水稻非光化学猝灭过程的调控机制.docx

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水稻非光化学猝灭过程的调控机制

项目文章：

华中农业大学NewPhytol揭示水稻非光化学猝灭过程的调控机制

研究背景

2020年8月3日，NewPhytologist在线发表了华中农业大学王功伟

团队的研究成果。

文章标题：

ThecoordinationofOsbZIP72andOsMYBS2withreverserolesregulatesthetranscriptionofOsPsbS1inrice。

本研究迈维代谢提供了植物激素检测。

非光化学猝灭（NPQ）是一种复杂的光保护过程，在维持植物适应性方面起着重要作用。

PsbS蛋白是快速诱导NPQ所必需的，并且在叶片中以剂量依赖的方式发挥作用。

然而，在陆地植物中PsbS的转录控制却鲜为人知。

这里证明OsbZIP72直接上调OsPsbS1的表达，而OsMYBS2则抑制OsPsbS1的表达。

在粳稻OsPsbS1启动子中发现了一个新的顺式元件GACAGGTG，OsbZIP72能与其结合并激活OsPsbS1的表达。

新的顺式元件CTAATC在粳稻OsPsbS1启动子中与OsMYBS2特异性结合。

OsbZIP72可被SAPK1激活，并依赖ABA信号通路发挥作用。

GF14A蛋白通过调节核细胞穿梭来影响OsMYBS2的阻遏活性，Ser53是OsMYBS2存在细胞质必需的。

OsbZIP72基因敲除系在强光条件下OsPsbS1转录被抑制，而OsMYBS2基因敲除系在弱光条件下OsPsbS1转录被抑制则明显减弱。

这些结果揭示了NPQ过程、ABA信号转导途径和非生物胁迫信号转导途径之间的相互作用机制，有助于增强水稻的光保护作用和光合作用的研究。

研究思路：

研究材料：

Nipponbare或Zhonghua11野生型及转基因材料OsbZIP72-cri、z3-cri、OsMYBS2-cri、OsbZIP46-cri、OsbZIP23-OX、OsbZIP23-mut、OsbZIP46-OX。

技术路线：

研究结果

1.酵母单杂交—筛选转录因子：

OsbZIP23、OsbZIP46、OsbZIP72、OsMYBS2与OsPsbS1启动子互作

为了鉴定能够调控OsPsbS1表达的转录因子，以典型粳稻OsPsbS1启动子-689~-35区段进行酵母单杂交筛库，鉴定到了3个ABF家族转录因子OsbZIP72，OsbZIP23，OsbZIP46和一个MYB转录因子（OsMYBS2）能够与OsPsbS1启动子区域相互作用。

2.酵母单杂交—确定结合区域：

OsbZIP72优先与粳稻OsPsbS1启动子的GACAGGTG元件结合

通过296份核心种质转录组的分析，发现OsbZIP72的表达量与OsPsbS1的表达量相关性最高，于是将研究的重点放在OsbZIP72上。

为了寻找OsbZIP72在典型粳稻OsPsbS1启动子-689~-35区段的具体结合位置以及鉴定OsbZIP72的结合序列，将OsPsbS1启动子-689~-35区段（命名为片段F）及其5个5’末端截短的衍生片段（片段A到片段E）分别克隆到载体pAbAi，转录因子OsbZIP72构入载体pGADT7，进行了酵母单杂交分析。

结果表明，片段A含有OsbZIP72结合位点（图1）。

为进一步限定特异结合位点所在区域，片段A进一步分成3个首尾重叠的亚片段，酵母单杂交实验表明，亚片段A_2含有结合位点（图1）。

接下来利用凝胶阻滞电泳（EMSA）进一步限定转录因子OsbZIP72的结合区域。

EMSA显示OsbZIP72与GACAGGTG元件体外结合的特异性。

图1OsbZIP72直接与水稻的OsPsbS1启动子结合。

（a）日本晴中OsPsbS1启动子截短片段的示意图。

转录起始位点为+1。

（b）酵母单杂交结果显示OsbZIP72结合位点位于启动子截短片段A_2区域。

将不同截短的启动子片段分别克隆到pAbAi载体中，将OsbZIP72的全长CDS序列融合到pGADT7载体中。

在缺乏Leu并添加1000ngml−1AureobasidinA（SD/-Leu+AbA1000）的选择培养基上鉴定相互作用。

阳性对照为pGADT7-53和pAbAi-p53，阴性对照为pGADT7和pAbAi-p53。

酵母的不同菌落点是生物学重复。

3.基因功能分析—RNA-Seq、RT-qPCR、瞬时表达：

OsbZIP72直接上调OsPsbS1的表达，并与GACAGGTG互作导致NPQ值变化

为了研究鉴定出的3个水稻ABF成员（OsbZIP72、OsbZIP23和OsbZIP46）是否能够直接正向调控OsPsbS1的表达，以及典型粳稻启动子中的结合元件GACAGGTG对OsPsbS1表达的影响，在水稻原生质体中进行了双荧光素酶瞬时转录活性测定。

结果显OsbZIP72在籼稻和粳稻中均可直接正向调控OsPsbS1的表达（图2b）。

ABA处理后OsbZIP72的转录活性大大增强，说明OsbZIP72依赖于ABA信号通路发挥作用。

比较两个截短的启动子发现，在OsbZIP72转染的原生质体中，PPsbS1-204的相对活性明显高于PPsbS1-34（图2b），说明典型粳稻启动子中新的OsbZIP72结合元件GACAGGTG对上调OsPsbS1表达有很显著的作用。

然而，与空白载体对照相比，当使用PPsbS1-204或PPsbS1-34驱动报告基因时，检测到OsbZIP23和OsbZIP46的转录激活活性没有显著或仅略有增加（图2b）。

OsbZIP72结合元件的CRISPR转基因材料的NPQ值相较与野生型有显著下降，显示该结合元件能够通过调控OsPsbS1的表达从而影响水稻的光保护能力。

利用296份水稻材料的转录组数据，分析了OsbZIP72、OsbZIP23和OsbZIP46的表达水平与OsPsbS1表达水平或NPQ值之间的相关性。

依据OsPsbS1启动子的差异将296份材料分成两个组，首先对其中启动子上同时含有共同结合位点S3片段和GACAGGTG元件的83份材料进行了分析，结果显示OsbZIP72表达水平与OsPsbS1表达水平呈高度正相关（r=0.57,P=1.55×10-8），另外213份启动子上仅包含S3共同结合位点的材料中，OsbZIP72表达水平与OsPsbS1表达水平也呈显著正相关（r=0.35,P=1.58×10-7）。

此外，与OsPsbS1相似，83份材料中OsbZIP72表达水平与2年NPQ值呈显著正相关。

在这个83份材料的组份中，OsbZIP46和OsPsbS1的表达水平之间存在显著的正相关关系。

但除此以外，未发现其它任何与OsbZIP23或OsbZIP46表达量之间的显著相关性。

图2OsbZIP72直接正调控OsPsbS1的表达。

（a）用于水稻原生质体共转染试验的构建方案。

（b）OsbZIP72激活OsPsbS1启动子驱动的报告基因表达。

报告构建物包含截短的OsPsbS1启动子PPsbs1-204或PPsbS1-34、萤火虫荧光素酶（LUC）基因和Nopaline合成酶（Nos）终止子。

效应子结构包含由CaMV35S启动子驱动的OsbZIP72、OsbZIP23或OsbZIP46的编码区。

空质粒作为对照。

fLUC/rLUC比值代表启动子的相对活性。

转染后，一半的原生质体与100µM孵化脱落酸（ABA）对4小时。

每一列的值代表三个独立重复的平均值，误差线表示标准差。

柱状图上不同的大写字母表示存在极显著差异（Duncan检验，P<0.01）。

4.基因调控分析—酵母双杂、瞬时表达：

SAPK1可以激活OsbZIP72，从而增强OsPsbS1启动子活性

使用酵母双杂交分析，用OsbZIP72检测了7个水稻SAPK家族成员。

结果表明OsbZIP72可以与SAPK1相互作用，但不能与SAPK2和SAPK6相互作用（图3a）。

BiFC进一步证实了OsbZIP72与SAPK1的相互作用（图3b）。

亚细胞定位确认OsbZIP72蛋白定位在细胞核中（图3c）。

为了验证SAPK1是否能激活OsbZIP72从而提高OsPsbS1启动子活性，进行了双荧光素酶瞬时转录活性检测。

发现SAPK1与OsbZIP72共转化水稻原生质体时，启动子活性显著增加（图3d,e），说明OsbZIP72可以被SAPK1激活且增强其转录能力。

在ABA处理下，OsbZIP72的转录活性也大大增强（图3d,e），再次表明OsbZIP72的转录激活作用是依赖于ABA信号通路。

为了进一步证实是SAPK1的激酶活性激活了OsZIP72，使用了SAPK1的两个激酶活性丧失变异体进行双荧光素酶瞬时转录活性检测。

结果表明，与SAPK1相比，当SAPK1（K33E）或SAPK1（D123A）与OsbZIP72共转化水稻原生质体时，启动子活性显著降低（图3d,f,g）。

与空白载体对照相比，SAPK1（K33E）或SAPK1（D123A）的启动子活性均无显著差异（图3d,f,g）。

这些结果表明SAPK1的两个激酶活性丧失变异体失去了激活OsbZIP72和提高OsPsbS1启动子活性的能力，也显示ATP结合位点和催化核心保守残基对SAPK1激酶活性的重要性。

图3.OsbZIP72可以被SAPK1激活

（a）酵母双杂检测OsbZIP72与SAPK1的互作。

（b）BiFC实验。

比例尺=10µm。

（c）亚细胞定位。

比例尺=10µm。

（d）原生质体侵染载体的构建。

（e）OsbZIP72可被SAPK1激活，并依赖于ABA信号通路。

（f,g）突变SAPK1（K33E）和SAPK1（D123A）激活OsbZIP72（D123A）失去了能力。

误差线表示标准差（n=3）。

差异显著性用Duncan’stest检验，P<0.01为差异显著。

5.基因调控分析—酵母双杂、EMSA、ChIP-qPCR：

粳稻中OsMYBS2可特异性结合OsPsbS1启动子区域

酵母单杂交表明OsMYBS2结合位点位于日本晴OsPsbS1启动子的-689bp至-588bp区域（片段F）。

为了确定新的结合元件，为了进一步缩小OsMYBS2的结合位点，接下来用凝胶迁移实验（EMSA）测试了OsMYBS2在体外结合DNA序列的情况。

随后鉴定出27bp探针Y1（来自日本晴OsPsbS1启动子的-689bp~-588bp区域）上的CTAATC基序对于结合很重要。

为了进一步确定OsMYBS2能否在体内与典型粳稻OsPsbS1启动子中的CTAATC元件结合，进行了ChIP-qPCR分析。

发现OsPsbS1的启动子片段显著富集在P1，证实了OsMYBS2在体内与OsPsbS1的启动子区域CTAATC元件结合。

6.基因功能分析—构建突变体、瞬时表达、RT-qPCR：

OsMYBS2是一种转录抑制因子，可抑制OsPsbS1的表达

在水稻原生质体中进行了双荧光素酶瞬时转录活性分析。

OsMYBS2与GAL4BD融合作为效应子质粒，以5个拷贝的GAL4结合元件组成的启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因和拟南芥ubiquitin启动子驱动的海肾荧光素酶报告基因作为内参（GAL4-fLUC；图3a），一起共转化水稻原生质体。

与OsMYBS2融合后，检测到启动子活性显著下降（图3b），这表明OsMYBS2是转录抑制子。

为了研究OsMYBS2对含有OsPsbS1启动子的活性影响，选取了一段含有OsMYBS2结合元件的27bp序列Y1，并用Y1片段的五个串联重复序列取代了GAL4结合位点（见图3a），以此来模拟OsPsbS1启动子。

结果表明，在转染OsMYBS2时，启动子活性也被显著抑制（图3c）。

综合上述实验，OsMYBS2是一个转录抑制子，对下游靶基因OsPsbS1有抑制活性。

为了进一步证实OsMYBS2对OsPsbS1的负调控，在OsMYBS2突变体中对下游靶基因OsPsbS1的表达量进行了RT-qPCR检测，结果表明，osmybs2-cri-4和osmybs2-cri-3T2代剑叶中OsPsbS1的表达水平极显著高于野生型。

另外OsMYBS2突变体还表现出明显更高的NPQ值（图3f）。

图4.OsMYBS2是一个转录抑制因子，负调控OsPsbS1的表达。

（a）用于水稻原生质体转化的载体构建示意图。

（b）OsMYBS2是一种转录抑制因子。

（c）OsMYBS2抑制包含CTAATC元件的OsPsbS1启动子片段的转录。

误差线表示标准差（n=3）。

差异显著性用Student’stest检验，**P<0.01为差异显著。

（d-f）OsMYBS2功能缺失导致OsPsbS1表达水平升高，NPQ值升高。

误差线表示标准差（n≥20）。

**表示P<0.01（Student’st-test）。

7.基因表达分析—酵母双杂、瞬时表达、亚细胞定位：

GF14A蛋白通过调控OsMYBS2的核质穿梭抑制其活性

为了进一步阐明OsMYBS2转录调控OsPsbS1的机制，进行了酵母双杂交筛库以鉴定与OsMYBS2相互作用的蛋白。

筛选了约106个酵母转化体，并鉴定出13个阳性克隆，其含有相同的cDNA，其全长序列编码水稻GF14A（14-3-3）蛋白。

BiFC进一步证实了OsMYBS2和GF14A之间的相互作用。

为了研究具体哪个氨基酸对其与GF14A的互作至关重要，在酵母双杂交实验中，将可能结合基序中每个氨基酸都逐个替换为丙氨酸（Ala）。

结果表明，只有OsMYBS2（S53A）失去了与GF14A互作的能力。

随后又用双荧光素酶报告系统研究了S53A突变可能对OsMYBS2转录活性的影响，结果表明，与OsMYBS2相比，转染OsMYBS2（S53A）时启动子活性受到更显著的抑制。

亚细胞定位表明OsMYBS2在细胞核和细胞质中均有定位。

35S:

OsMYBS2（S53A）-GFP构建体转染了水稻原生质体，发现突变的OsMYBS2（S53A）-GFP蛋白仅定位在细胞核中，表明Ser53是OsMYBS2被GF14A蛋白保留在细胞质中所必需的，并且GF14A通过与OsMYBS2相互作用来控制其质核穿梭。

8.基因表达分析—不同光照处理、RT-qPCR、激素检测：

光照强度影响OsPsbS1及其调控因子的表达水平

为研究光照强度对日本晴幼苗中OsPsbS1及其调节因子的表达的影响，将日本晴幼苗置于光照培养箱中生长，依次施以1200、120、1200和120μmolm-2s-1不同光强照射，各光强持续30分钟。

在每次照射结束时，即在光强调节之前采集叶片样本。

RT-qPCR分析证实强光条件下OsPsbS1的表达显著增加（图5c）。

此外，OsbZIP72和SAPK1的表达水平在强光条件下均上调，而在弱光条件下则受到抑制（图5c），其模式与OsPsbS1非常相似。

由于光强显著影响OsPsbS1及其调节因子的表达，想知道在强光和弱光照射时OsbZIP72的CRISPR突变体材料中OsPsbS1表达水平的变化。

于是将CRISPR株系及其野生型日本晴幼苗置于生长室内，依次施以1200、120、1200和120μmolm-2s-1不同光强的处理，各光强处理2小时，其他与上述条件完全相同。

RT-qPCR分析证实，与相应的野生型相比，osbzip72-cri-8中OsPsbS1的表达水平显著降低（图5e）。

此外，osbzip72-cri-8中OsPsbS1在强光下的诱导能力大大减弱（图5e）。

然后测定了不同光照条件下的ABA含量。

结果表明，强光条件下ABA含量显著增加（图5g）。

图5.不同光照下水稻叶片OsPsbS1及其调控因子的表达和ABA含量。

（a,b）不同光照下OsPsbS1在不同时间点的表达水平。

误差线表示标准差（n=3）。

差异显著性用Duncan’stest检验，P<0.01为差异显著。

（c,d）OsPsbS1及其调控因子的表达水平。

误差线表示标准差（n=3）。

差异显著性用Duncan’stest检验，P<0.05为差异显著。

（e）和（f）OsbZIP72（e）或OsMYBS2（f）中OsPsbS1在不同光照下的表达水平。

误差线表示标准差（n=3）。

*表示P<0.05，**表示P<0.01（Student’st-test）。

（g）不同光照下ABA含量。

误差线表示标准差（n=3）。

*表示P<0.05（Student’st-test）。

小结

研究目的：

探究了NPQ过程、ABA信号转导途径和非生物胁迫信号转导途径之间的相互作用机制。

研究结论：

OsbZIP72直接上调OsPsbS1的表达，而OsMYBS2则抑制OsPsbS1的表达。

OsbZIP72可被SAPK1激活，并依赖ABA信号通路发挥作用。

GF14A蛋白通过调节核细胞穿梭来影响OsMYBS2的阻遏活性，Ser53是OsMYBS2存在细胞质必需的。

OsbZIP72基因敲除系在强光条件下OsPsbS1转录被抑制，而OsMYBS2基因敲除系在弱光条件下OsPsbS1转录被抑制则明显减弱。

小维总结：

本研究揭示了非光化学猝灭的调控机制，非光化学猝灭过程受到ABA激素的调控，迈维代谢为老师提供优质植物激素检测服务，助力老师快速发文。

原文链接：

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