby）3>性别控制（Sexcontrol）

4>人工器官（Artificialorgan）5>生物材料（Bio-material）6>动物克隆（AnimalCloning）

2人造细胞概念及技术

人造细胞是运用人造材料组成最小限度的细胞，目前为止，大多数的尝试基本只能制造一个能发挥多种细胞功能的（转录翻译产生ATP等）的体系，而并不能完全发挥细胞所有功能。

制造：

将能够生产蛋白的生物分子混合悬浮于油中，用双层磷脂分子将生物分子混合物颗粒包裹在其中。

"细胞膜"用蛋清中的脂肪分子制成，内部细胞器取自诸如大肠杆菌之类的生物。

科学家还向其加入控制合成蛋白α-溶血素的基因，α-溶血素能够插入细胞膜形成小孔，环境中的营养物质便可以通过这些小孔进入人造细胞。

3.显微镜由来

17世纪初，GalileoGalilei通过两个玻璃透镜形成一个圆柱体工具，观察到了昆虫的眼睛，并绘制几何图，成为第一个通过原始显微镜记录生物学观察的学者。

1655年RobertHooke（虎克）：

利用自己制作的简易复合式显微镜观察软木塞时，发现蜂窝状小室，实际上是软木死细胞。

他将其命名为cellulac，这就是细胞一词的由来。

RobertHooke的发现为以后的细胞学说打下基础。

1674到1683年，AntonyVanLeauwenhoek用自制所谓高倍显微镜发现了肉眼难见的细菌。

之后两世纪没有人看到比细菌更小的细胞。

4.相差显微镜,荧光显微镜,透射电子显微镜,扫描电子显微镜的特点和用途

1>相差显微镜:

细胞各结构的密度不同,通过致密部分的光线速度小,与通过邻近部分的光线产生相位偏差或光程差.这种差异是人眼不可分辨出来的.显微镜利用光的自觉衍射和干涉特性,把经过不同区域的光线的光位移差转化为振幅差,使细胞各结构之间呈清晰明暗对比可见.

特点及用途:

可以观察活细胞;

可以在镜下连续拍摄（可用来观察细胞迁移活动,分裂等过程.）

2>荧光显微镜:

利用强烈的经过滤光器的激发光线,激发标本产生荧光.

特点及用途:

染色简便

标本呈彩色图案,明亮

灵敏度较高（可用来观察某些分子在细胞中的动态等）

3>透射电子显微镜（TEM）:

使用的电磁透镜,由精密线圈产生磁场,使用的照明工具是电子束,而光镜使用的是玻璃透镜,光源是可见光,TEM需要超薄切片（50-100nm）,将一个细胞分成100-200块.

特点及用途:

透射观察,可观察到二维结构.

可以观察到细胞内部的超微结构,局部结构

不可以用于观察活细胞.（结合负染色,冷冻断裂,冷冻蚀刻等技术可观察某些细胞器的精细结构,以及胞质中细胞骨架纤维及其结合蛋白.）

4>扫描电子显微镜（SEM）:

电子束经光镜聚焦成极细的电子探针,在样品表面逐线扫描样品,被电子激发产生二次电子,经收集,转换,放在荧光屏上成像.

特点及用途:

用于观察细胞及内部的表面结构.

立体感强,三维结构

分辨力（2nm）不及透射电镜（0.1nm）高,用于单个细胞或细小的生物样品.

（详见细胞生物学说,微生物学教材）

5什么时候用显微镜的相差，荧光功能？

相差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能:

①将直射的光（视野中背景光）与经物体衍射的光分开;②将大约一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。

这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。

也可以在镜下连续拍摄（可用来观察细胞迁移活动,分裂等过程.）。

荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光（如紫外光3650入或紫蓝光4200入）作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。

这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

6.如何理解细胞形态由其功能所决定

细胞的形态结构与功能的相关性与一致性是很多细胞的共同特点,在分化程度较高的细胞更为明显.这是生物漫长进化过程的产物,从进化观点看有一定的合理性.

首先以哺乳动物红细胞为例来分析一下.红细胞呈扁圆形,体积很小,是一种非常特化的细胞.哺乳动物的红细胞内无核,亦无其他重要细胞器,主要是由细胞膜包着血红蛋白.这些特点都与红细胞交换氧气与二氧化碳的功能密切相关.细胞体积小,呈扁圆形,非常有利于在血管内快速运行,体积小则相对表面积大,有利于提高气体交换效率.细胞内主要是血红蛋白,有助于结合更多的氧气与二氧化碳.因此,红细胞的形态和结构装置与其运输的功能的关系是非常合理的.

又如动物的各类分泌细胞,虽然分泌物的性质不同,但其形态结构却有共同性.例如,分泌蛋白质的各种腺细胞,其形态与结构必然有如下的特点:

细胞一定呈极性,一端是近侧端,为吸收表面,与基膜连接;另一端是游离端,是分泌表面.吸收表面的细胞膜必然形成大量的皱褶,并在褶叠膜内排列有大量的线粒体,因为这均有助于增加物质透膜运输的效率及能量供应.游离端往往形成很多微绒毛,增加表面积,以提高分泌效率.细胞质内的内质网与高尔基体必然很发达,因为要保证蛋白质高速度的合成与加工,供能的细胞器----线粒体的数量必然较多,而且分布在内质网附近.核仁的体积一般较大,因为要保证生产足够的核糖体（蛋白质的合成机器）

雄性生殖细胞与雌性生殖细胞经过分化与发育,形成非常特化的细胞,它们的结构装置几乎简化到仅只有利于完成受精过程与保证卵裂.精子除了携带一套完整的单位基因组,即高度的浓缩核外,其他结构装置主要保证其运动与进入卵内.即后端具有能运动的鞭毛,前端具有有助于进卵的顶体（类似大溶酶体）.卵细胞则相反,为了保证受精后卵裂与早期胚胎发育,它必须在胞质内储存大量的mRNA,蛋白质与养料,致使细胞体积骤增,但其细胞核的体积并没有明显变化.

虽然以上叙述的是一些特化的动物细胞的结构与功能的关系,但绝大多数动物与植物细胞是遵循结构与功能相一致这一规律的.

7.GFP技术及其特点

①GFP（Greenfluorescenceprotein，绿色荧光蛋白）:

最早是从水母中分离出来的,当其受到紫外或蓝光激发时，可以发出绿色荧光。

而其基因可在异源组织中表达并产生荧光。

由于其良好的物理特性及荧光特性而成为良好的报告基因和荧光标记分子,并在探索生命现象过程中得到了非常广泛的应用。

绿色荧光蛋白是最常用的报告基因之一。

转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪（FACS）中直接观察基因的表达。

②特性:

（1）可用在活细胞中直接观察蛋白质向细胞器,如细胞核、内质网中运动.

（2）既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害.

（3）易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响.

（4）转化后细胞可以继续传代。

8.报告基因使用技巧

报告基因的选择取决于特定的研究目的以及分析的可行性（敏感性、可信度、可检测性以及动力学性质），

报告基因的稳定性将决定其是否适合转录的动态研究、高通量研究以及在转基因实验中全或无式的基因表达研究。

例如，萤火虫Luc

和海洋腔肠Luc由于对蛋白质水解的敏感性，其半衰期较氯霉素乙酰转移酶（CAT）

要短,这样的特性使其更适合转染效率和动力学研究；再如，野生型GFP与Luc相比，荧光信号的线性范围较窄，这就不大适合转录的定量研究；

GFP由于缺乏酶促扩大效应，因此其灵敏性较Luc要差，这就使其局限于那些只有高表达的基因研究，

而且GFP在细胞内的累积使其更不适合高通量的筛选。

目前已使用双报告基因系统，例如：

萤火虫和海洋腔肠双LUC

9.细胞组分的分离技术

用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物:

用低渗匀浆,超声破碎或研磨等方法可使细胞膜破碎,形成细胞核,线粒体,叶绿体,内质网,高尔基体,溶酶体等细胞器和细胞组分的混合匀浆,再通过差速离心和密度梯度离心将各种亚细胞组分和各种颗粒分开.

10.细胞类型分离技术及特点

流式细胞仪

抗体选择

差异吸附

差异沉降

11.fiberfish技术

FiberFISH是近几年发展起来的一项高分辨率和高灵敏度的荧光原位杂交技术,已被广泛应用于人类及动植物基因组的研究。

荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization）将DNA特殊修饰的核苷酸分子标记（如biotin-dUTP或dig-oxigenin-Dutp）针分子特异结合来检测该DNA染色体上的位置。

具有不需放射性同位素、实验周期短和检测灵敏度高的优点。

已被广泛应用于动植物基因组结构的研究,染色体结构的分析和DNA谱的构建等。

12.细胞周期

由一个细胞增殖分裂为两个细胞的过程.在这个过程中染色体复制一次,随后随着细胞分裂平均分配到两个子细胞中,这个周期分为G1;S;G2;M四个时期,G1,S,G2为细胞间期,M为分裂期.

13.细胞周期的关键调控点

G1--S（存在于G1之内,控制细胞进行复制的关键点）

G2--M（存在于G2之内,控制细胞进行分裂关键点）

14.G0期细胞

位于细胞周期中G1后段,而且存在G1--G0的转化过程,G0细胞处于静止状态,不进行分离.在G1--S关键点,细胞要做出是否进入下一次分裂或处于静止状态G0的决策.

如,部分肝脏细胞,一定时期乳腺细胞.另外有一部分细胞属于终端分化细胞,如神经细胞,肌肉细胞等

总之,分裂细胞+终端分化细胞+G0细胞=机体和组织细胞活动多样性.

15.细胞系及其特性

在体外培养条件下,可以永久进行繁殖的细胞,这种细胞可以无限传代,称为细胞系.

特点:

1>可以提供大量的同一类型的细胞,有利于研究工作

2>可以大量分离细胞产物,用于企业化生产

3>可以长期并存于液氮之中,需要时可以解冻复苏

4>细胞系细胞多数为非整倍染色体,个别为二倍体,如WI-38.

16.细胞操作的无菌技术原则,含义及其内容

原则:

保证细胞培养皿,培养瓶内部,吸管包装层内部,以及培养基的无菌状态,这一点十分重要,它包括:

1>工作环境以及表面处理

2>实验者的操作技术

3>细胞培养所用的玻璃以及塑料制品的处理

4>培养基的无菌处理

消毒与灭菌

1>超净工作台:

用75%乙醇擦洗,紫外灯灭菌30-50分钟

2>无菌间:

用30W的紫外灯30-50分钟

3>玻璃器皿:

新器皿用5%HCl泡12h

用过的器皿用酸剂浸泡,煮沸,清洗,浸泡,清洗,晾干,灭菌

4>其它器皿:

橡胶,塑料器皿用专用洗涤剂清洗以后,2%NaOH浸泡过夜,5%HCl泡30分钟,清洗晾干,灭菌.

金属器皿洗净后,用酒精棉球擦,灭菌.

灭菌方法:

1>物理方法:

干热,湿热,过滤

2>化学方法:

消毒剂,抗菌素

17.细胞冻存，复苏技术要点

细胞冻存要点：

（1）细胞分装入冻存管中。

冻存管具有螺旋口，可以防止液氮漏入管中，提高冻存效率。

（2）应采用分步的方式达到临界点，使内部冰晶无法形成，同时不影响水的外流，1摄氏度|分为降温标准，可以采用程序方式的细胞冻存仪。

（3）降温支架，可以使冻存管保持在气象上方，冻存管下降到液氮罐中的不同温度，可以调节冻存速率。

（4）悬重离心收集的细胞，1ml冻存液，成分为：

培养基7ml，PBS2ml，甘油或DSMO为1ml（5-20%），在配置时注意比例。

（5）加入1ml细胞，标明细胞系名称，日期培养基。

（6）-80摄氏度过夜或用程序细胞仪。

（7）次日，直接将其转入液氮中。

细胞冻存的复苏

（1）将烧杯中水温调至40摄氏度。

（2）从液氮中取出冻存管。

（3）将冻存管放在烧杯中至完全融化，一旦冰块消失，立即将冻存管取出。

这一重要操作的目的是使细胞温度不升至37摄氏度以上。

（4）用75%乙醇擦洗冻存管外部，减少污染。

（5）取出细胞加入培养瓶中，缓缓加入少许培养基，混匀。

（6）37摄氏度培养，24h更换培养基。

18影响动物细胞生长的环境因素

动物细胞对环境条件的要求比微生物,植物细胞低:

（？

）

1>营养成分的要求

根据各种细胞具体要求准备培养基,一般要求有:

合成培养基（营养基本）;血清

2>对pH的要求

pH因素是细胞生长环境的重要因素,一般大多数要求为pH7.2-7.4

a.培养基中应有缓冲液,如Hepes,H+缓冲液,对细胞没有副作用,可以在较长时间控制pH的波动.

b.CO2浓度的要求,多数细胞要求5%CO2,95%空气,常CO2培养箱

3>对温度的要求

一般温度T为37为℃左右,不同的细胞对温度有不同的要求

哺乳动物细胞37℃

鸡的细胞39-42℃

昆虫细胞25-28℃

鱼细胞28℃

4>对渗透压的需要

一般260-320mosm/kg,培养基的渗透压指用以阻止水分经过半透膜进入培养基的压力

5>对抗生素的要求

双抗（青霉素:

100单位/ml培养基+链霉素:

100ug/ml培养基）

另有,青霉素G,Na+盐,硫酸链霉素,用缓冲液如Hanks液配制.

19.大规模细胞培养的类型

①悬浮培养:

少数动物细胞需悬浮培养.

②微载体培养:

增加细胞生长贴壁面积,直径60-250µm.

③多孔载体培养:

多空载体是大规模高密度培养支持物.细胞在小孔内生长.

④微囊化培养:

借助于固定化技术将细胞包裹在微囊中培养.

⑤中空纤维培养:

利用中空纤维给细胞生长提供营养等条件.

21.干细胞的种类,概念

种类:

来源于胚胎---------胚胎干细胞ESC（早期囊胚的fetus细胞）

胚胎性生殖细胞EGC

来源于成体---------成年组织来源的干细胞ASC（骨髓）

概念:

干细胞是一种具有自我更新的能力;高度增殖;多向分化潜能的细胞

22.干细胞的生物学特征

1>细胞形态结构及核型

a.各种动物的ESC具有早期胚胎细胞相似的形态结构,它的体积小,但核比较大,有一个或几个核仁.

b.ESC与卵圆柱期胚胎外层和胎儿生殖的生殖细胞相似,而与ICM（囊胚内细胞）细胞有差别.

c.细胞中多为常染色质,胞质结构简单,散布着许多核糖体和线粒体,核型正常,保留了整倍体性质.正常的ESC细胞染色体正常,如发生异常,则很难发育分化为动物个体.

d.ESC在体外分化抑制培养基中呈克隆状生长,细胞紧密地聚焦在一起,形成鸟巢,细胞界限不清,克隆周围不时可见单个ESC和分化的扁平状的上皮细胞.

e.ESC增殖迅速,每18-24小时分裂一次

f.可在体外进行选择操作,冻存,冻存的细胞可以在需要时随时解冻,继续培养不失原有特性,而且来自同一克隆的细胞有同样特征.

2>ESC有高度分化潜能,它区别于成纤维细胞及体细胞的显著特征

a.ESC在体外需要在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态,一旦脱离饲养层就可以进行分化.

b.在单层培养时,细胞分化形成许多细胞.

悬浮培养中:

简单类肠胚--------囊状胚体--------细胞分化物

c.ESC可以进行诱导分化.

●用RA（维生素A酸或视黄醛）作为诱导,90%以上的ESC分化为神经胶质细胞

●聚焦培养的ESC诱导分化,可以分化为有节律性收缩的心肌细胞

●将ESC注入到同源动物皮下,可以形成组织瘤,其细胞组成可以代表三个胚层的细胞

●用ESC作核供体进行细胞核移植,可以得到可发育重构胚胎和动物个体.

3>碱性磷酸酶的表达

小老鼠和大老鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）的表达,小老鼠的ESC和EC中有许多AKP,而在已分化的EC和ESC中都为弱阳性或阴性.故AKP常用于作鉴定EC细胞或ESC分化与否的标志之一.

4>胚胎阶段特异性细胞表面抗原表达

早期胚胎表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原SSEA-1.在胚胎的原始外胚层细胞ESC,EC细胞.原始生殖细胞表面都可以检测到SSEA-1的表达.小老鼠SSEA-1的表达自八细胞期开始,至原始外胚层形成期.早期囊胚ICM细胞全部是强阳性,晚期囊胚中ICM呈强阳性,部分弱阳性,少部分为阴性,故SSEA也可以作为ESC鉴定的标志.

23.ESC的鉴定

1>ESC的形态结构

2>ESC核型分析,二倍体核型

3>碱性磷酸酶AKP染色

AKP染色常使用快绿染色方法,对照则是已经建系的ESC作为阳性对照,作用液中不含察酚为阴性对照,若为阳性对照,ESC染色为棕色,阴性对照则无色.小老鼠3.5月齡胚胎ICM为职阳性.

4>SSEA-1免疫荧光检测法

第一抗体,SSEA-1（老鼠抗原ESC单克隆抗体）,稀释.

第二抗体,羊抗老鼠,封闭羊抗兔IgG

用荧光抗体检测抗原.

5>分化能力检测.

a.体外分化试验

b.体内分化试验

c.嵌合体形成试验.

d.核移植试验.

24.ESC面临的难题与挑战

①干细胞必须能高效、直接地分化成各种稳定的组织细胞.

②其与其他组织细胞的分离与纯化.

③免疫排斥和肿瘤化倾向.

25、成体干细胞

主要包括6种：

1、骨髓造血干细胞HSC（MarrowHeamatopoieticStemCells）；2、外周血干细胞PBSC（PerrpheralBloodStemCells）；3、胎肝干细胞（FetalLiverStemCell）；4、脐带血干细胞（UmbilicalCordBloodStemCell）；5、神经干细胞（NeuralStemCells）；6、皮肤干细胞（SkinStemCell）。

26、肿瘤干细胞及其与正常干细胞的异同

肿瘤干细胞概念：

Acancerstemcellisacellwithinatumorthatpossessthecapacitytoself-renewandtocausetheheterogeneouslineagesofcancercellsthatcomprisethetumor.

Cancerstemcellscanonlybedefinedexperimentallybytheirabilitytorecapitulatethegenerationofacontinuouslygrowingtumor.

它是肿瘤内具有自我更新，能产生表型多样的肿瘤细胞群体，并驱动肿瘤发生的一类干细胞。

与正常干细胞的异同:

Normalstemcells

Cancerstemcells

Rarecellswithinorganswiththeabilitytoself-renewandgiverisetoalltypesofcellswithintheorgantoarriveorganogenesis.

Rarecellswithintumorwiththeabilitytorenewandgiverisetothephenotypicallydiversetumorcellpopulationtodrivetumorgenesis.

27、干细胞的应用

人类干细胞的应用：

1、研究人类发育，细胞分化；2、研究疾病发生机制；3、治疗疾病是其主要应用。

28.干细胞应用的法律,伦理道德问题（仅供参考）

①如何看待胚胎。

ES主要有三个来源：

（1）（自然和人工）流产的胚胎；

（2）辅助生殖剩余的胚胎；（3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。

不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。

于是，胚胎是不是生命，是不是人，研究ES是不是“毁灭生命”、“杀人”，很自然地成为争论的焦点。

②是否必然滑向生殖性克隆。

2003年10月，联合国大会以80票赞成、79票反对、15票弃权的表决结果，将《禁止人的克隆生殖国际公约》推迟一年。

世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不过呢？

因为79个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，主张二者同时禁止。

治疗性克隆是ES研究的主要目的。

封杀治疗性克隆，实际上就是要封杀ES研究。

③一方面，我们要维护科学的利益，保护和促进科学的健康发展，而不能成为科学发展的障碍。

另一方面，我们又要维护人的权利和尊严，使科学更好地为人类造福，而不是危害人类。

我们相信通过科学家、法学家、伦理学家之间的合作，通过公众参与，通过国际交流和对话，完全可以在科学利益和人道利益，在科学与人文之间寻求某种结合、某种平衡。

使它既能给科学家广阔的空间，让他们发展科学、泽惠于人；又充分尊重胚胎、尊重人的权利和尊严，为治病救人的人道主义事业开拓新领域。

29、对干细胞的新认识，干细胞与分化细胞的关系

Stemcellsareimmaturecellsthatcanreplicate,orrenewthemselves,andareabletodifferentiateintoallcelltypes.

Mutationsandrearrangementsofthegenomeofstemcellsgiverisetocscs.thesechangescouldunderliethedevelopmentofcancersinmantissues.

Stemcellsaremoredifficulttokill.becausetheyaresoimportantthroughoutaperson’slifetime,theyhavedevelopedmechanismsthatprotectthemselves.therefore,tumorstemcellsareabletoresisttoxicsubstances,suchascancerdrug.

干细胞与分化细胞的关系：

首先干细胞是一类具有自我更新能力、高度增殖、多向分化潜能，能再生各种组织的细胞，而分化细胞失去再分裂的能力，最终衰老死亡。

在机体中保留了很少量的未分化的原始细胞，即干细胞，一旦需要，即发育成分化细胞。

干