临床生化常用地色原及检测波长.docx

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临床生化常用地色原及检测波长

临床生化常用的色原及检测波长

Toos545nm

苯酚（对氯苯酚）505nm

NAD（P）H指示系统，波长340nm，项目：

ALT、AST、GLUC己糖激酶法、CK、UREA、LDH等。

苯衍生物类，波长400-410nm，如ALP、GGT、CHE等。

过氧化物酶指示系统，项目：

TG、TCH、HDL-C、LDL-C、UA等。

可见光波长及其互补色：

可见光波长及其相应被吸收的颜色依次为：

红色（630～700nm）、橙色（600～630nm）、黄色（570～600nm）、绿色（500～570nm）、蓝色（435～500nm）、紫色（400～435nm）。

★540nm：

1.双缩脲测蛋白：

所有蛋白质分子都含有肽键。

在碱性溶液中，肽键与铜离子结合，生成蓝紫色化合物，在540nm处吸光度与肽键的数量呈正比关系，可以计算蛋白质含量。

2.染料结合法测脑脊液蛋白：

在柠檬酸存在的酸性条件下，伊红Y燃料离解成阴离子型，染料的黄色消退，使试剂空白吸光度降低；另外，蛋白质多肽链中的精氨酸、组氨酸、赖氨酸和色氨酸残基，离解生成带－NH3+基团，与染料阴离子的羧基和酚基借静电吸引而结合成红色蛋白燃料复合物，其540nm处吸光度大小与蛋白质浓度呈比例。

★628nm：

1.溴甲酚绿法测血清白蛋白：

在PH4.2的缓冲液中，白蛋白分子带正电荷，与带负电荷的溴甲酚绿（BCG）生成蓝绿色复合物，在波长628nm处有吸收峰。

复合物的吸光度与白蛋白浓度成正比。

★603nm：

1.溴甲酚紫法（BCP）测血清白蛋白：

BCP溶于PH5.2的醋酸缓冲液中，呈黄色。

当它与白蛋白结合后转变为绿色的符合物，在波长603出有最大吸收峰。

★650nm：

1.磷钨酸法测黏蛋白：

以0.6mol/L过氯酸沉淀血清中蛋白质时，黏蛋白不被沉淀，仍存留在滤液中，再加磷钨酸使黏蛋白沉淀，然后以酚试剂测定沉淀物中蛋白质的含量。

2.米吐尔直接显色法测血清无机磷：

利用无机磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成磷钼酸铵复合物，用还原剂对甲氨基酚硫酸盐（米吐尔）还原生成钼蓝。

在试剂中加入吐温－80以抑制蛋白质的干扰。

★604nm：

1.邻苯三酚红钼络合显色法测脑脊液总蛋白：

邻苯三酚红与钼酸络合形成红色复合物（吸收峰475nm）。

该复合物在酸性条件下与蛋白质形成复合体，其吸收峰移至604nm。

用比色法求蛋白质含量。

★530nm：

1.比浊法测脑脊液蛋白：

脑脊液中蛋白质与磺基水杨酸－硫酸钠试剂作用产生沉淀，所形成的浊度在530nm处进行吸光度测定，与同样处理的标准液比较测得蛋白含量。

★415nm：

1.亲和层析法测HbA1c：

用于分离糖化与非糖化Hb的亲和层析凝胶柱，是交联间－氨基苯硼酸的琼脂糖珠。

硼酸与结合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基反应，形成可逆的五环化合物，致使样品中的糖化Hb选择性地结合在柱上，而非糖化Hb则被洗脱。

然后用山梨醇解离五环化合物以洗脱糖化Hb，在415nm分别测定解析液的吸光度，计算糖化Hb的百分率。

★550nm：

1.糖化血清蛋白测定：

血清葡萄糖能与白蛋白及其他血清蛋白分子N末端的氨基发生非酶促糖化反应，形成高分子酮胺结构。

此酮胺结构能在碱性环境中与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，生成甲？

，以1－脱氧－1－吗啉果糖（DMF）为标准参照物，在550nm处进行比色。

★340nm：

1.血清前白蛋白测定：

血清中的PA与抗PA抗体在液相中反应生成抗原抗体复合物，使反应液呈现浊度。

当一定量抗体存在时，浊度与血清中PA的含量呈正比，利用340nm处的散射比浊或投射比浊技术，与同样处理的PA标准比较，求得样品种PA含量。

2.尿微量白蛋白测定：

尿液中的白蛋白与抗人白蛋白特异性抗体在缓冲液中反应生成抗原－抗体复合物，产生浊度，与尿中白蛋白浓度呈正比，利用透射比浊法测定340nm处吸光度，与同样处理的标准品制备的标准曲线比较，求得尿液中的白蛋白浓度。

3.己糖激酶法测血清葡萄糖：

在己糖激酶（HK）催化下，Glu和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖－6－磷酸（G-6-P）与ADP。

前者在葡萄糖－6－磷酸脱氢酶（G－6－PD）催化下脱氢，生成6－磷酸葡萄糖醛酸（6－PG），同时使NADP还原成NADPH。

反应式如下：

葡萄糖+ATP—HK—>G6P+ADP

G6P+NADP—G6PD—>6PG+NADPH+H+

NADPH的生成速率与葡萄糖浓度呈正比。

NADPH在波长340nm有吸收峰，检测吸光度升高速率，计算血清葡萄糖浓度。

4.葡萄糖脱氢酶法测血清葡萄糖：

葡萄糖脱氢酶（GDH）催化葡萄糖脱氢，氧化生成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸－&－内酯）。

B－D－葡萄糖+NAD+—GDH—>D－葡萄糖酸内酯+NADH

向反应液中加入变旋酶可缩短反应达平衡时间，反应过程中NADH生成量与葡萄糖浓度成正比关系。

5.血浆乳酸测定：

在NAD存在下，乳酸脱氢酶催化乳酸氧化成丙酮酸，同时生成NADH：

L－乳酸+NAD+—LDH—>丙酮酸+NADH+H+

在PH9.8时，平衡偏向乳酸氧化成丙酮酸。

加入肼或氨基脲与丙酮酸生成复合物，使丙酮酸不断从反应体系中移去，进一步促进反应向右移动，从而驱动反应的完成。

分光光度计波长340nm，监测吸光度的升高速率，计算乳酸含量。

6.全血乳酸测定：

在NAD+存在下，LDH催化乳酸，氧化成丙酮酸。

加入硫酸肼捕获产物丙酮酸，并促进反应完成。

反应完成后生成的NADH与乳酸为等摩尔关系，在340nm下测定NADH的生成量，计算乳酸的含量。

7.血浆丙酮酸测定：

乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原成乳酸，反应如下。

丙酮酸+NADH+H+—LDH—>L－乳酸+NAD+

分光光度计波长340nm，监测NADH吸光度下降速率，计算样品中丙酮酸浓度。

本法适用于各种任选式自动分析仪。

8.全血丙酮酸测定：

原理同血浆丙酮酸测定，PH7.5条件下利于上述反应（生成乳酸方向）

9.血清（B－羟丁酸）B－HB测定：

在有NAD存在时，B－羟丁酸在B－羟丁酸脱氢酶（B－HBDH）催化下，生成乙酰乙酸（AcAc）和NADH。

在波长340nm处，监测反应中吸光度的上升速率，可以计算血清中B－羟丁酸的浓度。

B－HB+NAD—B-HBDH—>AcAc+NADH+H+

10.钾的酶法测定：

磷酸烯醇丙酮酸（PEP）与二磷酸腺苷（ADP）在钾依赖性丙酮酸激酶（PK）催化下，生成丙酮酸和三磷酸腺苷（ATP）。

再在乳酸脱氢酶催化下，所生成的丙酮酸和NADH反应，生成乳酸和NAD。

反应中NADH的消耗量与样品种钾离子浓度呈正比。

因此，在340nm处监测吸光度下降速率，可以计算钾离子含量。

反应式如下：

PEP+ADP—K+,PK—>丙酮酸+ATP

丙酮酸+NADH+H+—LDH—>乳酸+NAD+

11.酶法测定血浆（血清）碳酸氢根及总二氧化碳：

血浆（清）中的碳酸氢根在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）催化下和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）反应，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸在苹果酸脱氢酶（MDH）催化下，生成苹果酸，同时NADH被氧化成NAD+。

在分光光度计340nm处，吸光度下降速率与样品中HCO3-含量成正比。

反应式如下。

磷酸烯醇式丙酮酸+HCO3-—PEPC—>草酰乙酸+磷酸

草酰乙酸+NADH+H+—MDH—>苹果酸+NAD+

12.紫外分光光度法测血清无机磷：

血清中无机磷在酸性溶液中与钼酸铵反应生成的磷钼酸铵复合物，直接在340nm或325nm波长处测定吸光度。

13.速率法测定血清ALT：

在ALT速率法测定中，酶偶联反应式为：

L-丙氨酸+a-酮戊二酸—ALT—>丙酮酸+L-谷氨酸

丙酮酸+NADH+H+—LDH—>L-乳酸+NAD+

上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶活性成正比，可在340nm波长处检测吸光度下降速率（-△A/min），计算出ALT的活力单位。

★600nm：

1.染料结合法测尿微量白蛋白：

将尿标本实现用SephadexG-50凝胶过滤，除去尿中色素及其他干扰成分。

将流出物加BPB染料，使之与白蛋白结合显色，经与同样显色的白蛋白标准液比较，可求得尿中白蛋白含量。

2.甲基麝香草酚兰比色法测血清镁：

血清中镁、钙离子在碱性溶液中能与甲基麝香草酚兰染料结合，生成蓝紫色的复合物，加入EGTA（乙二醇双-N,N,N,N-四乙酸，简称EGTA）可掩盖钙离子的干扰。

★505nm：

1.葡萄糖氧化酶法测血清葡萄糖：

葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸&内酯），并产生过氧化氢：

Glu+2H2O+O2—GOD—>葡萄糖酸+2H2O2

在色原性氧受体（如联大茴香胺、4－氨基安替比林偶氮酚）的存在下，过氧化物酶催化过氧化氢，氧化色原物质，生成有色化合物。

于505nm处比色即可测的葡萄糖浓度。

★405nm：

1.钠的酶法测定：

邻硝基酚-B-D-半乳糖苷（ONPG）在钠依赖性B-半乳糖苷酶催化下生成邻－硝基酚和半乳糖。

邻－硝基酚的生成量和样品中钠离子浓度呈正比。

邻－硝基酚在碱性环境中呈黄色，可在405nm波长处监测吸光度的升高速度，计算钠的浓度。

★460nm：

1.硫氰酸汞比色法测血清氯化物：

标本中的氯离子与硫氰酸汞反应，生成极难解离的氯化汞，并释放出相应当量的硫氰酸离子。

后者与试剂中铁离子结合生成色泽很深的橙红色硫氰酸铁，吸收峰在460nm，色泽强度与氯化物的含量成正比。

Hg（SCN）22Cl-——>HgCl2+2SCN-

3CN-+Fe3+——>Fe（SCN）3（橙红色）

★610nm

甲基麝香草酚兰比色法测血清总钙：

血清中钙离子在碱性溶液中与甲基麝香草酚兰结合，声称蓝色的络合物。

加入适量的8-羟基喹啉，可消除镁离子对测定的干扰，与同样处理的钙标准液进行比较，以求得血清总钙的含量。

★575nm

邻－甲酚酞络合酮比色法测血清总钙：

邻－甲酚络合酮是金属络合指示剂，同时也是酸碱指示剂，在碱性溶液中与钙及镁螯合，声称紫红色螯合物。

作钙测定时，在试剂中加入8-羟基喹啉以消除标本中镁离子的干扰。

★640nm

硫酸亚铁磷钼蓝比色法：

用三氯醋酸沉淀蛋白，向无蛋白滤液中加入钼酸铵试剂，与无机磷结合生成磷钼酸铵，在以硫酸亚铁为还原剂，还原成蓝色化合物（钼蓝），进行比色测定。

★510nm

Calmagite染料比色法测定血清镁：

血清中镁在碱性条件下与Calmagite染料生成紫红色络合物，颜色的深浅与镁的浓度成正比。

溶液中的EGTA可消除钙的干扰，使用表面活性剂可使蛋白胶体稳定，不必去除血清中蛋白质而直接测定镁。

★562nm

血清铁和总铁结合力测定：

与转铁蛋白结合的血清铁在酸性介质中从转铁蛋白中解离出来，再被还原剂还原成二价铁，后者与亚铁嗪生成紫红色化合物，在562nm处有吸收峰，可作比色测定。

直接测定法应纠正血清本身的色度，故应设血清空白。

总铁结合力（TIBC）是指血清中转铁蛋白能与铁结合的总量。

将过量铁标准液加到血清中，使之与未带铁的转铁蛋白结合，多余的铁被轻质碳酸镁粉末吸附除去，然后测定血清中总铁含量，即为总铁结合力。

★620nm

比色法测血清铜：

用稀盐酸使与白蛋白结合的铜释放，用三氯醋酸沉淀蛋白，滤液中的铜离子与双环己酮草酰二腙反应，生成稳定的蓝色化合物。

★555nm

吡啶偶氮酚显色法测血清锌：

高价铁，铜被维生素C还原成低价，和其他金属离子一起被氰化物络合而掩蔽。

水合氯醛使锌离子暴露而能与2[（5-溴-2，2吡啶）偶氮]-5-二乙基氨基苯酚（Br-PADAP）反应产生颜色，其吸收峰在555nm。

控制PH以消除钙镁离子等金属离子的干扰。