版 生物技术与工程 第3讲 基因工程.docx

版 生物技术与工程 第3讲 基因工程.docx

《版 生物技术与工程 第3讲 基因工程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《版 生物技术与工程 第3讲 基因工程.docx（22页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

版生物技术与工程第3讲基因工程

第3讲　基因工程

[考纲展示]　1.基因工程的诞生（Ⅰ）　2.基因工程的原理及技术（含PCR技术）（Ⅱ）　3.基因工程的应用（Ⅱ）　4.蛋白质工程（Ⅰ）

考点一|基因工程的基本工具

1．基因工程的概念

（1）概念：

按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

（2）优点

①与杂交育种相比：

克服了远缘杂交不亲和的障碍。

②与诱变育种相比：

定向改造生物的遗传性状。

2．基因工程的基本工具

（1）限制性核酸内切酶（简称限制酶）。

①来源：

主要来自原核生物。

②特点：

具有专一性，表现在两个方面：

识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。

切割——特定核苷酸序列中的特定位点。

③作用：

断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

④结果：

产生黏性末端或平末端。

（2）DNA连接酶

种类

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

特点

缝合黏性末端

缝合黏性末端和平末端

作用

缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键

（3）载体

①种类：

质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。

②质粒的特点

③运载体的作用：

携带外源DNA片段进入受体细胞。

1．

（1）原核生物中限制酶为什么不切割自身的DNA?

提示：

原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰等。

（2）图甲表示EcoRⅠ限制酶及DNA连接酶的作用示意图，图乙表示SmaⅠ限制酶的作用示意图。

请据图回答问题：

①请写出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列以及切割位点。

提示：

EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。

②限制酶和DNA连接酶的作用部位相同吗？

DNA连接酶起作用时，是否需要模板？

提示：

相同，都是磷酸二酯键。

不需要模板。

1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题

（1）获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶（也可使用能切出相同末端的不同限制酶），目的是产生相同的黏性末端或平末端。

（2）获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。

（3）限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。

（4）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。

2．载体上标记基因的作用

载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。

目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。

当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：

考法1　考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用

1．（2016·全国卷Ⅲ）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

图（a）

图（b）

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_____________________________

____________________________________________________________。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。

这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是___________________

_____________________________________________________________

____________________________________________________________。

图（c）

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。

解析：

（1）由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是

，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图（b）所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。

（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。

图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。

（3）常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

答案：

（1）Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　

（2）甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录

（3）E·coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶

考法2　考查载体的作用及特点等

2．（2016·全国卷Ⅰ）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。

有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。

结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________；并且________________和_______________的细胞也是不能区分的，其原因是_______________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。

解析：

（1）质粒作为载体，应具备的基本条件有：

有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。

（2）在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。

含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。

若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。

（3）某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。

答案：

（1）能自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点（答出两点即可）

（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　（3）受体细胞

考点二|基因工程的基本操作及其应用

1．基因工程的基本程序

（1）目的基因的获取

①从基因文库中获取

②人工合成

③利用PCR技术扩增

（2）基因表达载体的构建——基因工程的核心

①目的：

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。

②基因表达载体的组成

（3）将目的基因导入受体细胞

①转化含义：

目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。

②转化方法

生物类型

植物

动物

微生物

受体细胞

体细胞

受精卵

大肠杆菌或酵母菌等

常用方法

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法

显微注射法

感受态细胞法

（4）目的基因的检测与鉴定

方法

检测或鉴定目的

水平

DNA分子杂交技术

检测目的基因的有无

分子水平

分子杂交技术

目的基因是否转录

抗原—抗体杂交

目的基因是否翻译

抗虫或抗病接种实验

是否具有抗虫抗病特性

个体水平

2．PCR技术

（1）原理：

DNA双链复制。

（2）条件

（3）过程

（4）结果：

上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。

PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。

3．基因工程的应用

（1）植物基因工程

培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物、抗逆转基因植物、利用转基因改良植物的品质。

（2）动物基因工程

①提高动物生长速度、改善畜产品的品质、用转基因动物生产药物、用转基因动物作器官移植的供体。

②乳腺生物反应器：

药用蛋白基因和乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。

（3）基因工程药品

①受体细胞：

多为原核细胞。

原因是其繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。

②成果：

生产出细胞因子、抗体、疫苗、激素等。

（4）基因治疗

①方法：

基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。

②类型：

体内基因治疗和体外基因治疗。

1．将目的基因导入受体细胞整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，能否稳定遗传？

说明理由。

提示：

一般不能。

因为仅把目的基因整合到线粒体DNA或叶绿体DNA上，细胞分裂可能导致目的基因丢失，因此无法稳定遗传。

2．用箭头及必要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。

提示：

①基因组文库的构建过程为：

某种生物全部DNA

许多DNA片段

受体菌群体。

②部分基因文库的构建过程为：

某种生物发育的某个时期的mRNA

cDNA

受体菌群

基因工程操作的四个易错点

（1）目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。

（2）基因工程操作过程中只有第三步（将目的基因导入受体细胞）没有碱基互补配对现象。

（3）农杆菌转化法原理：

农杆菌易感染植物细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。

（4）启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子

启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。

考法1　基因工程的基本操作程序分析

1．（2018·全国卷Ⅰ）回答下列问题：

（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。

该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_____________________________________________

______________________________________________________________

________________________________________________（答出两点即可）。

（2）体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。

在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。

为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

解析：

（1）两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：

质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达（不同生物共用一套密码子）、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。

（2）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是：

首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。

噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外

壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。

噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。

（3）若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。

同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。

答案：

（1）体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达

（2）转化　外壳蛋白（或答噬菌体蛋白）　细菌

（3）蛋白酶缺陷型　蛋白酶

考法2　基因工程技术的应用

2．（2017·全国卷Ⅱ）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。

通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。

回答下列问题：

（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是__________________。

提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是_____________________________________________________。

（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是_________________

______________________________________________________________

_____________________________________________________________。

（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_____________________________

______________________________________________（答出两点即可）。

（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________________________________________________。

（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是______________________________________________________________

____________________________________________________________。

解析：

（1）与老叶相比，嫩叶组织细胞易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。

提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。

（2）以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录（反转录）可以获得cDNA。

（3）因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。

（4）构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。

（5）转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。

答案：

（1）嫩叶组织细胞易破碎　防止RNA降解　

（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA　（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子　（4）磷酸二酯键　（5）目的基因的转录或翻译异常

3．（2019·福建高三质检）苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草，但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。

为提高产量，研究人员将溶菌酶基因（LYZ基因）和绿色荧光蛋白基因（GFP基因）连接为LYZGFP基因，利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中，并通过组织培养成功获得了抗病植株。

图1表示Ti质粒，其中Vir区的基因产物是TDNA转移的必备条件；图2表示含有LYZGFP基因的DNA片段。

图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。

回答下列问题：

（1）构建含有LYZGFP基因的重组质粒时，应选用限制酶________进行切割，原因是______________________________________________

____________________________________________________________。

（2）据图分析，在培育转基因苜蓿植株过程中，应选择LYZGFP基因中的GFP基因为标记基因，而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因，这种做法的优点是________________________。

（3）在组织培养过程中，对愈伤组织进行显微检测，若________，则表明细胞中GFP基因存在并表达。

（4）选择含有GFP基因的愈伤组织为材料，用PCR技术扩增并检测LYZ基因，需选用一段____________________合成引物，该过程所用到的酶必须具有________的特性。

（5）对该苜蓿植株进行病菌接种实验，通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定，原因是__________________________________

_____________________________________________________________。

解析：

（1）据图2可知，构建含有LYZGFP基因的重组质粒时，含有LYZGFP基因的片段有三个酶切位点，基因两侧没有相同限制酶，应该使用双酶切法，限制酶Ⅲ为必选。

根据图1结合农杆菌转化法的原理，所用限制酶切割位点必须在TDNA片段上，限制酶Ⅰ会切断Ti质粒本身的四环素抗性基因，但GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作为标记基因。

所以应选择限制酶Ⅰ和Ⅲ。

限制酶Ⅱ会破坏质粒中的Vir区的基因，不可选用。

（2）据图1可知，若LYZGFP基因在TDNA片段上，就能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况，这是选用GFP基因为标记基因的优点。

而卡那霉素抗性基因不在TDNA片段上，不能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，所以相对不宜选用。

（3）GFP基因的表达产物是绿色荧光蛋白，对愈伤组织进行显微检测时，若观察到绿色荧光，则表明细胞中的GFP基因存在并表达。

（4）进行PCR技术扩增并检测LYZ基因的前提，要有一段已知的LYZ基因的核苷酸序列以便合成引物。

PCR扩增过程使用的DNA聚合酶具有耐高温或热稳定的特性。

（5）LYZ基因能够表达出溶菌酶，根据免疫学知识得知：

溶菌酶是免疫活性物质，能够杀灭病菌。

因此转基因成功的苜蓿植株会表现出抗病特性。

答案：

（1）Ⅰ和Ⅲ（对Ti质粒和含有LYZGFP基因的片段）　选择限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ能获取LYZGFP基因，不会破坏质粒中的Vir区的基因，使目的基因的插入位点位于TDNA片段上　

（2）LYZGFP基因在TDNA片段上，能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上，便于追踪检测LYZ基因的表达情况　（3）观察到绿色荧光　（4）LYZ基因的核苷酸序列　耐高温（或“热稳定”）　（5）LYZ基因能够表达出溶菌酶，溶菌酶能够杀灭病菌，表现出抗病特性

考点三|蛋白质工程及应用

1．蛋白质工程

（1）概念

以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

（2）流程图

写出流程图中字母代表的含义：

A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。

2．蛋白质工程与基因工程的比较

（1）区别

项目

蛋白质工程

基因工程

过程

预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列

获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定

实质

定向改造或生产人类所需的蛋白质

定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品

结果

可生产自然界没有的蛋白质

只能生产自然界已有的蛋白质

（2）联系

①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。

②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。

1．对天然蛋白质进行改造，应该通过对基因的操作来实现，为什么不能直接对蛋白质分子进行操作？

提示：

如果对蛋白质直接进行改造，即使改造成功了，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传。

2．绝大多数酶都是蛋白质，简要表述酶工程与蛋白质工程有何区别和联系？

提示：

酶工程的重点在于对已存在的酶的合成充分利用，而蛋白质工程则是对已存在的蛋白质进行修饰改造或制造出自然界不存在的蛋白质。

酶工程是蛋白质工程的一部分。

考法　考查蛋白质工程的原理及应用

（2015·全国卷Ⅱ）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。

如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。

回答下列问题：

（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。

（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。

所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：

__________________________________________________________

____________________________________________________________。

（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

解析：

（1）从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变