实验部分.docx
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实验部分
前言
甘松为败酱科（Valerianaceae）甘松属（NardostachysDC.）植物甘松（NardostachyschinensisBatal.）及匙叶甘松（NardostachysjatamansiDC.）的根及根茎，个别地区亦用大花甘松香（NardostachysgrandifloraDC.）。
本属共3种，分布于喜马拉雅山区，我国产2种，分布于四川、青海、云南和西藏。
甘松自古即入药，最早见于唐代《本草拾遗》和五代《海药本草》，其后宋代《开宝本草》正式收载。
甘松性味辛甘、温，在临床用于治疗心律不齐、胃脘痛、胃及十二指肠溃疡、癫痫等多种疾病。
由于甘松属植物在临床上的多方面长期应用，从而引起了国内外学者的关注。
目前我国对甘松属植物的研究已取得了一定成果，但由于各地区物种分布和用药的历史差异，其临床应用非常混杂，虽已被药典收载，但很少被开发为其他产品，如各种制剂、香料及功能性饮料等具有较高商业经济价值得产品。
如何合理充分使用我国现有的甘松药材资源，成为摆在我们面前亟待解决的问题，想要改变这种状况，就有必要对国内甘松资源进行科学、系统的研究分类。
本实验主要针对收集的不同产地的甘松进行生药学鉴别区分，以及与同科败醬、缬草属的药用植物在化学成分上进行对比，从生药学及化学分类学进行分析比较，为甘松属植物的生药，药理，药效学研究提供依据。
实验部分
1败酱科甘松属药用植物化学成分的薄层层析
1.1正己烷提取物部分
1.1.1仪器和试药
薄层载体：
硅胶GF254板5x10cm（青岛海洋化工厂）；展开剂：
正己烷-乙酸乙酯（7:
3）+5drop乙酸；层析缸：
10x5x10cm。
其它溶剂、试剂均为分析纯。
1.1.2样品
以下药材经粉碎后，各取5g，用正己烷5ml进行超声波提取（29-32℃，25Hz，30min）。
蜘蛛香提取物（缬草素）作对照。
（表1）
编号
药材名称来源
1
2
3
4
5
6
7
8
甘松香安国购，四川产
甘松香云南购，四川产
甘松香四川阿坝产购
甘松香四川产购（地区不明）
甘松香甘肃产购
蜘蛛香安国购，贵州产
黄花败醬植物标本（04.08河北隆化采集）
蜘蛛香提取物可能为缬草素
1.1.3方法
点样：
毛细管吸取提取液直接点样；展距：
8.5cm；观察方法：
紫外254nm条件下荧光观察暗斑；
1.1.4结果：
Y
X
1
2
3
4
图1
1.2二氯甲烷提取物部分
1.2.1仪器和试药
薄层载体：
硅胶GF254板5x10cm（青岛海洋化工厂）；展开剂：
正己烷-乙酸乙酯（7:
3）+5drop乙酸；层析缸：
10x5x10cm。
其它溶剂、试剂均为分析纯。
1.2.2样品
经正己烷提取后的药材残渣自然挥干，再用5ml二氯甲烷进行超声波提取（29-32℃，25Hz，30min）。
蜘蛛香提取物（缬草素）作对照。
（表2）
编号
药材名称来源
1
2
3
4
5
6
7
8
甘松香安国购，四川产
甘松香云南购，四川产
甘松香四川阿坝产购
甘松香四川产购（地区不明）
甘松香甘肃产购
蜘蛛香安国购，贵州产
黄花败醬植物标本（04.08河北隆化采集）
蜘蛛香提取物可能为缬草素
1.2.3方法
点样：
毛细管吸取提取液直接点样；展距：
8.5cm；观察方法：
紫外254nm条件下荧光观察暗斑；
1.2.4结果：
Y
X
5
X
1
1
图2
1.3甲醇提取物部分
1.3.1仪器和试药
薄层载体：
硅胶GF254板5x10cm（青岛海洋化工厂）；展开剂：
乙酸乙酯-甲酸-乙酸-水-甲苯（10:
2:
1:
2.6:
3）；层析缸：
10x5x10cm。
其它溶剂、试剂均为分析纯。
1.3.2样品
经二氯甲烷提取后的药材残渣自然挥干，再用5ml甲醇进行超声波提取（29-32℃，25Hz，30min）。
绿原酸标准品作对照。
（表3）
编号
药材名称来源
1
2
3
4
5
6
7
8
甘松香安国购，四川产
甘松香云南购，四川产
甘松香四川阿坝产购
甘松香四川产购（地区不明）
甘松香甘肃产购
蜘蛛香安国购，贵州产
黄花败醬植物标本（04.08河北隆化采集）
绿原酸标准品卫生部药品生物制品检定所
1.3.3方法
点样：
毛细管吸取提取液直接点样；展距：
8.5cm；观察方法：
喷5%硫酸乙醇溶液，荧光观察；110℃烘15分钟，显色观察；
1.3.4结果：
图3
图4
图5
图6
1.5分析与讨论
1.5.1正己烷与二氯甲烷提取部分的薄层分析
甘松药材正己烷与二氯甲烷提取部分的薄层特征有明显的相似性，而且正己烷提取物的斑点特征更为明显，可见这两种溶剂分别提取的甘松化学成分相似，以萜类物质为主，主要为环烯醚萜类。
在对不同产地甘松正己烷提取物的薄层比较中我们可以看到，甘松的特征斑点主要集中在薄层板的中上部位（图1中的1、2、3、4）；在与同科其他两属植物蜘蛛香和黄花败醬比较中发现，蜘蛛香的特征斑点主要为X、Y，经文献参考得知[43]，该两种物质缬草素类物质；黄花败醬的特征斑点除有X较为明显外，其他均不明显。
在二氯甲烷提取物部分中甘松特征斑点与正己烷部分相同，并且物质1明显；蜘蛛香的特征斑点仍为缬草素类物质，但在X、Y之间出现了物质1的特征斑点；黄花败醬的特征斑点中与正己烷部分不同出现了物质1的特征斑点，没有缬草素类物质（图3）。
参考文献所述中，甘松中应还有缬草素类物质，但图1、3中并未显示出甘松中还有缬草素类物质。
于是改变点样条件，不采取直接点样，而是将甘松提取液蒸干后用甲醇溶解后点样。
结果为甘松薄层中有缬草素类物质的特征斑点，表明甘松中存在缬草素类物质。
因提取溶剂极性的不同，薄层展开的效果，甚至是结果会有不同。
所以可以采用相同溶剂进行点样，以便消除因溶剂极性带来的误差。
由此也给我们在临床研究中发现的甘松与缬草在一些药理作用方面上（如解痉、镇静、镇痛、对循环系统）相似的现象提供了解释的依据。
图7.1
图7.2
图8.1
图8.2
甘松1
甘松2
甘松5
图9
1.5.2甲醇提取部分的薄层分析
文献显示，败醬科植物中还有多种有机酸，这些在药理活性中起着较为重要的作用，因此以绿原酸作为对照品，观察败醬科植物甘松中是否含有有机酸，并用其科中其他两属植物蜘蛛香和黄花败醬作比较。
甲醇提取部分的薄层分析结果显示，甘松植物中含有绿原酸。
由此为临床的甘松的使用提供了依据。
1.5.3不同产地甘松在成分含量上的差异
从薄层结果分析来看，不同产地甘松在成分上没有明显不同；但是在相同提取系统、相同点样量的条件下，从斑点的大小及清晰度角度来看，不同产地甘松的成分含量的确有差异。
因此提示我们在购买甘松药材或临床使用、研究中应注意选择产地；在甘松的采收及贮存中也应当注意方式、方法，使有限的资源达到最大程度的利用。
2甘松药材生药学研究
2.1不同产地甘松根及根茎横切面的石蜡切片制作
2.1.1甘松药材的取材
本实验共有5组样品，分别为四川产购，四川阿坝产购，四川产安国购，四川产云南购，甘肃产购。
将上述材料分别进行筛选，选出合适的干才，加水浸泡，目的是去除泥土杂质，去除非利用部位。
由于甘松药材属于干材，应待其浸软后再进行加工处理。
在此过程中应注意更换用水，观察其质地变化；取材应选择典型的无虫柱、无霉烂，适合制片所用的材料，用烧杯放入适量水浸没即可。
2.1.2甘松药材的切割与抽气
将已浸泡好的甘松药材取出，分组标明，再用水冲洗干净，选好取材部位，进行切段，将其切成0.5～1cm厚的小段即可。
将切好后的甘松药材小段装入平底儿试管中，加入适量水浸没，放入抽气瓶中（抽气系统），进行抽气，目的是将药材甘松组织间隙的空气除净，以便不影响制片。
抽气时要观察试管中药材的运动变化，以及气泡的数量，待药材全部沉到底部后为止。
2.1.3甘松药材的脱水
用不同浓度的脱水剂对药材进行脱水，利用梯度脱水原理，将药材中的水分完全脱净，每个浓度梯度浸泡15分钟。
浓度梯度为10％－20％－30％－40％－50％－60%－70%－85%－95%－100%－100%。
在100％乙醇中要更换浸泡两次。
在此过程中应当注意的一点是在高浓度的乙醇（80％～100％）中放置的时间不能过长，为防止药材的材料变脆。
2.1.4甘松药材的透明
用不同浓度的二甲苯与无水乙醇的混合溶液对药材进行透明，目的是使材料透明，便于石蜡浸入材料的细胞中。
混合溶液分别是25％二甲苯－75％二甲苯－100％二甲苯－100％二甲苯。
每个浓度级浸泡20分钟，在100％二甲苯中要更换浸泡两次。
在此过程中也应当注意的一点是在高浓度的二甲苯（100％）中放置的时间不能过长，为防止药材的材料变脆。
2.1.5甘松药材的浸蜡
先将切片石蜡熔化。
切片石蜡的熔点为52～54摄氏度，其主要成分为石蜡和二甲基亚砜。
熔化时的温度控制在56摄氏度，略微高于熔点。
准备工作完毕后，开始浸蜡。
浸蜡的目的是使材料的各个细胞中完全充满石蜡，使组织间有介质作为支撑，便于最后的切片。
将透明好的甘松药材试管中的二甲苯弃去一部分，使其刚刚浸没药材即可。
用滴管吸取剩余体积约1/8的纯石蜡，滴加入试管中，放入“生物制片快速处理仪”（以下简称“快速处理仪”）的浸渗室中，待石蜡完全熔化后计时15分钟。
此过程重复七次。
第九次时，将试管中的液体弃去一半，再向试管中加入纯石蜡至原体积，再放入“快速处理仪”中，待完全熔化后再计15分钟。
上述步骤完成后将试管中的液体全部弃去，加入纯石蜡浸没，再放入“快速处理仪”中，待完全熔化后计15分钟。
此过程重复一次。
最后使石蜡充满每个细胞。
2.1.6甘松材料的包埋
包埋材料的目的是将材料包在石蜡中，形成一定大小的蜡块，便于切片。
包埋时要准备三脚架、酒精灯、镊子、解剖针、铜制包埋器、玻璃板，以及凉水一盆。
铜制包埋器使用前在内面涂上一层液体石蜡，放在玻璃板上，构成一个矩形，将熔化的纯石蜡倒入铜制包埋器中，将浸蜡后的材料倒入蒸发皿中，在酒精灯上微微加热，把镊子在酒精灯上加热，再将材料轻轻夹到包埋器中，排好位置和方向，再把解剖针在酒精灯上加热，驱除石蜡中的气泡，待四周及表面的石蜡开始凝固一层时，把写好的标签贴在石蜡块上，把它放入冷水中彻底冷却后，取出去掉包埋器。
2.1.7甘松蜡块的切片
切片之前的准备工作，使用回旋式切片机，先检查刀口是否完整无缺刻；将载玻片、盖玻片放在在洗液中浸泡1～2小时，取出，用清水洗去玻璃片上的洗液，放入洗衣粉水中泡1小时后用清水洗净，取出。
用少量乙醇擦干净，备用。
取包埋好的蜡块切开，分别固定在木块上，上机固定。
材料切片厚度为12～18微米之间，当切片达到满意时，切片即成为组织完整，方向正确的一条蜡带。
将切好的蜡片用毛笔轻轻移到一个垫有黑色纸的容器里，待进一步粘贴步骤。
2.1.8蜡片的粘贴与烤片
目的是将切好的蜡片粘贴在载玻片上，并进行烘烤。
将切好的蜡片放入盛有温水的烧杯中，水温保持在30～40摄氏度。
放时让蜡片的光面与水面接触，此时可见蜡片迅速展开，载玻片插入水中，对准蜡片底面，使其粘在片上，捞出，调整好位置，控掉水份，放在烘片盒中，在30～40摄氏度的烘箱中，烘烤一定时间（视情况而定），即可。
2.1.9甘松药材的脱蜡与染色
目的是将甘松材料中的石蜡全部溶掉，以便染色。
取出烘好的带有材料的载玻片，放在染色架上，浸泡在纯二甲苯中进行两次脱蜡，每次约5～10分钟。
这时材料内外的石蜡已全部脱干净，然后进行染色。
将脱好蜡的片子放入1:
1二甲苯与无水乙醇的混合溶液（Ⅰ）中，3～5分钟后提出，略微控干；再放入另一个1:
1二甲苯与无水乙醇的混合溶液（Ⅱ）中，3～5分钟后提出，略微控干；然后依次放入100％、95％、85％乙醇溶液中，其中100％无水乙醇中浸两次（Ⅰ）、（Ⅱ），分别浸3～5分钟后提出，略微控干；再放入番红溶液中进行染色。
染色时放入“快速处理仪”中可缩短时间，需要20分钟，染色后提出，用布轻轻擦拭底部，吸掉多余的番红染色液。
染色后依次放入无水乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ），1:
1二甲苯与无水乙醇的混合溶液（Ⅰ）、（Ⅱ），纯二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ），以上几步浸、提要迅速，否则颜色会被洗去。
等待封片。
染色步骤：
二甲苯（Ⅰ）10分钟二甲苯（Ⅱ）5分钟二甲苯与无水乙醇（1:
1）（Ⅰ）3－5分钟二甲苯与无水乙醇（1:
1）（Ⅱ）3－5分钟无水乙醇（Ⅰ）3－5分钟无水乙醇（Ⅱ）3－5分钟95％乙醇3－5分钟85％乙醇3－5分钟番红染色20分钟无水乙醇（Ⅰ）短浸无水乙醇（Ⅱ）短浸二甲苯与无水乙醇（1:
1）（Ⅰ）短浸二甲苯与无水乙醇（1:
1）（Ⅱ）短浸二甲苯（Ⅰ）短浸二甲苯（Ⅱ）短浸封片。
2.1.10甘松药材的封藏
目的是为了使切片永久保存，长期使用。
常用封藏剂为加拿大树胶或光学树脂胶用二甲苯配成溶液后使用。
从二甲苯中取出切片，滴少量95％乙醇，擦去组织周围的二甲苯和杂质（脏物），加少量封藏剂（不宜过多），放上盖玻片。
2.1.11贴标签
标签上应写明材料种类，名称（甘松），横切或纵切，制片时间（05.04.20）。
2.1.12装片备用
封藏好的片子放在烘箱中烘干，温度控制在30～40摄氏度，或者自然凉干即可。
永久制片制作完成。
2.2不同产地甘松根的横切面观察
2.2.1样品（表4）
编号
切片名称及部位来源
1
2
3
4
5
甘松香根部安国购，四川产（图10）
甘松香根部云南购，四川产（图11）
甘松香根部四川阿坝产购（图12）
甘松香根部四川产购（地区不明）（图13）
甘松香根部甘肃产购（图14）
2.2.2切片结果
图10：
安购川产根横切面
图11：
云购川产根横切面
图12：
阿坝产购跟横切面
图13：
四川产购根横切面
图14：
甘肃产购根横切面
2.3不同产地甘松根茎的横切面观察
2.3.1样品（表5）
编号
切片名称及部位来源
1
2
3
4
5
甘松香根茎部安国购，四川产（图15）
甘松香根茎部云南购，四川产（图16）
甘松香根茎部四川阿坝产购（图17）
甘松香根茎部四川产购（地区不明）（图18）
甘松香根茎部甘肃产购（图19）
2.3.2切片结果
图15：
安购川产根茎横切面
图16：
云购川产根茎横切面
图17：
阿坝产购根茎横切面
图18：
四川产购根茎横切面
图19：
甘肃产购根茎横切面
2.4结果分析
2.4.1甘松根部横切面[44][45]
外层木栓组织3～4列，细胞多边形，成环状排列，薄壁栓化；韧皮部较宽，多裂隙，筛管群分散其中；木质部由薄壁细胞和导管组成，中柱维管束系统被几个木栓组织环分割为2～6束，每束由2～3列细胞组成的同心木栓组织环包围着部分韧皮部和木质部，部分木质部穿过木栓组织环生长。
根较老的部分，由于束间组织死亡裂开而相互脱离，成为单独的束，使根成为数个分支。
区别见表6。
编号
切片名称、部位及来源
特征
1
2
3
4
5
安购川产甘松根部
云购川产甘松根部
阿坝产购甘松根部
四川产购甘松根部
甘肃产购甘松根部
束间组织分化未裂开，部分木质部穿过木栓环生长，中央有髓
束间组织分化，部分断裂，中央有髓
束间组织分化，完全裂开脱离，成为2束
束间组织分化，部分断裂，部分木质部穿过木栓环生长
束间组织分化，完全裂开脱离，成为2束，部分木质部穿过木栓环生长
2.4.2甘松根茎横切面[44][45]
外层木栓组织3～4列成环状排列；维管束成不连续的环状排列。
较老的根茎维管系统也发生数个木栓组织环，每个环内有1至数个维管束；髓部中心有石细胞群，外层围以木栓组织环。
区别见表7。
编号
切片名称、部位及来源
特征
1
2
3
4
5
安购川产甘松根茎
云购川产甘松根茎
阿坝产购甘松根茎
四川产购甘松根茎
甘肃产购甘松根茎
束间组织分成2～3束，部分木质部穿过木栓环生长，中央有髓
束间组织分成2～3束，部分木质部穿过木栓环生长，中央有髓
未出现束间，中央髓部外层无木栓组织环
未出现束间，中央有髓
束间组织分成2～3束，部分木质部穿过木栓环生长，中央有髓
2.5甘松药材粉末显微镜观察
粉末为红棕色。
石细胞壁厚，显著延长或类四边形的胞壁，腔小，少有分支，并可见扁圆形壁孔。
木栓细胞多为不规则多角形，细胞壁较薄呈暗棕色，内含黄棕色或黄色挥发油滴。
导管梯形或网纹，网纹导管较多，多束生、碎断。
基生叶残基碎片长条形或长方形，淡黄棕色，壁呈念珠状增厚，有时可见波状扭曲纹理。
木纤维细小长条形，两端平截，壁薄，常附着于导管旁侧（图20）。
基生叶残基碎片
木纤维
导管
石细胞
木栓细胞
图20
2.6与文献比较
与文献资料[44][45]所述的甘松根及根茎横切面进行比较，根横切面外周未见到数个同心性木栓组织环，束间组织出现部分木质部穿过木栓环生长的现象，且中央有髓的出现；根茎横切面束间组织出现部分木质部穿过木栓环生长的现象，有一个品种中央髓部外层无木栓组织环，束间有少数根迹维管束。
根及根茎横切面差异总结见表8、9。
不同产地的甘松粉末观察没有显著区别，安购川产和甘肃产购的甘松挥发油油滴明显较多，由此提示我们这两个品种的质量较好。
表8
比较项目
名称、
部位及来源
束间组织断裂
木质部穿过木栓环生长
髓部
其他
安购川产甘松根部
－
＋
＋
云购川产甘松根部
＋
－
＋
阿坝产购甘松根部
＋＋
－
－
四川产购甘松根部
＋
＋
－
甘肃产购甘松根部
＋＋
＋
－
*束间组织断裂情况：
+束间组织分化部分断裂；++束间组织分化，完全裂开脱离；-束间组织分化未裂开
表9
比较项目
名称、
部位及来源
束间
组织
木质部穿过木栓环生长
髓部
髓部外层木栓组织环
其他
安购川产甘松根茎
＋
＋
＋
＋
根迹维管束
云购川产甘松根茎
＋
＋
＋
＋
根迹维管束
阿坝产购甘松根茎
－
－
＋
－
根迹维管束
四川产购甘松根茎
－
－
＋
＋
根迹维管束
甘肃产购甘松根茎
＋
＋
＋
＋
根迹维管束
3实验心得
在制作永久切片的过程中遇到一些现象和问题，经过思考、总结得出了一些在永久切片制作过程中应当引起大家注意的问题。
在抽气过程中发现，加入的水量不易过多，否则会增加抽气的时间；在脱水过程中根据同期其他组同学的实验结果、现象来看，浸泡时间要根据药材的质地来做适当的调整，没有最佳时间；在透明过程中如果药材质地坚硬或厚度较大，应适当增加其在25％二甲苯－75％二甲苯中浸泡的时间；在浸蜡过程中石蜡浸在二甲苯中，不直接接触材料，因此起到了逐渐浸蜡的作用，在放回“快速处理仪”浸渗室的时候，温度应从30摄氏度逐渐升高到比石蜡熔点高1～2摄氏度的温度，使蜡逐渐熔化；渗蜡后的材料倒入蒸发皿中应微微加热，防止温度过高或沸腾使浸到甘松材料中的石蜡受热冲出；在切蜡块时先将在两材料之间先切一个刀口印，然后切开，以防止蜡块切裂，切好后将蜡块凹面削平，再把蜡块修成梯形，材料周围要留有一定的石蜡，以保护材料；在放盖玻片时，注意先将盖玻片的一侧接触封藏剂，然后再慢慢放下另一侧，以免产生气泡。
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