细胞生物学实验指导12生工.docx

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细胞生物学实验指导12生工

细胞生物学实验

教案

实验一：

特殊显微镜的使用及显微摄影术

一、实验目的：

1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜的原理、构造及其使用方法。

2、掌握显微摄影装置及其操作技术，独立完成显微摄影全过程。

二、实验原理：

暗视野显微镜应用丁达尔现象，装配暗示场聚光器，是入射光从聚光器斜向照明被检样品。

暗视野显微镜利用样品的散射光和放射光进行观察，只能观察物体的存在与运动而不能辨清其细微结构。

暗视场照明是照明光线仅照亮被检样品而不能进入物镜，使视场背景暗黑，样品明亮的照明方法。

相差显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，通过衍射和干涉现象，将肉眼看不到的相差，变为明暗的振幅差而能看到。

相差显微镜应用于生物学的主要价值，在于对透明的活体进行直接观察，无需采用是细胞致死的固定和染色的方法。

0lympusBH系列的BHS和BHT型显微镜有摄影装置，通过摄影装置，拍摄显微视场中被检样品。

三、实验仪器与试剂

1、材料：

洋葱鳞茎、人口腔细胞；

2、器材：

暗视场显微镜、相差显微镜、Olympus显微镜、活体生物样品、擦镜纸、消毒牙签、镊子、滴管、纱布、吸水纸、载玻片、盖玻片

3、试剂：

生理盐水（0.9%）、2%碘液、香柏油、二甲苯。

四、实验步骤与方法

（一）口腔上皮细胞的制备及染色

1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；

2、用滴管在载玻片的中央滴一滴生理盐水；

3、用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁轻轻地刮几下；

4、把牙签上的碎屑放在生理盐水中轻涮几下；

5、盖上盖玻片；

6、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；

7、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。

（二）洋葱鳞茎内表皮装片制作

1、把载玻片和盖玻片擦拭干净；

2、用滴管在载玻片的中央滴一滴蒸馏水；

3、用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮置于蒸馏水中；

4、盖上盖玻片；

5、在盖玻片的一侧滴一滴稀碘液；

6、用吸水纸吸引,使染液浸润标本的全部。

（三）分别用暗视场显微镜和相差显微镜观察

（四）显微摄影的使用

将装片置于显微摄影镜下,选一清晰的视野进行拍摄并打印出来。

作业：

交一张显微摄影相片，并贴在实验报告上。

思考题：

为什么暗视场照明的视场暗黑，而样品像明亮？

相差显微镜镜检时，为什么要用绿色滤色镜观察活体样本？

实验二：

类坏死细胞的处理及死活细胞鉴别

一、实验目的：

1、学习并掌握细胞计数原理及方法；2、学习并掌握类坏死细胞的处理方法；3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。

二、实验原理：

1、类坏死细胞是细胞介于生活和死亡之间的临界状态。

引起类坏死的方法多种多样，如高温、冷冻、紫外线照射、酸碱处理等。

类坏死和死亡之间的区别在于前者发生的变化是可逆的，而后者是不可逆的。

2、血球计数板是用以计数红细胞和白细胞的。

四个边角大方格，都用以计数白细胞的，而正中间的大方格则是用以计数红细胞的。

3、死活细胞鉴别有许多不同的方法，其中最常用方法是染色排除法。

其原理是许多酸性染料不易穿过活细胞的质膜进入细胞内，却能进入死亡的细胞内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。

三、实验器材与试剂：

1、材料：

鸡血细胞。

2、实验器材：

显微镜、血细胞计数板、水浴锅。

3、试剂：

5%柠檬酸钠、1%台盼蓝溶液（生理盐水配置）、Ringer液、HanK液、0.1mol/LCH3COOH（HanK液配制）、0.001mol/LNH3（Ringer液配制）、

四、实验步骤与方法：

（一）类坏死细胞的处理。

1、碱处理：

A、取5支试管编号，分别加入1ml鸡血细胞悬液；

B、分别加入1ml0.001mol/LNH3混匀，37℃培养1、5、10、20、30min。

C、加入5mlRinger液离心（800~1500r/min）5min去上清液，重复2次，再加入1mlRinger液。

2、酸处理：

A、取5支试管编号，分别加入1ml鸡血细胞悬液；

B、分别加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.40ml0.1mol/LCH3COOH混匀，37℃培养10min。

C、加入5mlHanK液离心（800~1500r/min）5min去上清液，重复2次，再加入1mlHanK液。

（二）染色制片：

取0.5ml细胞悬液放入干净试管中，加入约0.1ml（1~2滴）染液，混匀，2min后立刻加入血细胞计数室，镜检计数。

（三）观察结果：

死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

根据下式求细胞活力：

细胞存活率（%）=（细胞总数-死细胞数）÷细胞总数×100%

作业：

书写实验报告，计算所测细胞成活率。

思考题：

为什么活细胞不易染色，从细胞生物学角度解释原因。

附：

HanK液的配制：

HanK原液：

NaCl80.0g;Na2HPO4.2H2O0.6g;KCl4.0g;KH2PO40.6g;MgSO4.7H2O2.0g;葡萄糖10.0g;CaCl2（无水）1.4g;加水至1000ml.并加入防腐剂（氯仿或双抗）

配制程序：

①称取CaCl2（无水）1.4g，溶于30~50ml.重蒸水中。

②取1000ml.烧杯及容量瓶各1个，先放入800ml.重蒸水于.烧杯中，然后按上述配方顺序，逐一称取药品。

但必需在前一药品完全溶解后，方可是加入下药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已溶解的CaCl2溶液加入，加时要边加边混匀，注意不要出现沉淀。

最后用容量瓶定容至1000ml.并加入防腐剂（氯仿2ml.）充分混匀分装并盖紧瓶塞，于4℃下保存。

HanK液的配制：

HanK原液100ml；重蒸896ml；0.5%酚红4ml。

经5.28×104Pa（8磅）灭菌30min,置4℃保存。

使用时加入NaHCO3少许调至所需的PH。

NaCL8.00g；KCL0.40g；CaCL20.14g；MgSO4.7H200.20g；Na2HP04.H2O0.06g；KH2PO40.06g；NaHCO30.35g；葡萄糖1.00g；酚红0.02g；加水至1L，用NaHCO3调PH至7.2~7.4

Ringer溶液：

NaCl8.5g（变温动物6.5g）;CaCl20.12g;NaHCO30.20g;KCl0.14g;Na2HPO40.01g;葡萄糖2.0g；加蒸馏水至1000ml

实验三：

线粒体和液泡系的超活染色与观察

一、实验目的：

1、观察动、植物活体线粒体、液泡系的形态、数量、分布；2、学习一些细胞器的超活染色技术。

二、实验原理：

体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染色溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某些结构上而染色。

碱性染料的胶体表面带阳离子，酸性染料的胶体表面带有阴离子，而细胞被染的部分本身是具有阴离子或阳离子，这样就发生吸引作用。

JanusgreenB和neutralred二种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

JanusgreenB活体细胞染色的机理：

JanusgreenB是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

Neutralred碱性染料活体染色的机理：

neutralred为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。

三、实验器材与试剂

1、材料：

人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞

2、器材：

显微镜、恒温水浴锅、解剖刀、镊子、盖载玻片、吸管、牙签等

3、试剂：

Ringer溶液：

NaCl8.5g（变温动物6.5g）;CaCl20.12g;NaHCO30.20g;KCl0.14g;Na2HPO40.01g;葡萄糖2.0g；加蒸馏水至1000ml

1%、1/3000中性红（neutralred）溶液：

称取0.5g中性红溶于50mlRinger溶液,稍加热（30~40℃）使之很快溶解,用滤纸过滤,即为1%原液。

装入棕色瓶于暗处保存备用。

临用前，取1%原液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，即为1/3000中性红溶液，装入棕色瓶。

1%、1/5000詹纳斯绿B（JanusgreenB）溶液：

1%詹纳斯绿B溶液的配制：

称取0.5gJanusgreenB溶于50mlRinger溶液,稍加热（30~40℃）使之很快溶解,用滤纸过滤,即为1%原液。

装入棕色瓶备用。

1/5000詹纳斯绿B溶液的配制：

临用前，取1%原液1ml，加入49mlRinger溶液混匀，即为1/5000中性红溶液，装入棕色瓶。

四、实验步骤与方法：

（一）人口腔上皮细胞线粒体的超活染色观察

1、在载玻片滴2滴1/5000詹纳斯绿B溶液

2、刮取口腔上皮防入载玻片的染液滴中，染色5~10min，盖上盖玻片，置显微镜下观察

3、观察口腔上皮细胞及线粒体

（二）洋葱鳞茎内表皮细胞观察液泡

1、用吸管吸取1/3000中性红染液，滴一滴于干净的盖玻片上，撕取一片洋葱鳞片内表皮，置于染液中染色10~15min

2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，盖上盖玻片进行观察。

3、仔细观察液泡的颜色及位置。

作业：

绘制口腔上皮细胞线粒体形态与分布。

绘制洋葱鳞茎内表皮细胞，示液泡系形态与分布。

思考题：

简述中性红染液、詹纳斯绿B染液用于细胞超活染色的原理。

实验四细胞骨架的光学显微镜观察

一、实验目的：

1、掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法，观察光学显微镜下植物细胞骨架的网状结构。

2、通过考马斯亮蓝染色法观察微丝实验，初步掌握考马斯亮蓝染色法技术。

二、实验原理：

考马斯亮蓝染色法观察微丝考马斯亮蓝是一种蛋白质染料，主要有R-250和G-250两种类型。

考马斯亮蓝可以和蛋白肽链中碱性氨基酸残基（Arg）或芳香族氨基酸残基结合，使蛋白变蓝。

由于反应时颜色的深浅与蛋白的含量相关，所以可依此进行蛋白浓度的测定。

考马斯亮蓝主要用于对蛋白含量的测定和对蛋白进行染色观察，在蛋白的定量分析、蛋白的电泳和细胞骨架观察中有非常重要的应用。

由于考马斯亮蓝R-250并非微丝专一性的染料，所以，在用它对微丝进行染色观察前，应首先用去垢剂抽提掉胞质中的除骨架以外的其他蛋白，以便清晰地显示细胞质中微丝的结构。

本实验观察的是植物细胞中由微丝平行排列形成的微丝束，在动物细胞中称为“应力纤维”。

非肌细胞中的微丝是动态结构，单体和纤维在一定的条件下可相互转化。

本实验中M－缓冲液提供的离子条件可使纤维稳定。

在Mg2+、高浓度K+、Na+诱导的条件下，F-actin趋于稳定，而在含ATP、Ca2+和低K+、Na+的条件下，F-actin趋于解聚。

为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。

戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。

去垢剂为一端亲水一端疏水的小分子，可将膜脂包围在内部，从而形成水溶性的分子，导致细胞膜系统的崩解，是分离与研究膜蛋白的常用试剂，可分为离子型去垢剂和非离子型去垢剂两类。

常用的离子型去垢剂有十二烷基磺酸钠SDS，能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水键，使蛋白多肽链展开，SDS则以其烃链与蛋白分子侧链结合。

SDS作用剧烈，能引起蛋白的变性。

TritonX-100又名聚乙二醇辛基苯醚，是一种非离子型去垢剂，作用温和，是研究细胞骨架蛋白的重要的工具药物。

当用适当浓度的TritonX-100处理植物细胞后，可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质（能使95%以上的可溶性蛋白被抽提）和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质却保存完好，经考马斯亮蓝R-250染色，在光学显微镜下可观察到由微丝组成的微丝束为网状结构。

三、实验器材与试剂

1、材料：

洋葱鳞茎。

2、器材：

小烧杯、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、显微镜。

3、试剂：

（1）、M缓冲液：

50mmol/L咪唑50mmol/LKCl0.5mmol/LMgCl2

1mmol/LEGTA0.1mmol/LEDTA1mmol/L巯基乙醇

（2）、6mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）或6mmol/LPBS磷酸缓冲液（pH6.5）：

KH2PO4:

Na2HPO4·2H2O=7:

3

（3）、1%TritonX-100，用M缓冲液配置。

（4）、0.2%考马斯亮蓝R-250：

46.5ml甲醇、7ml冰醋酸、46.5ml蒸馏水。

（5）、3%戊二醛用6mmol/L磷酸盐缓冲液配置。

（25%戊二醛取12mL，PBS88mL）

注：

EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：

前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度。

M－缓冲液和磷酸缓冲液作用：

维持细胞的渗透压。

四、实验步骤与方法：

（1）、取材：

撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小）置于装有6mmol/L磷酸盐缓冲液的烧杯中，使其下沉。

（2）、抽提：

吸去磷酸盐缓冲液，用1%TritonX-100处理20-30min.。

（3）、冲洗：

吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次，每次10min。

（4）、固定：

3%戊二醛固定30min。

（5）、冲洗：

6mmol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min。

（6）、染色：

0.2%考马斯亮蓝R-250染色20min。

（7）、制片：

用蒸馏水洗1-2次，将标本置于载玻片上，加盖片。

（8）、观察：

光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在着染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，即为构成细胞骨架的微丝束

附：

动物细胞骨架的显示与观察

（1）、涂片：

用干净牙签刮取人口腔上皮细胞，置于1.5ml离心管中，加1ml生理盐水，混匀后3000转离心10分钟，剩0.5ml上清液，吹管吹打均匀、涂片、晾干。

（2）、漂洗：

M缓冲液洗3次。

（3）、处理：

1％TritonX－10037℃处理30分钟，M缓冲液洗3次。

（4）、固定：

3％戊二醛固定15分钟，磷酸缓冲液洗3次，滤纸吸干。

（5）、染色：

0.2％考马斯亮蓝R250染色5分钟

（6）、封片：

水洗制成临时片，镜检。

作业：

绘所观察到的细胞的骨架图

思考题：

1、什么是细胞骨架？

它有何主要功能？

2、、列举你所知道的动、植物细胞中由微丝组成的结构。

3、、显示细胞骨架的原理是什么？

说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。

实验五：

脂类细胞化学——苏丹Ⅲ染色法

（一）

一、实验目的：

了解脂类染色原理、操作步骤及脂类标本制片原则。

二、实验原理：

脂类包括的范围很广，有单纯脂、复合脂、衍生脂等。

脂类不溶于水，易溶于浓酒精、苯、乙醚等。

故制作脂类标本，一般不用石蜡切片，而用冰冻切片或铺片法以保存脂类，固定多用甲醛类固定剂。

其染色方法有脂溶性染料显示法、化学显示法、特异染色法等。

脂溶性染料显示法即采用苏丹染料中的苏丹III、苏丹IV（猩红）或苏丹黑等溶于脂类使脂类显色的原理显示脂类，使用时，注意选择溶剂，要求既要溶解苏丹染料，又不溶掉脂类。

三、实验器材与试剂

1、材料：

蟾蜍脂肪体压片或小肠系膜铺片或小鼠肠系膜铺片。

2、器材：

解剖剪、眼科剪、眼科镊、载玻片、显微镜。

3、试剂：

①苏丹红Ⅲ1g溶入加温的70%乙醇溶液中过滤备用。

②10%甲醛钙固定液：

甲醛10ml，CaCl21g,加水至100ml。

③甘油明胶：

明胶12g，加入120ml蒸馏水中水浴加温使其完全溶解，再加入60ml甘油和1g苯酚，充分混匀后，４℃储存备用。

④70%乙醇溶液

四、实验步骤与方法：

材料１：

解剖蟾蜍，在卵巢或睾丸前方有分支花瓣状呈黄色或表面略带灰色的脂肪体，用眼科剪剪一小块（小米粒大小），放在载片中央，滴10%甲醛钙固定液固定２min,然后换滴苏丹Ⅲ饱和染色液一小滴，静置10min,加盖片，轻压盖片使组织稍分散，显微镜下观察。

材料２：

取小鼠肠系膜平铺在载玻上，稍干后用10%甲醛钙固定液固定20min，蒸馏水洗后，70%乙醇溶液洗，然后用苏丹红Ⅲ饱和染色液染色30min，取出后在70%乙醇溶液中稍洗，甘油明胶封片。

结果观察：

脂肪细胞呈圆球形，内充满橘红色脂类物质，细胞核呈指环状偏靠细胞膜边缘，细胞外也有散在的橘红色圆脂肪滴。

思考题：

显示脂类时，制片及染色有何特殊之处？

实验五DNA的原位显示—Fenulgen反应

（二）

一、实验目的：

1、了解Fenulgen反应的原理；2、掌握有关的操作方法。

二、实验原理

Feulgen反应：

DNA经弱酸（1mol/L HCl）水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。

醛基在原位与Schiff（无色品红亚硫酸溶液）试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。

紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基（醌基是一个具有颜色的发色团），所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。

三、实验器材与试剂

1、材料：

洋葱根尖，洋葱鳞茎表皮细胞

2、器材：

光学显微镜，载玻片，盖玻片，剪刀，镊子，表面皿，小指管，恒温水浴箱（2个），试管架，刀片

3、试剂：

1）1mol/LHCl:

取82.5mL密度1.19g/mL的浓盐酸加蒸馏水1000mL。

2）Schiff试剂：

煮沸200mL水，稍冷放入1g碱性品红，充分搅拌有助溶解，50℃时过滤，置磨口棕色瓶内，向滤液中加1mol/LHCl20mL，待25℃时加偏重亚硫酸氢钠或亚硫酸钾1g，盖严放暗处，静止勿动，几天后，红色稍退，溶液呈无色或淡黄色，即可使用，如有红色，可加一勺活性炭，振荡过滤，黑布罩好。

3）亚硫酸水：

取200mL自来水，加10mL10%（临用时配制）

4）5%三氯乙酸。

四、实验步骤与方法

1、将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1mol/LHCl中，加热到60℃水解8~10分钟。

2、蒸馏水水洗。

3、Schiff试剂遮光染色30分钟。

4、用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1分钟。

5、水洗5分钟。

6、将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱鳞茎表皮省去压片）

7、显微镜检查。

细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性的反应。

*对照片

方法一：

先将材料放在5%三氯乙酸中90℃水浴15分钟，主要把DNA抽提掉，然后按

（1）~（7）制片观察。

方法二：

材料不经水解，直接按（3）~（7）制片观察。

作业：

绘图示洋葱根尖或鳞茎内表皮细胞DNA的分布部位。

思考题：

简述Fenulgen反应的原理的实验的关键步骤。

实验六细胞核与线粒体的分级分离

（一）

一、实验目的：

1.对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。

2.掌握用差速离心技术分离制备动物细胞核及线粒体的方法

二、实验原理

　　利用细胞核与线粒体在一定介质中的沉降速度的差异，可采取分级差速离心的方法，将细胞核与线粒体逐级分离出来。

（差速离心技术）

　　线粒体是真核细胞特有的进行能量转换的重要细胞器。

将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。

在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。

在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。

依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。

　　悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易聚集成团，有利于分离。

整个操作过程样品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。

　　细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色，从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。

　　詹纳斯绿B是一种活体染料，能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。

由于染料（碱性染料）的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离子或阴离子，这样，它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来。

染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细胞的死亡。

　　Gimesa是一种复合染料，即为酸性染料与碱性染料的结合物。

在水溶液中电离为带正电和负电的染料离子。

三、实验器材与试剂

1、材料：

鼠肝脏, 猪肝脏

2、器材：

解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。

3、试剂：

（1）0．9%生理盐水。

（2）0.25mol/L蔗糖-0.01mol/LTris-盐酸缓冲液（pH7.4）（匀浆液）。

配法：

0.1mol/LTris10ml；0.1mol/L盐酸8.4ml；加双蒸水到100ml。

再向上述缓冲溶液中加蔗糖，使浓度为0.25mol/L。

蔗糖为密度梯度离心用D（+）蔗糖。

（3）1%甲苯胺蓝溶液。

（4）0．02%詹纳斯绿B溶液。

四、实验步骤与方法

（一）细胞核的分离提取

1、实验前将鼠空腹12小时，击头处死，剖腹取肝，在冰浴的小烧杯中剪剪成小块（去除结缔组织），迅速用冰泠的生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水。

2、剪碎的肝组织移入玻璃匀浆管中，加入适量匀浆液，进行匀浆（注意保持冰浴状态），快速匀浆20~30次后，用匀浆液预湿的尼龙布过滤于离心管中。

3、离心（2500g，4℃下）15分钟，取上清液移入高速离心管中，并保存于冰浴中，待分离线粒体用。

4、收集的沉淀了少量匀浆液重新悬浮，以2500g离心15分钟，弃上清液。

5、加入少量匀浆液轻轻摇匀，然后制作涂片，自然干燥。

6、用1%甲苯胺蓝染色观察。

（二）差速离心分离线粒体

1、将预留的上清液以17000g4℃下离心20分钟，弃上清液。

2、加入匀浆液1ml，用吸管吹打数次，以17000g4℃下离心20分钟，将上清液吸入另一试管中，沉淀另入少量匀浆液制成悬液。

3、分别用上清液和沉淀制作涂片，用0．02%詹纳斯绿B溶液染色20分钟进行镜检（不另盖玻片）。

注意事项：

1、动物实验前必须空腹过夜，以降低肝脏中的脂肪含量。

2、实验过程中必须注意避免过于剧烈的机械操作，以保持细胞器的完整性。

3、由于核沉淀中可能依然存在大量的线粒体，故可将（4）的上清液与（3）的上清液合并保存。

4、线粒体是进行活性染色，故应尽快染色观察。

作业：

绘观察到的细胞核的线粒体图。

思考题：

试述差速离心法分离细胞器的原理。

实验六叶绿体的密度梯度离心与荧光观察

（二）

一、实验目的：

1.掌握叶绿体的密度梯度离心技术。

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，熟悉荧光显微镜的使用方法。

3.观察叶绿体以及气孔、表皮细胞、保卫细胞的形态，加深对植物组织形态的了解。

二、实验原理

采用两种浓度有蔗糖溶液制成的梯度，在离心条件下，叶绿体和比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分沉到离心管底部，此法可粗分或富集叶绿