不均一PCR克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作.docx

不均一PCR克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作.docx

《不均一PCR克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《不均一PCR克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

不均一PCR克隆基因的流程及分子生物学的一些基本操作

LB培养基

液态培养基

根据《分子克隆实验指南》（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著）配制每升培养基,应该在950ml去离子水中加入:

　胰蛋白胨（Tryptone）10g/L

酵母提取物（Yeastextract）5g/L

　氯化钠（NaCl）10g/L

摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi（121℃）高压下蒸汽灭菌20min.（1.05kg/cm3）

150ml的配方如下：

胰蛋白胨（Tryptone）1.5g/L

酵母提取物（Yeastextract）0.75g/L

氯化钠（NaCl）1.5g/L

固态培养基

LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。

LB固体培养基倒板

1.配制：

100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉

2.抗生素的加入：

高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

3.倒板：

一般10ml倒1个板子。

培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

4.保存：

用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

抗生素终浓度Amp100ug/ml,Kan50ug/ml.

LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是经过改造的无法在外界环境单独存活和扩增的工程菌.通过培养工程菌,我们可以表达大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的质粒,工程菌的有效扩增是生化分子实验的基础.

一、大肠杆菌质粒DNA的提取

　　质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：

　　碱裂解法：

此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。

方法如下：

　　1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。

　　2、37℃振荡培养过夜。

　　3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

　　4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，25mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合，漩涡振荡混匀。

　　5、加入0.2ml溶液II（0.4M/LNaOH，2％SDS）新鲜配制，轻轻翻转混匀（千万不可用漩涡震荡器，裂解时间不要超过5min）。

　　6、加入0.15m1预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴15min.

　　7、以12，000rpm离心10min，取上清液于另一新Ep管

8、向上清中加入等体积的酚：

氯仿：

异戊醇（去蛋白质和脂质），漩涡混匀，12，000rpm离心5min，将上清液转移到另一新Ep管

9、向上清中加入等体积的氯仿：

异戊醇（去微量酚和脂质），漩涡混匀，12，000rpm离心5min，将上清液转移到另一新Ep管

10、向上清中加入2倍体积的无水乙醇，漩涡混匀后，冰浴30min，12，000rpm离心10min，弃上清。

11、用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀2次，每次12，000rpm离心5min，弃上清，于空气中干燥（超净台上开大风干燥）或真空干燥。

12..待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中于-20°C保存。

　　煮沸法

　　1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4℃下12000g离心30秒。

　　2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

　　3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。

　　4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。

　　5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。

　　6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

　　7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

　　8、取20ml进行电泳检查。

　　[注意]1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA.

　　2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。

有时不同溶菌酶也能溶菌。

3.提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。

　　质粒DNA的大量提取和纯化

　　在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA.大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。

（一）碱法

　　1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4℃下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。

　　2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。

　　3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。

　　4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。

　　5、加入12ml新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。

　　6、加9ml用冰预冷的溶液III，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。

　　7、4℃下5000g离心15分钟。

　　8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分钟。

　　9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

　　10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10分钟。

　　11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分钟。

　　12、4℃下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12000g离心5分钟。

　　13、真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。

　　[注意]1.提取过程中应尽量保持低温。

　　2.加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡。

　　3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80℃1小时），使DNA酶失活。

　二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定

　　琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。

（1）琼脂糖凝胶电泳装置

　　由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。

对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。

使用最普遍的装置是WalterSchaffner发明的水平板凝胶。

　　水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。

在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。

凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。

凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。

（2）琼脂糖凝胶的制备

　　琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。

然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。

凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。

通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。

　　（3）琼脂糖凝胶的染色

电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。

三、大肠秆菌感受态细胞的制备

　　感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。

　　1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2mlLB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜

　　2、取0.1ml过夜培养物转种于含10mlLB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3

　　3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min.

　　4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液

　　5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min

　　6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液

　　7、将菌体悬浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。

四、质粒DNA高频转化大肠杆菌

　　制备好感受态细胞后，接下来就是质粒DNA转化入大肠杆菌细胞的过程。

但要注意的是感受态细胞最好是新制备的，因为保存一定时间的感受态细胞会使转化率降低；此外DNA的浓度也要注意，不能太高。

　　1、取新制备的一管感受态细胞。

　　2、取0.03ml感受态细胞转和4ng质粒DNA混匀，置冰浴30min

　　3、将Ep管置于42℃水浴中热冲击2分钟，立即置于冰上1分钟。

　　4、在Ep管中加70u1LB培养基混匀，37℃培养30min

　　5、涂在含适当浓度抗生素的LB平板上。

　　6、37℃培养过夜，长出的菌斑既为阳性克隆。

　　五、线形质粒DNA5‘-粘性末端去磷酸

　　经限制性内切酶酶切的质粒DNA5‘端均带有磷酸集团，如用此载体直接转化大肠杆菌，其自身环化几率非常高，影响连接、转化效率。

因此一般酶切的质粒DNA要经脱磷，使用碱性磷酸酶（CIAP）去除5’端磷酸集团。

方法如下：

　　1、质粒DNA和CIAP以及BUFFER37℃水浴30min

　　2、补充CIAP再37℃水浴30min

　　3、加入50mMEDTA至终浓度5mM75℃加热10min失活CIAP

　　4、冷却至室温，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀浓缩。

　　5、抽干溶液，加适量TE溶解。

　　六、聚合酶链式反应（PCR）技术

　　PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。

其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。

所谓引物就是与待扩增DNA片段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是ssDNA片段。

待扩增DNA模版加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。

此时，两引物的3‘端相对，5’向背。

在合适的条件下，由TaqDNA聚合酶催化引物引导的DNA合成，既引物的延伸。

上述过程是由温度控制。

这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。

PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

理论上扩增产物量成指数上升，既n个循环后，产量为2n拷贝。

典型的PCR操作过程如下：

　　1、反应体系：

体积　

成分　

工作液浓度　

终浓度　

14.0µl

PCRWater　

——　

——　

2.5µl　

10XTaqBuffer　

10X　

1X　

1.5µl　

MgCl2　

25mM

1.5mM

4.0µl

*dNTPMix　

1.25mMeachdNTP　

0.2mMeachdNTP　

0.25µl　

Primer1　

100pmoles/µl　

1µM　

0.25µl　

Primer2　

100pmoles/µl　

1µM　

0.25µl　

TaqDNAPolymerase　

5U/µl　

0.05U/µl　

2.5µl　

DNA　

25µl　

TotalReactionVolume　

　　（反应溶液可置于毛细管或薄壁离心管中扩增）

　　2、操作过程：

（所用仪器为AMP1605热循环PCR扩增仪

　　预变性：

94℃90秒

　　循环过程：

94℃1秒48℃1秒72℃40秒 40个循环

　　延伸：

72℃5分钟

　　3、检测：

琼脂糖电泳检测。

超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）

实验准备

第一次使用前，请按试剂瓶标签说明在15ml漂洗液PW中加入60ml无水乙醇!

所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

试剂盒在使用前请检查溶液是否出现浑浊，如有浑浊现象，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，再使用。

操作步骤

1．柱平衡步骤：

向吸附柱CA1中（吸附柱放入收集管中）加入500μL的平衡液BL，12000rpm（~13400×g）离心一分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1重新放回收集管中。

（请使用当天处理过的柱子）

2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。

3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；当回收的目的片段<150bp或琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100μl，依此类推）。

50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。

注意：

胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。

4.将吸附柱CA1放入收集管中，用移液器将上一步所得溶液转移至吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm室温离心30~60秒，倒掉收集管中滤液，将吸附柱CA1放入收集管中。

注意：

吸附柱容积为800μL，若样品体积大于800μL可分别加入。

5. 向吸附柱CA1中加入600µl漂洗液PW（使用前请先检查是否加入无水乙醇），室温放置2分钟。

12,000rpm室温离心30~60秒，倒掉收集管中滤液。

将吸附柱放入收集管中。

注意：

如果纯化的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议加入漂洗液PW后，静置2-5分钟再离心。

.

6.向吸附柱中CA1加入600µl漂洗液PW，室温放置2分钟。

12,000rpm室温离心30~60秒，倒掉收集管中滤液。

将吸附柱CA1放入收集管中。

7. 将吸附柱CA1放回收集管中于12,000rpm室温离心2分钟，尽量除去残留的漂洗液PW。

取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液。

注意：

漂洗液WB的残留会影响DNA的回收效率，会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。

8. 向吸附柱CA1中间部位悬空滴加20~50μL洗脱液EB（10mMTris-HClpH8.5）或灭菌双蒸水（pH＞7.0），室温静置2分钟。

12,000rpm室温离心2分钟洗脱DNA。

注意：

洗脱缓冲液EB置于65-70℃水中预热可提高回收率（DNA片段>10kb，建议用65-70℃预热后的EB洗脱）。

DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

注意：

洗脱体积不应少于20μL，体积过少会影响回收的效率。

洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大的影响。

若后续做测序，需使用去离子水做洗脱液，并保证其PH值在7.0—8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物保存在-20°C，以防止DNA降解。

DNA也可以用缓冲液（10mMTris-HClpH8.5）洗脱。

为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤8.

DNA浓度及纯度检测

l 测定方法：

回收得到的DNA片段可用紫外分光光度计检测浓度与纯度，也可用琼脂糖凝胶电泳粗略估计；

l 浓度计算：

DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA；计算公式为：

 dsDNA浓度=A260*50*稀释倍数µg/ml      

 ssDNA浓度=A260*40*稀释倍数µg/ml

纯度恒量：

OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

感受态细胞的制备以及转化：

1.从37°C过夜（12-24hours）培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。

把这样的单菌落接种于一只装有3毫升LB培养基的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。

2.取0.4毫升过夜培养物于一只装有40毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中.于37°C下振荡培养2到3小时（此时细菌处于对数生长期，A60应在0.4~0.5之间）。

3.将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。

4.4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞。

5.弃培养基，保留细胞沉淀。

6.加入10毫升冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，并轻微打匀，冰浴放置30min。

7.4°C下，4000rpm离心10分钟收集细胞。

8.弃CaCl2溶液，保留细胞沉淀。

9.加入2毫升冰冷的0.1M的CaCl2溶液，并轻微打匀。

。

补充.此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。

10.向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。

向每个转化管中加入质粒DNA（一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克）。

细心混匀管中成份。

于冰浴放置30分钟。

11.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时45秒。

（此时不能摇动转化管）

12.把试管迅速转移至冰浴2分钟。

复苏，涂平板和菌落培养

13.向每只试管中加入800微升LB培养基。

37°C培养60分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

14.转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。

一般是AMP

15.室温放置平板直到其上液体被吸收。

一般半个小时，量多的时候。

16.于37°C倒置平板培养。

转化克隆应该于12-16小时区间出现。

扩大培养：

从含有AMP的LB培养基中用枪头挑取十个白斑菌于含有1mlLB液体培养基的7ml试管中。

枪头直接打入培养基中。

每个试管做好标记。

震荡培养12~14小时，200rmp。

观察菌生长状况。

（一天）

质粒快速提取：

1取500μL菌液于1.5ml灭菌试管中，做好标记，以便进行区别。

2于12000rmp离心1min，去上清（留大约50μL），漩涡振荡。

3加酚氯彷50μL于离心管中，取酚氯彷时取最底下一层。

然后漩涡振荡30s，混匀后于12000rmp离心5min。

4取第三步骤中的最上层10μL进行凝胶电泳，进行验证。

时间根据数提取量多少而定，一般三四个小时。

扩大培养：

对电泳进行分析，找出符合要求的DNA片段对应的菌落，于无菌条件下进行平板培养，并进行扩大培养，然后进行菌落测序。

该过程扩大培养的步骤如下：

于无菌条件下，取菌液500μL于含有10mlLB培养基的灭菌50ml试管中，于37°C下振荡培养12~14小时。

转速为200rmp。

一般过夜培养。

一天

菌落测序：

于无菌条件下，取培养的菌液500μL于灭菌的1.5ml试管中，然后加入等体积的甘油，进行保菌，然后进行菌落测序。

一小时

PHBc基因5'端克隆

第一轮次不均一PCR:

×14

25μL反应体系：

10×Easybuffer2.5μL35

Phbc5-1（10μM）0.5特异引物7

RP1~12（μM）0.1随机引物单独加

Template0.5模板7

dNTP228

ExTaq0.34.2

H2O19.1267.4

25μL

反应条件：

95°C5min

94°C30s

56°C1min

72°C1min10s20cycle12个管分别标记为515253545556

94°C15s575859510511512

42°C1min

72°C1min10S

72°C10min

第二轮次不均一PCR:

×12

25μL反应体系：

10×Easybuffer2.5μL30

Phbc5-2（10μM）0.5特异引物6

RP1~12（1μM）1随机引物单独加

Template（第一轮次产物）0.5模板单独加

dNTP224

ExTaq0.33.6

H2O18.2218.4

25μL

反应条件：

95°C5min

94°C30s

58°C1min

72°C1min10s20cycle12个管分别标记为521522523524525526

94°C15s527528529521052115212

42°C1min

72°C1min10s

72°C10min

第二轮次不均一PCR中，PHBc5'端基因521--5212扩增得到几乎一致的1kb条带，仅527还有一条分子仅0.8Kb大小的条带。

切胶521（5A）527（5B）1.0Kb527（5C）0.8Kb5212（5D）1.0Kb

PCR结果：

几乎4个PCR条带一致，浓度很高，说明扩增到目的条带。

333bp

然后于室温下溶于20μL的ddH2O中并捣碎溶解，大约1min后析出的DNA全溶于水中，取2μL做模板，进行PCR验证。

剩余的PCR产物保存。

凝胶电泳第二轮次PCR的产物（8μL），切胶1KB大小左右的亮带，然后溶于30μL的ddH2O中。

剩余的PCR产物保存。

然后进行PCR验证:

25μL反应体系：

×4

10×EasyTaqbuffer2.5μL10

Phbc—9（10μM）0.5引物2

Phbc-9（10μM）0.5引物2

切下PCR溶解DNA2模板

dNTP28

EasyTaq0.31.2

H2O17.268.8

25μL

反应条件：

95°C5min

94°C30s

56°C40s30cycle目的基因大小为333bp

72°C30s

72°C10min

对符合要求的第二轮次PCR产物，重新进行PCR，对PCR产物进行凝胶电泳，并切胶进行回收，再进行TA克隆。

一班过夜连接。

酶链

10.向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。

向每个转化管中加入质粒DNA（一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克）。

细心混匀管中成份。

于冰浴放置30分钟。

11.把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时45秒。

（此时不能摇动转化管）

12.把试管迅速转移至冰浴2分钟。

复苏，涂平板和菌落培养

13.向每只试管中加入800微升LB培养基。

37°C培养60分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。

14.转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。

一般是AMP

15.室温放置平板直到其上液体被吸收。

一般半个小时，量多的时候。

16.于37°C倒置平板培养。

转化克隆应该于12-16小时区间出现。

扩大培养：

从含有AMP的LB培养基中用枪头挑