EDTA 二钾对血细胞的影响最小.docx

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EDTA二钾对血细胞的影响最小

EDTA二钾对血细胞的影响最小。

抗凝血在室温下放置4～6h不影响红细胞体积，是血液细胞分析仪最适合的抗凝剂。

操作时将150g／L的EDTA二钾水溶液10μl加入试管内（不必烘干，便于混匀），抽血1．0ml混匀即可。

血液学标本的前处理

（一）毛细血管采血

【器材】

一次性无菌三棱针、消毒干棉球、75％乙醇棉球、20μl一次性微量吸管。

【操作】

（1）成年人的采血部位以左手无名指为宜，婴幼儿于拇指或足跟两侧采血。

（2）轻轻按摩采血部位使其充血，用75％乙醇棉球消毒局部皮肤。

（3）紧捏采血部位，用无菌三棱针穿刺皮肤，动作须迅速，刺入深度以2～3mm为宜。

（4）擦去第1滴血，按需要依次用20μl微量吸管采血，标本先测血小板，再依次测红细胞、血红蛋白、白细胞、血型等。

（5）采血完毕后用干棉球按压伤口止血。

（二）静脉采血

【器材】

一次性注射器、3％碘酊棉球、75％乙醇棉球、止血带、抗凝管（瓶）。

【操作】

（1）根据检验目的核对患者姓名、联号、准备的器材。

（2）让患者坐位或卧位伸出手臂，握紧拳头，用止血带扎紧上臂使静脉怒张。

（3）用3％碘酊消毒皮肤。

（4）取出一次性注射器，并检查针头连接处是否漏气或松动。

（5）根据血管分布情况，将注射器针头与手臂约成30°角顺利进针至血管内抽血。

（6）抽取检测项目所需血量后松开止血带，用干棉球按住进针口并拔出针头。

（7）抗凝剂与血液严格按要求配比。

血液加入试管内应立即摇匀以免凝固。

（8）如果进针或抽血过程不顺利，应换另外静脉重抽，以免血小板聚集或出现微小凝块。

三、标本的运输和保存

（1）在室温下EDTA二钾抗凝的静脉血中白细胞、红细胞、血小板可稳定24h，白细胞分类结果可稳定6～8h，血红蛋白可稳定数天，但白细胞形态在2h后可发生变化，需要借助显微镜分类的标本要及时推片固定。

标本在4℃冰箱内贮存的时间可适当延长，但低温对血小板计数和血小板体积两项检测结果影响较大。

（2）使用半自动血细胞分析仪时，由于大多采用末梢法采血，标本往往直接稀释，血细胞在高稀释状态下会自溶破坏而影响检测结果，因此标本不宜保留过久，一般要求在1h内测定完毕。

（3）测定血沉、血细胞比容应在2h内完成。

夏天气温较高，标本在运输和保存时应加盖盖住，以免标本浓缩。

一、血液细胞分析仪的检测原理

（一）白细胞检测原理

1．白细胞计数原理

（1）电阻抗法：

血细胞是一种不良导体，将血标本稀释、溶血后制成白细胞悬液后，在负压的作用下，悬液流经一个带有微孔的恒压电路时，每个细胞会产生一个电阻脉冲信号，这些信号经过微机的放大、甄别、整形等处理，最后根据这些信号计算出单位体积内的白细胞数。

（2）光学法：

血标本在稀释液和溶血剂的作用下制成一定浓度的白细胞悬液，根据流体力学的鞘流技术原理，使得白细胞一一流经仪器检测器，每个细胞在通过检测器时都会受到一束固定波长的激光照射，微机根据光的折射、反射、前向角等信号来识别和计数细胞。

【注意事项】

（1）电阻抗法计数的是“颗粒”的数量，“颗粒”毋须有完整的细胞结构，这使某些易溶淋巴细胞（脆性淋巴细胞）不易漏检。

其缺点是：

①容易受到有核红细胞、抗溶血红细胞、血小板团块及其他颗粒性物质的干扰。

②由于细胞仪的微孔管无法使细胞逐个通过（一般白细胞测试孔径为100μm，红细胞／血小板测试孔径为80μm），细胞悬液通过测试孔时往往会出现细胞“重叠”现象而使检测结果偏低，特别是标本中细胞数超出一定线性范围时。

为了排除重叠损失，仪器设有一个补偿系统，可通过下列公式进行计算以自动校正：

n″＝p（n′／1000）2　　补偿后细胞数＝n′＋n″　　p＝2．5（d／100）2500／V式中n″为重叠损失数；n′为未加补偿时计数值；p为补偿系数；d为小孔直径；V为计数体积。

（2）光学法细胞计数的优点是可以有效排除有核红细胞、抗溶血红细胞、血小板团块、其他颗粒性物质的干扰，其缺点是对易溶淋巴细胞（脆性淋巴细胞）容易漏检。

一些五分类血细胞分析仪同时用两种方法进行计数，当两种方法的结果不符时仪器会提示并根据干扰因素的大小报告一个较为准确的结果。

2．白细胞分类原理

白细胞分类是血细胞分析仪的重要技术指标，各个公司研制的不同型号的血细胞分析仪对细胞进行分类的技术原理也不一样。

（1）两分群、三分群血细胞分析仪原理：

通常两分群、三分群血细胞分析仪均采用单一的电阻法，即在溶血素的作用下，白细胞发生皱缩，仪器根据白细胞颗粒产生的电阻脉冲信号的数量计算出单位容积内白细胞总数；再根据脉冲信号的强弱计算出细胞体积。

在体积分析过程中，微机将皱缩的白细胞在35～45Ofl范围内分成256个通道，每个通道1．64fl。

根据通过不同通道细胞的数量，仪器可以得到以体积为横坐标轴、以相对数量为纵坐标轴的白细胞分布二维直方图。

从而将白细胞分为小细胞群（以淋巴细胞为主），中间类型细胞群（以单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、部分幼稚细胞为主），大细胞群（以成熟中性粒细胞为主）。

（2）五分类血细胞分析仪原理：

①体积、电导、光散射法：

血标本在特殊的稀释液和溶血剂作用下红细胞被破坏，但白细胞形态和结构仍保持自然状态。

当白细胞在鞘流技术的引导下流经检测器时，会同时受到V、C、S3种技术的检测。

V（volume）是利用电阻抗法测定细胞体积；C（conductivity）是利用高频电磁波，根据各种细胞核浆的电导性不同测量细胞内部结构、核浆比例；S（scatter）是利用光散射原理测量细胞内颗粒的大小、密度等结构特性。

计算机根据这3种技术得到的资料综合分析，将中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞一一分开，并有异常淋巴细胞、幼稚细胞、有核红细胞、抗溶血红细胞等提示信息，同时仪器能提供白细胞、红细胞、血小板的直方图及白细胞分类散点图。

②多角度消偏振激光散射法（multianglepolarizedscatterseparation，MAPSS）：

血标本在特殊鞘液的作用下，红细胞内血红蛋白可游离出细

胞外，红细胞变得透明（成为影细胞），而白细胞的内部结构和膜结构基本保持自然状态。

当细胞悬液的鞘流经过检测器时，仪器从4个不同的角度得到每个细胞的光信号。

这4个角度分别为：

0°前向角光散射（1°～3°）初步测定细胞的大小；10°狭角光散射（7°～11°）测定细胞内部结构及其复杂性指征；90°垂直光散射（70°～110°）测定细胞内部颗粒和胞浆成分；90°消偏振光散射（70°～110°）利用嗜酸性细胞内颗粒特有的消偏振特性，将嗜酸性细胞直接分离出来。

计算机综合4个角度的光信号，将白细胞分类，并提供提示信息和相关图谱。

③电阻抗与射频技术分类法（radiofrequence，RF）：

这类血细胞分析仪通过4个不同的检测系统来完成白细胞的分类：

嗜酸性细胞、嗜碱性细胞利用其特有的抗酸和抗碱能力，在各自特殊试剂的作用后，进入独立通道直接计数；在直流电和交流电的同时作用下，仪器根据细胞大小以及细胞内部的核结构、核浆比例、胞浆颗粒等信息对中性、淋巴、单核细胞加以区分；幼稚细胞由于其膜上脂质成分比成熟细胞少，在硫化氨基酸的保护下具有一定的抗溶血能力，在独立的通道内可以直接计数。

④光散射与细胞过氧化物酶染色法（peroxidasestain，POX）：

血标本进入仪器，在一系列的预处理液和白细胞过氧化物酶染色后流经检测器。

每个细胞在激光束的照射下，各类细胞因过氧化物酶含量不同，具有不同的光吸收信号；根据每个细胞的前向角大小可以得到细胞的体积数据，同时仪器有单独的嗜碱性细胞直接计数通道，计算机根据这些信息得出细胞分类结果。

（二）红细胞检测原理

1．红细胞（RBC）计数、红细胞体积（MCV）、血细胞比容（HCT）、红细胞分布宽度（RDW）检测一般采用电阻抗法。

原理同白细胞计数。

2．血红蛋白浓度（HGB）测定

大多数的血细胞分析仪均采用溶血比色法。

血标本在溶血素的作用下，红细胞破坏，溶血素与血红蛋白结合成稳定的氰化高铁血红蛋白（或HGB－季胺盐衍生物）。

溶血液在流经比色池时仪器根据吸光度计算出HGB的含量。

3．红细胞平均血红蛋白含量（MCH）、红细胞平均血红蛋白浓度（MCHC）检测根据RBC、HCT、HGB计算而得。

【注意事项】

（1）用仪器测定的血细胞比容是每个细胞信号的累加，与手工测定的结果有差异，前者略低。

（2）不同类型的血细胞分析仪使用的溶血剂成分略有不同，但主要成分是季胺盐。

（3）对不同的仪器，红细胞分布宽度有两种表示方法———s或CV％。

（三）血小板检测原理

血小板测定与红细胞计数原理一致，仪器将直径2～30fl的颗粒统计为血小板，大于36fl的颗粒统计为红细胞。

（四）网织红细胞检测原理

网织红细胞内残留的RNA与特殊的染料结合后在通过激光检测器时仪器根据细胞的反射光信号（或发射光信号）将其与成熟红细胞和其他细胞区别并计数。

根据染料性质的不同可分为反射光测定法和发射光测定法。

（1）反射光测定法：

网织红细胞经亚甲蓝染色后，胞浆内的RNA与染料结合形成蓝色颗粒。

这些颗粒在激光的照射下会产生特殊的反射光，而成熟红细胞则没有这一特性。

仪器根据反射光信号可以计数网织红细胞的百分比（Ret％）、绝对值（Ret＃）、网织红细胞成熟指数（RMI）等相关指标。

（2）发射光测定法：

网织红细胞内的RNA与吖啶橙、碱性槐黄等荧光染料结合后在一定波长的激光照射下会发出固定波长的荧光。

仪器根据发光细胞的数量和光强度信号以及红细胞测定的相关参数可以得到网织红细胞绝对值、高荧光强度网织红细胞（HFR）百分比、中荧光强度网织红细胞（MFR）百分比、低荧光强度网织红细胞

（LFR）百分比、网织红细胞平均体积（MCVr）、网织红细胞分布宽度（RDWr）、网织血红蛋白分布宽度（HDWr）、网织血红蛋白浓度（HCr）、网织红细胞平均血红蛋白浓度（MCHCr）等参数。

【注意事项】

散射光测定法测定网织红细胞易受增多的白细胞和血小板、嗜碱性点彩红细胞、脂浊、疟原虫等影响，发射光测定法则不易受增多的白细胞和血小板、溶血、凝血、脂浊的影响，但易被疟原虫和豪－乔小体干扰。

第二节　ABO血型系统鉴定

ABO血型是最早发现的一个血型系统，在输血工作中极其重要。

这是因为，一个人的红细胞上若缺乏A抗原或B抗原，其血清中则有抗A抗体或抗B抗体，因此，如果在输血中忽视了ABO血型鉴定，就会发生血型不合的输血而导致溶血性输血反应。

一、ABO血型鉴定

常规的AB0血型鉴定，应包括用已知的特异性抗体试剂检查红细胞的抗原（正向定型）和用已知的试剂红细胞检查血清中的抗体（反向定型）。

常用的方法有试管法、搪瓷板法。

近年又有凝胶微柱法。

本节介绍前两种方法，后者可参考市售配套试剂和器材说明书进行操作。

（一）试管法

【原理】

用标准抗A抗体、抗B抗体及抗A、B抗体分型血清测定红细胞上有无A抗原或（和）B抗原（正定型），或用已知A型、B型及O型红细胞测定血清中有无相应的抗A抗体或（和）抗B抗体（反定型）来鉴定ABO血型。

【试剂】

（1）抗A抗体、抗B抗体（效价均不低于1：

128）及抗A、B抗体（O型）分型血清。

（2）已知A型、B型及O型红细胞悬液。

（3）受检者血清。

（4）受检者2％红细胞悬液。

【操作】

（1）取洁净小试管3支，分别标明抗A抗体、抗B抗体和抗A、B抗体，用滴管分别加入相应的分型血清，再分别加入受检者2％红细胞悬液1滴，混匀（正定型）。

（2）另取洁净小试管3支，分别标明A、B和O，用滴管分别加受检者血清各1～2滴于试管底部，再分别以滴管加入2％已知A型、B型和O型红细胞悬液1滴，混匀（反定型）。

（3）立即以1000r／min离心1min，轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，肉眼及显微镜观察有无凝集或溶血现象。

【结果判断】

受检者红细胞加分型血清及受检者血清加试剂红细胞后根据表2－2－1判断受检者血型。

【注意事项】

（1）分型血清的质量必须符合要求，市售的应有批准文号；用后应立即放人冰箱保存以免其效价下降及细菌污染。

（2）试管、滴管必须清洁干燥，防止标本溶血。

（3）离心时间过长或速度过快，易出现假阳性结果，反之易出现假阴性结果。

（4）如室温过低，应提高室温至20℃左右，或将试管放入37℃水浴保温，但是37℃环境可使反应减弱。

（5）判定结果后，应立即记录并仔细核对，以防笔误。

（6）操作时一般应先加血清，后加红细胞悬液，便于核对是否漏加血清。

（7）正反定型不一致时，需进一步鉴定，以确定不一致的原因。

（二）搪瓷板法

【原理】

同试管法。

【试剂】

抗A抗体、抗B抗体及抗A、B抗体分型血清。

【操作】

（1）在搪瓷板方格内滴加抗A抗体、抗B抗体及抗A、B抗体分型血清各1滴，在分型血清旁滴加相当于分型血清1／10体积的受检者全血。

（2）用玻棒充分混匀分型血清和受检血标本，在室温（18～22℃）中停留1min后，轻轻摇动瓷板，观察凝集结果。

【结果判断】

同试管法。

【注意事项】

夏季气温较高时，水分蒸发快，为防止血滴蒸发干燥，要及时观察结果，或在血滴上加1滴9g／L氯化钠溶液，以防检测出现假阳性结果。

二、A1和A2亚型鉴定

【原理】

A型和AB型一般可分为A1、A2、A1B和A2B4种亚型。

B型人血清中含有抗A抗体、抗A1抗体两种抗体，抗A抗体可凝集A1型、A2型、A1B型和A2B型红细胞，而抗A1抗体只能凝集A1型和A1B型红细胞。

【试剂】

抗A1抗体分型试剂（人源或植物种子血凝素）、受检者2％红细胞悬液、已知A1和A2型2％红细胞悬液。

【操作】

（1）取洁净玻片2张，1张供测定受检红细胞用，另1张标明A1型和A2型，供对照用。

（2）将抗A1抗体分型血清各1滴，分别滴在受检者玻片上、对照的A1型和A2型玻片上。

（3）分别将受检者红细胞悬液及已知A1型和A2型红细胞悬液1滴，滴在上述抗A1抗体分型试剂上，用玻棒将分型试剂和红细胞悬液混匀。

（4）轻轻转动玻片，在室温中放置10min，观察结果。

【结果判断】

如已知的A1型红细胞凝集，已知的A2型红细胞不凝集，而受检者红细胞凝集是A1型，不凝集是A2型。

【注意事项】

（1）新生儿红细胞ABO血型抗原较弱，不宜作亚型检定。

（2）检查时必须按说明书掌握反应时间。

（3）如A1型和A2型已知红细胞均与抗A1型抗体分型试剂凝集，说明抗A1型抗体分型试剂有问题；若A1型和A2型已知红细胞均不凝集，应再观察一些时间，若始终不凝集，也说明抗A1型抗体分型试剂有问题。