蛋白复习总结.docx
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蛋白复习总结
1、蛋白质测序策略:
Ø确定蛋白质的纯度在97%以上;
Ø测定多肽链的数目;
Ø拆分多肽链;
Ø分析每一条多肽链的氨基酸组成;
Ø鉴定多肽链的N-末端和C-末端氨基酸残基;
Ø用两种以上方法把多肽链裂解成较小的肽段;
Ø测定各肽段的氨基酸序列;
Ø把各肽段拼接成完整的多肽链;
Ø确定二硫键的位置。
2、蛋白质组学的研究特点:
同一性和多样性、有限和无限、静态和动态、时间和空间孤立行为和相互作用、单一手段和多种技术、互补和互助
3、蛋白质组学研究任务
内容:
了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类、明确各种蛋白质分子是如何让形成类似于电路的网络的、描绘蛋白质的精确三维结构,揭示其结构上的关键部分,如和药物结合并且决定其活性的部位
当前任务:
发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台
研究目的:
分离蛋白,显示差异,将表现型和功能联系起来;
寻找蛋白质之间的相互作用,动态地反映生物体所处的状态。
4、蛋白质组学研究的两种策略:
1)“竭泽法:
采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多的乃至全部的蛋白质。
2)“功能法”:
研究不同时期细胞内蛋白质组成的变化,如蛋白质在不同环境下的差异表达,以发现有差异的蛋白质种类为主要目标
5、蛋白质化学和蛋白质组学的不同
蛋白质化学蛋白质组学
单一蛋白质复杂混合物
全序列分析部分序列分析
强调结构和功能强调通过数据库匹配进行蛋白质鉴定
结构生物学系统生物学
6、氨基酸的分类及结构特点
1)非极性R基氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trp、Met共8种,这类氨基酸在水中的溶解度较小;
2)极性R基氨基酸
Ø不带电荷的极性R基氨基酸Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly
Ø带正电荷的R基氨基酸Lys、Arg、His
Ø带负电荷的R基氨基酸Asp、Glu
7、脂肪族氨基酸:
甘氨酸Glycine、丙氨酸Alanine、缬氨酸Valine、亮氨酸Leucine
异亮氨酸Ileucine
亚氨基酸:
脯氨酸Proline含硫氨基酸:
甲硫氨酸Methionine、半胱氨酸Cysteine
芳香族氨基酸:
苯丙氨酸Phenylalanine、酪氨酸Tyrosine、色氨酸Trytophan
碱性氨基酸:
精氨酸Arginine、赖氨酸Lysine、组氨酸Histidine
酸性氨基酸:
天冬氨酸Aspartate、谷氨酸Glutamate
含羟基氨基酸:
丝氨酸Serine
含酰胺氨基酸:
天冬酰胺Asnaragine、谷氨酰胺Glutamine
8、残基:
在肽链中氨基酸之间脱去一个水分子,脱水后的残余部分叫残基(residue),因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。
9、氨基酸的特性:
一般一氨基一羧基的氨基酸等电点在pH6左右,这是由于羧基的解离程度大于氨基,故pI偏酸,碱性氨基酸pI在pH10左右,酸性氨基酸的pI在pH3左右。
氨基酸水溶液中其解离度和溶液的pH有关:
向氨基酸溶液中加酸时,羧基接受质子,使氨基酸带正电,加碱时,氨基释放质子,和OH-中和,使氨基酸带负电。
当溶液的pH=pI时,氨基酸以两性离子存在
当溶液的pH<pI时,氨基酸溶液中正离子占优势
当溶液的pH>pI时,氨基酸溶液中负离子占优势。
10、氨基酸的化学性质
和亚硝酸的反应VanSlyke定氮
和甲醛的反应氨基滴
和酰化试剂的反应氨基保护基
和二甲基氨基萘磺酰氯(DNS-Cl)的反应测序
和2,4-二硝基氟苯(FDNB)的反应测序
和Edman试剂(PITC苯异硫氢酸酯)测序
α-羧基参加的反应:
1.成盐和成酯反应:
可用于羧基的保护。
2.成酰氯反应:
可用于羧基的活化。
3.脱羧基反应:
是生成胺类的重要反应。
4.叠氮反应:
可用于羧基的活化。
11、蛋白质功能的多样性
a)催化:
大多数酶是蛋白质。
b)调节:
如激素和反式作用因子。
c)转运:
如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。
d)贮存:
如种子蛋白和卵清蛋白。
e)运动:
如肌肉、微管蛋白等。
f)结构成分:
如角蛋白、胶原蛋白等。
g)支架作用:
如锚定蛋白、连接蛋白等。
h)防御和进攻:
如抗体、毒蛋白等。
i)特殊功能:
如甜蛋白、胶质蛋白等。
12、氨基酸组成的分析
a)Edman化学降解法:
用此原理已制成蛋白质序列分析仪。
若每次循环的准确度为99%,经60次循环,准确度为:
0.9960=0.54
b)降解法:
可用氨肽酶和羧肽酶,只能测出末端的几个氨基酸。
羧肽酶Y可作用于任何氨基酸,有可能以此为基础开发出新的氨基酸的顺序测定仪。
c)根据核苷酸序列推定法:
分离mRNA,经反转录测定cDNA的核苷酸序列,再用遗传密码推定氨基酸序列。
d)质谱法:
可分析微量的肽链,短肽在第一台质谱仪中经电喷射电离,按荷质比分离,依次在经碰撞池被裂解成离子碎片,在第二台质谱仪中测出各个离子碎片的谱线,推算出短肽的氨基酸序列。
在蛋白质组学中使用广泛,但不能区分亮氨酸和异亮氨酸。
13、为何要进行作图分析
1)基因组计划的基本目标是获得全基因组顺序,在此基础之上再对所获得的序列进行解读。
获取基因组顺序的主要方法是进行DNA测序,然后再将所获取的顺序进行组装以得到完整的基因组序列。
2)基因组测序的第一步是构建基因组图,然后将基因组区段分解后逐个测序,最后进行组装。
3)基因组作图的基本构想:
在长链DNA分子的不同位置寻找特征性的分子标记,根据标记将包括这些序列的克隆进行连锁定位,绘制基因组图,该图一旦构建好,即可着手进行全基因组测序。
14、以基因组作图为指导的2种测序策略:
1)直接鸟枪法:
首先进行全基因组鸟枪法测序,再以基因组图的分子标记为起点将鸟
枪法DNA片段进行组装。
高密度的基因组图分子标记可以检测组装的DNA片段是
否处在正确的位置,并校正因重复顺序的干扰产生的序列误排。
这是一种由下至上
(bottomtoup)的测序策略。
2)重叠群(contig)法:
重叠群是指相互间存在重叠顺序的一组克隆。
根据重叠顺序的相
对位置将各个克隆首尾连接,覆盖的物理长度可达~Mbp。
在单个的重叠群中,采用
鸟枪法测序,然后在重叠群内组装。
这是一种从上至下(uptodown)的测序策略。
15、遗传图的绘制
①有性杂交实验根据需要有计划地实施杂交方案而后进行连锁分析,如果蝇、老鼠以及玉米、水稻等动植物的遗传学实验。
②系谱分析不能进行有计划的遗传实验,只能收集家系成员的相关资料进行连锁分析,主要涉及人类以及多年生的树木等。
③DNA转移不发生减数分裂的生物,如细菌和病毒基因组的连锁分析。
16、为什么要绘制物理图?
遗传分析绘制的基因组图为何不能指导基因组计划的测序?
①遗传图的分辨率有限这一点对微生物不成问题,因为微生物基因组较小,记录成百上千次实验就能获得十分详尽的遗传图,其标记分布密度仅为数千个核苷酸。
而人类及大多数高等真核生物由于不可能获得大量的后代,只有少数的减数分裂事件可供研究,连锁分析的分辨力受到很大的限制。
因而难以达到基因组测序对基因组图的标记分辨率的要求。
②遗传图的精确性较低由于重组热点的存在使得染色体某一区段的交换频率高于其他区段,尤其是倒位区段,由于受到交换限制,无法绘制精确的遗传图。
由于存在以上两个局限,因而在进行大规模的DNA测序之前,对大多数的真核生物的遗传图必须进行验证并利用其他的作图技术予以校正和补充。
17、常用的物理作图技术:
①限制性作图(restrictionmapping):
将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。
②依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping):
根据欲克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群(contig),绘制物理连锁图。
③荧光标记原位杂交(fluorescentinsituhybridization,FISH):
将荧光标记的探针和染色体杂交确定分子标记的所在位置。
④顺序标签位点(sequencetaggedsite,STS):
通过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区段中。
18、脉冲场凝胶电泳
PFGE,pulsed-fieldgelelectrophoresis):
是一种分离大分子DNA的方法。
在普通凝胶电泳中,大的DNA分子(>10kb)移动速度接近,在凝胶中难以形成足以区分的条带。
在PFGE中,电场不断在两种方向上(有一定夹角,而不是相反的两个方向)变动。
DNA分子带有负电荷,会朝正极移动,相对较小的分子在电场转换后可较快转变移动方向,而较大的分子转向较为困难,因此小分子向前移动的速度比大分子快。
PFGE可用来分离从10kb~10Mb的DNA分子。
19、常用的指纹分析方法:
A限制性带型(restrictionpatterns)指纹
B重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)
CSTS目录作图(STScontentmapping)
D重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹。
20、STS作图原理
1)序列标签位点或STS(sequence-taggedsite,STS)是基因组中任何单拷贝长度在100~500bp之间的DNA序列,和限制性核酸内切酶的识别序列相关联,每个基因组中仅1份拷贝,很易分辨。
2)将染色体DNA随机打断,2个标记所处的物理位置越近,位于同一片段的机率越高
3)随机打断的染色体DNA长度不一,彼此靠近的2个标记有很大的机率位于同一片段,相距较远的标记分开的机率很高。
21、作为合格的STS必须要满足2个条件:
⑴它应是一段序列已知的片段,可据此设计PCR反应来检测不同的DNA片段中是否存在这一顺序;
⑵STS必须在染色体上有独一无二的位置,如果某个STS在基因组中多个位点出现,则由此得出的作图数据将是含混不清的。
22、寻找STS的常用方法:
⑴表达顺序标签(expressionsequencetag,EST)这是一些从cDNA克隆中找到的小段序列。
EST转变成STS的条件是:
这个EST来自单拷贝基因而非基因家族成员,后者常常含有相同或相似的序列。
⑵简单序列长度多态性(simplesequencelengthpolymorphism,SSLP)SSLP产生于重复顺序的可变排列,同一位点重复顺序的重复次数不同,表现出DNA序列的长度变化。
和RFLP不同的是,SSLP具有多等位性(multiallelic),每个SSLP都有多个长度不一的变异体。
具有多态性并已在连锁分析中定位的SSLP具有特别的价值,因其可直接建立遗传图和物理图之间的联系。
⑶随机基因组顺序从克隆的DNA中随机测序可获得有用的序列,也可从数据库中寻找感兴趣的某些序列。
23、SAGE
特点:
1)进行转录物组研究,也就是转录水平的研究;
2)通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列,从而接近完整地获得基因组的表达信息;
3)SAGE区别于差异显示、消减杂交等其它技术的主要特点是可用于寻找那些较低丰度的转录物,最大限度地收集基因组的基因表达信息,这使之成为从总体上全面研究基因表达、构建基因表达图谱的首选策略;
4)SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建,对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较,特别是对疾病组织和正常组织的比较发展迅速。
理论依据:
1)来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列(9-11bp)含有鉴定一个转录物特异性的足够信息,可作为区别转录物的标签(tag);
2)通过简单的方法将这些标签串联在一起,形成大量多联体(concatemer),对每个克隆到载体的多联体进行测序,并使用SAGE软件分析,可确定表达的基因种类,并可根据标签出现的频率确定基因的表达风度(abundance)。
步骤:
a)将5μg含有oligodT(引物)的磁珠和RNA混合。
b)合成双链cDNA。
c)用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签的产物。
d)将样品分成两份,连接成含有识别序列的产物,以备用BsmF1消化。
e)用MmeI切割每一个样品形成约60bp的标签。
f)延伸5秒,连接成约130bp的双链标签。
g)PCR扩增。
h)用NlaⅢ酶切130bp产物释放34bp双链标签。
i)连接片断形成串联体。
j)克隆到pZErO-1+里,并测序。
24、基因芯片的主要使用
1)基因表达检测拟南芥、酵母基因表达研究等;
2)突变检测BRCAⅠ基因外显子、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等;
3)基因组多态性分析人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分析及人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等;
4)基因文库作图通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图。
25、生物大分子的制备的主要特点:
⑴生物材料的组成极其复杂,常含有数百种乃至上千种化合物。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化步骤繁多、流程长。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物的体内环境就极易失活,因此在分离过程中如何防止其失活,就是生物大分子制备的最困难之处。
⑷生物大分子中的各种具体物质的组成比例不同。
⑸制备几乎都是在溶液中进行的,温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响,很难准确估计和判断。
26、生物大分子的制备步骤:
⑴明确生物大分子制备的目的和要求;
⑵建立相应可靠的分析测定方法;
⑶通过文献调研和预备性实验;
⑷生物大分子制备方案的选择和探索;
⑸生物材料的破碎和预处理;
⑹目的产物的提取及进一步的分离纯化;
⑺生物大分子制备物的均一性(即纯度)鉴定;
⑻目的产物的浓缩、干燥和保存。
27、生物大分子的分离纯化方法可粗略地分类如下
⑴以分子大小和形态差异为依据的方法:
差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。
⑵以溶解度差异为依据的方法:
盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。
⑶以电荷差异为依据的方法:
电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。
⑷以生物学功能专一性为依据的方法:
亲和层析等。
28、生物大分子样品的早期分离纯化:
(1)特点:
①粗提取液中物质成份十分复杂;②欲制备的生物大分子浓度很稀;③物理化学性质相近的物质很多;④希望能除去大部分和目的产物的理化性质差异较大的杂质。
(2)对所选方法的要求:
①要快速、粗放;②能较大地缩小体积;③分辨力不必太高;④负荷能力要大。
(3)可选用的方法:
吸附;萃取;沉淀法(热变性、盐析、有机溶剂沉淀等);离子交换(批量吸附、胖柱交换);亲和层析;
29、生物大分子样品的晚期分离纯化:
(1)可选用的方法:
吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。
(2)要注意的一些问题:
①盐析后要及时脱盐。
②用凝胶过滤时如何缩小上样体积,因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10~1/6,也可使用串联柱以加大柱床体积。
③必要时也可重复使用同一种分离纯化方法,如分级有机溶剂沉淀、分级盐析、连续两次凝胶过滤、离子交换层析等。
④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接,尽可能减少工序,提高效率。
如吸附不可放在盐析之后,以免大量盐离子影响吸附效率;离子交换要放在凝胶过滤之前,因为离子交换层析的上样量可以不受限制,只要不超过柱交换容量即可。
⑤分离纯化后期,目的产物的纯度和浓度都大大提高,此时对于很多敏感的酶极易变性失活,因此操作步骤要连续、紧凑,尽可能在低温下(如在冷室中)进行。
⑥得到最终产品后,必要时要立即冰冻干燥,分装并写明标签,-20℃或-70℃保存。
30、蛋白质样品制备原则和纯化方法:
原则:
(1)在适宜盐浓度下,可重复溶解所有蛋白质,包括疏水性蛋白质,并使样品中的分子以分离的形式存在;
(2)避免溶解性低的蛋白质(如胰蛋白)在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出;
(3)防止蛋白质的化学修饰,包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰;
(4)排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子;
(5)获得的目标蛋白质应在可探测水平,有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。
纯化方法:
1)沉淀法:
有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法、共沉淀法
2)根据形态差异建立的方法:
透析、超滤、离心分析
3)依据电荷特性设计的分离方法:
吸附交换分离法、聚焦层析、电泳法
4)根据稳定性建立的分离纯化方法:
热变性法、酸碱变性法、表面变性法
5)根据亲和作用建立的纯化方法:
亲和电泳、免疫吸附层析、疏水作用层析、共价层析
、金属螯合层析
6)高效液相色谱分离分析法:
体积排阻色谱、离子交换色谱法、反相色谱法、高效疏水作用色谱
31、双向凝胶电泳的基本原理
双向电泳的第一向是等电聚焦电泳,根据蛋白质的PI不同进行分离,第二向为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据分子量不同进行分离,样品经过电荷和质量两次分离后,得到等电点和分子量的信息。
32、双向电泳的分类
非变性2D-PAGE、非变性/SDS-2D-PAGE、非变性/还原/SDS-2D-PAGE、变性2D-PAGE
33、双向电泳分析中的样品制备:
1)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
2)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。
4)完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。
34、双向凝胶电泳的基本流程?
(1)等电聚焦:
标记胶条→样品上样及水化→置于聚焦盘内→设定IEF电泳程序→加矿物油覆盖胶面
(2)胶条平衡:
先在含有SDS、还原剂DTT但不含碘乙酰胺的平衡液中平衡,再在含碘乙酰胺的平衡液中平衡
(3)SDS-PAGE:
制胶→样品制备→加缓冲液→连接电源→电泳
(4)染色:
染色液及脱色液的配制→染色→脱色
35、双向电泳中第一向到第二向进行平衡过程的机理?
平衡buffer1:
还原(将S–S键转化为SH),DTT
平衡buffer2:
烷基化物(使每个SH均烷基化以防止S–S键的重新形成),碘乙酰胺
36、有机染料和银染
1)考染灵敏度为30~100ng,线性范围是20倍;银染的线性范围是40倍,灵敏度是考染的100倍。
2)胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色,其极限灵敏度为8~10ng,但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。
3)胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。
4)银染的缺点是:
对某些种类的蛋白质染色效果差,对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。
5)这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。
37、预防酶自解和微生物的污染:
⑴使用较好的测序级TPCK-Trysin;
⑵在加酶使胶块吸胀后,一定要去掉多余的酶液,不要认为这样会影响酶解效率;
⑶酶解时间不宜过长,~24hr;
⑷电泳玻板、染胶的器皿等用前要清洗;
⑸所用试剂和溶液的纯度要高,以保证质谱分析的可靠性;
⑹尽量用干净的乳胶手套和洁净的EP管及Milliq水;
⑺尽量减少不必要的操作步骤,简化操作程序;
⑻要有一个洁净的操作环境。
38、胶内酶解注意事项:
⑴若样品种类较多,应将离心管编号,样品对号入管;
⑵考染方案各注释均适用银染方案;
⑶整个操作过程应注意角蛋白等的污染;
⑷佩戴一次性乳胶手套,使用洁净的离心管及Millipore水;
⑸不同公司的酶需要不同的最适的pH,因此,需调pH值。
39、样品的纯化和浓缩:
⑴操作步骤
⑵配制适当的溶液
⑶对不同质量范围的蛋白质或肽段的提取效率应事先估计
⑷注意事项:
①整个操作过程润湿体积>0.6µl(因填料为0.6µl);
②pH<4;
③整个过程不能引入气泡;
④注意流速,最好速度均匀。
40、蛋白质定量分析策略
41、定量蛋白质组学?
内容:
是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。
通常情况是只需对两种不同状态细胞的蛋白质进行比较,只需相对含量的变化进行准确的定量即可。
意义:
研究方法:
(1)体内标记:
Ø15N体内代谢标记:
用富含15N的介质来培养细胞,15N被渗入合成的蛋白质中,从而充当其定量的内部标准,每结合一个15N,该肽比正常14N的相同肽大一个质量单位,使得不同细胞状态来源的肽段得以区分,肽质谱峰信号成对出现,从而根据质谱峰的信号强度来进行准确的定量。
☹缺点:
由于相同肽段的不同同位素标记形式之间的质量变化依赖于氮原子数目,因此对未知蛋白难以进行定量。
Ø稳定同位素标记的必需氨基酸标记:
在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸,如Lys、Leu、Phe等。
这主要用于高等动物细胞中蛋白质的定量以及鉴定。
优点:
省去了标记化学反应和分离纯化等步骤,因而减少了样品的损失,有利于低丰度蛋白质的高灵敏度检测。
缺点:
1.不能对组织来源的蛋白质进行分析。
2.同位素介质可能会影响蛋白质的表达水平。
3.受成本限制,不能对整个动物体进行标记。
4.无法确定标记物和肽段之间量的关系。
(2)同位素亲和标签技术ICAT
ICAT试剂包括三部分:
1.反应基团,可特异地和蛋白质侧链上的半胱氨酸(Cys)残基的-SH进行反应,使试剂共价结合在蛋白质侧链上;2.同位素标记的接头,含有稳定同位素(H和D)的标记;3.亲和标记的生物素,用于分离标记的蛋白质或多肽。
ICAT试剂中8个X位置被H取代时,称为轻试剂(D0),8个X位置被D取代时,称为重试剂(D8)。
轻试剂和重试剂的相对分子量差8Da或4Da(肽段带两个电荷)
在质谱图上这对标记蛋白质的肽段离子峰m/z相差8或4,从而能将来自不同样品的同一蛋白质分离开。
ICAT策略的优点:
:
a)若一种蛋白质酶切产生至少一个Cys残基的肽段的话,就可以对其进行鉴别和定量。
含有Cys残基的肽段越多,结果对照得出的结论就越准确;
b)鉴定的肽段中肯定都会有至少一个Cys,因此在进行数据库搜索时就增加了一个有效的约束条件;
c)肽段根据标记情况有选择性地得到了富集,从而减少了下游质谱分析的复杂程度;
d)分离出来的标记多肽可直接和后面的RP-µLC-MS分析系统在线偶联操作;
e)可直接对混合样品进行分析;
f)可对低丰度蛋白质直接捕获和快速定性、定量鉴定,尤其是对膜蛋白等疏水性蛋白质;