福建农林大学微生物综合实验实验报告.docx
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福建农林大学微生物综合实验实验报告
《微生物综合实验》报告册
专业2013级生物科学（生物学基地班）
学号
姓名
生命科学学院
二O一六年六月
实验一、细菌的分离与纯化
一、实验目的
1、掌握培养基的作用和NA培养基的配制
2、熟练掌握无菌操作技术（灭菌锅和超净工作台）
3、掌握分离纯化菌种（涂布平板法和划线分离法）
4、了解菌种保种的方法
二、实验原理
1、培养基是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。
NA培养基主要成分为：
牛肉膏、蛋白胨和NaCl。
蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；氯化钠能维持均衡的渗透压并提供微生物生长所需的矿物元素之一——钠离子；需要时可以使用琼脂作为培养基的凝固剂。
2、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
试验中通过选用某种分离的方法在平板上进行操作，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
常用的分离、纯化方法：
单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法。
三、实验材料
1、菌种：
待分离纯化的菌
2、实验药品：
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，去离子水，琼脂（或琼脂粉）
3、实验器材：
电子天平，超净工作台，恒温培养箱，摇床，灭菌锅，试管，试管塞，锥形瓶，玻璃棒，封口膜，烧杯，培养皿，接种环，酒精灯，移液枪，枪头，1.5mL离心管
四、实验步骤
1.制备培养基
NA培养基配方（g/L）：
牛肉膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
（固体培养基需要加入琼脂15g/L，pH=7.3±0.1）
依次称取蛋白胨、牛肉膏和NaCl到烧杯中，取所需水量的一半放入烧杯中溶解，用NaOH调节pH至7.3，最后补足水量（若配固体培养基则另加琼脂粉），培养基经分装包扎之后，立即进行高压蒸汽灭菌，12l℃灭菌20min。
2、目的菌株的分离、纯化
（1）摇床培养：
用接种环从长有未知菌的培养基中刮取未知菌到5mlNA液体培养基试管，摇床培养8-12小时以获得菌液。
（2）梯度稀释：
吸取100ul上述菌液和900ulLB液体培养基在1.5ml离心管中震荡混匀后获得终浓度为10-1的菌液；再将此菌液作为母液用上述方法进行稀释，震荡混匀后获得终浓度为10-2的菌液；此后都将新稀释的菌液作为母液，用上述方法进行稀释，震荡混匀后依次获得终浓度为10-1、10-2、10-3和10-4的菌液，同时将这四个菌液作为待纯化的菌液进行平板划线接种。
（3）倒平板：
将NA固体培养基融化后，倒10～12mL于灭过菌的培养皿中，待凝固。
（4）涂板分离：
将不同浓度的菌液各自取150μL于NA固体培养基中，用涂布器涂匀至干，正置5min，放入28度培养箱培养16-24h。
（5）划线分离：
用接菌环去不同浓度的菌液分别于相对应的NA无菌平板上进行划线分离，左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按四个分区进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。
三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。
（6）挑取菌株：
从培养皿中刮取单菌落到5mlNA液体培养基试管中，培养8-12小时以获得菌液。
五、注意事项
1、配好的培养基应立即高压灭菌，防止杂菌生长，改变培养基的成分。
2、划线分离时及前后，接菌环要灼烧干净，防止杂菌污染。
3、由于放线菌菌丝致密不易挑起，故应连带培养基一起挑起于液态培养基培养，再进行划线分离或是涂布分离。
六、实验结果与讨论
1、实验结果
分离纯化：
纯化培养：
2、讨论分析
从实验的结果上来看，基于实验所用的待测放线菌，划线分离的效率和获得单菌落的可能性都较大于涂布平板方法，仅有划线分离的平板上成功生长出单菌落。
原因可能是由于放线菌在液体培养基中的菌丝抱团形成菌丝球在涂布过程中难以被打开导致较难生成单菌落。
而在平板培养过程中可以发现待测放线菌菌丝较细，生长缓慢，相互缠绕，形成的菌落质地致密、表面呈较紧密，菌落坚实较小而不蔓延。
纯化培养如图，培养基澄清，细菌以菌丝球形式存在，都符合放线菌的特征，说明该步骤的分离和纯化是成功的。
实验二、细菌显微形态观察
一、实验目的
1、掌握革兰氏染色法鉴别细菌的原理及操作方法；
2、学会使用油镜观察细菌的形态，初步鉴定待测菌；
二、实验原理
革兰氏染色的差异主要是由于阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的。
通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
3、实验材料
1、菌种：
在平板上生长16小时的待测菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。
2、试剂：
无菌水，草酸铵结晶紫染液，碘液，95%乙醇，番红染液，液体石蜡。
3、实验器材：
普通光学显微镜，超净工作台，灭菌载玻片，吸水纸，擦镜纸，接种环，酒精灯，打火机，计时器。
四、实验步骤
1.革兰氏染色确定待测菌的阴阳性
（1）涂片：
取灭过菌的载玻片于超净工作台上，并滴一小滴无菌水在载玻片的中央，再用烧红冷却后的接种环挑取单菌落至无菌水滴中，并涂抹成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。
（2）干燥：
将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。
（3）固定：
固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2~3次，共约2~3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。
（4）初染：
在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
（5）水洗：
斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
（6）媒染：
用碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min。
（7）水洗：
斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
（8）脱色：
斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，用时不能超过20秒，随即水洗。
（9）复染：
在涂片薄膜上滴加番红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约2min。
（10）水洗：
斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。
（11）干燥、观察：
用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后滴一滴液体石蜡在玻片上，用油镜观察细菌的形态及颜色,紫色的是革兰氏阳性菌，红色的是革兰氏阴性菌。
2.纯度检查
在革兰氏染色之后，随机观察五个视野，菌的形态一致，即为纯菌。
五、注意事项
1、干燥时，应将载玻片置于酒精灯上方稍稍加热，加热时间不能过长，应以载玻片背面不烫手为宜。
2、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
3、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
4、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
在用95%乙醇脱色时，应将旁边的酒精灯熄灭或原理酒精灯操作，以防95%乙醇挥发着火。
且脱色时间应不超过20s，脱色过程中前5s应使乙醇浸没涂片，随后开始用乙醇冲洗。
5、复染所用的番红染液浓度不宜过高，若染液浓度较高，可适当缩短染色时间，以防镜检时，对细菌的颜色观察造成影响。
6、每次水洗过后用吸水纸吸掉涂片上的水滴时，将吸水纸覆盖在涂片上轻轻稍按压使水分吸干即可，动作要轻柔，不能用力擦拭，以防被固定的涂片被擦拭掉。
6、实验结果与讨论
1、实验结果
2、分析和讨论
（1）由上三图对比可得待测放线菌呈紫色，与葡萄球菌同属于革兰氏阳性菌。
此结果可于后期实验五测序对比得知待测菌种后再次验证。
（2）染色中由于番红染液可能的浓度差异，导致了镜检时阳性菌（葡萄球菌和待测放线菌）除了紫色以外还附着过多的红色，所以复染的步骤不应局限于实验步骤所提供的时间，必要时候须进行多次的重复实验以获得较好的镜检结果。
（3）由于放线菌菌丝质地致密，涂片时需要仔细耐心地将菌落涂开，以观察到细致的待测放线菌视野，不然容易出现菌体高密度凝聚导致无法观察菌体特征。
实验三、纯化后细菌菌株的生长曲线测定
一、实验目的
1、了解细菌生长曲线测定的意义
2、了解测干重法的原理和内容
3、学习用测干重法测定细菌的生长曲线
二、实验原理
以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。
不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。
由前面实验观察得知：
待测菌是丝状细菌，在摇床液体培养过程形成菌丝球，而呈不均匀分布，所以不采用单细胞细菌的测OD值的方法绘制生长曲线，而采用测细胞干重的方法绘制生长曲线。
3、实验材料
1、菌种：
已纯化好的待测菌
2、培养基：
已分装4ml至试管的液体NA培养基若干只
3、实验器材：
恒温摇床，超净工作台，80℃恒温烘箱，电子分析天平，台式离心机，4ml离心管，200uL移液枪，200uL枪头，马克笔。
四、实验步骤
1、生长曲线实验步骤
（1）先取36出个空5ML离心管，分为3组，每一组分别用马克笔标记23℃、28℃和33℃。
其中，每一组又分为12个，每一个再分别用马克笔标记0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h和24h。
然后放入烘箱烘干，逐一称重，记录干燥的离心管管重A。
（2）将36个已分装4ml至试管的液体NA培养基、马克笔、100uL移液枪和200uL枪头放入超净工作台紫外照射灭菌20分钟。
（3）吸取培养24h的菌液50ul至每一根分装有4ml液体NA培养基的试管中，分为3组，用马克笔分别标记23℃、28℃和33℃，然后用橡皮筋捆好，分别放入23℃恒温摇床、28℃恒温摇床和33℃恒温摇床进行培养。
（4）当细菌生长0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h和24h时，从摇床中将对应生长时间的试管拿出来，摇匀后倒入对应生长时间的5ml离心管中，12000r/min，离心10分钟。
（5）小心吸取3ml上清，将离心管放入80℃烘箱烘干至重量不再变化，此时放入电子分析天平称重，记录重量B
（6）将各个生长时间对应的重量B减去重量A，即得到细菌在不同温度不同生长时间的细胞干重。
2、在excel上绘制三个温度的生长曲线于同一图表上
以细胞干重为Y轴，以生长时间为X轴绘制细菌生长曲线。
五、注意事项
1、离心管在使用前需要烘干，以免因其受潮而导致实验数据发生偏差。
2、接种时需要在超净工作台中操作，以免杂菌污染，导致实验失败。
3、吸取上清时，需要小心操作，不要吸取沉淀部分。
4、实验过程中，应注意设置平行以减少每次实验过程的偶然误差，实验不理想的情况下应进行多次重复以得到最准确的结果。
6、实验结果与讨论
1、实验结果
2、分析与讨论
（1）由图中长曲线可知，23℃培养时待测放线菌对数生长期应在14-16h之间，培养开始的15h左右具有最大斜率，即23℃培养的第15h细菌具有最大比生长速率。
28℃和33℃都无明显的的稳定期，故无法准确判断其对数生长期的范围和最大比生长速率（由图可得明显快于23℃）。
但是依旧可以从曲线中大致判断14h时，28℃生长曲线高于33℃，推测待测放线菌的最适生长温度在28℃左右。
（2）本次生长曲线由于课程实验时间限制以及学生自己时间安排原因仅进行了一次测定。
同时测定生长曲线过程中的几项称量步骤也不是由同一个人操作，所以造成了测得的生长曲线波动过大，且存在明显的异常点。
在条件允许的情况下若出现该问题，应进行重复实验，且每个温度条件下应有2-3个平行。
（3）基于生长曲线于最后6-8h内都出现了明显的衰减期现象。
推测原因应该是所用培养基过少（4mL）所致。
改进方向可分为增加培养基的量以增大K值，即以10-20mLNA液体培养基作为基本培养条件进行生长曲线的测定，也可以减少两次观测时间的间隔，即为1h或1.5h称量一次，间隔也可更短。
实验四、纤维素降解菌酶活的测定
一、实验目的
1、学会自主学习、查阅文献了解测定纤维素酶活的方法；
2、掌握刚果红平板法和DNS法测定纤维素降解菌酶活的原理和具体操作方法；
3、了解纤维素酶的作用特性。
二、实验原理
刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。
当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红--纤维素的复合物便没法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，根据待测菌在刚果红-羧甲基纤维素钠（CMC-Na）选择培养基上是否产生透明圈及透明圈的大小，初步判断待测菌的纤维素分解能力。
纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520nm处的吸光度，从葡萄糖标准曲线上得出生成的还原糖的量。
以每分钟生成相当于1mg的还原糖为一个酶活性单位，通过计算得出酶活力大小。
公式如下：
U=还原糖糖量/（30min*V）
其中，U表示在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1mg还原糖的酶量；30min表示酶与底物的作用时间；V表示粗酶液的体积（mL）；葡萄糖量从标准曲线中查出。
三、实验材料
1、菌种：
已纯化的待测菌
2、培养基：
刚果红-羧甲基纤维素钠（CMC-Na）选择培养基，NA液态培养基
3、试剂：
，3,5—二硝基水杨酸溶液（DNS显色剂），葡萄糖标准溶液（1mg/mL），CMC-Na溶液，2mol/lNaOH，蒸馏水，0.5%CMC-Na的柠檬酸缓冲液（pH4.4）
4、实验器材：
分光光度计，电热鼓风干燥箱，恒温水浴锅，冷冻离心机，恒温培养箱，电磁炉，移液枪，灭菌枪头，20ml具塞刻度试管，10ml离心管，培养皿，锥形瓶，电子天平，量筒，烧杯，容量瓶，棕色瓶，玻璃棒，称量纸。
四、实验步骤
1.刚果红平板初筛
在选择培养基上点种待测菌，在28℃条件下培养3d，观察是否有透明圈产生。
2.葡萄糖标准曲线的绘制
（1）取8支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,在每管中按下表所示的量分别加入葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，总体积为3.5ml：
表1葡萄糖标准曲线制作
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL）
蒸馏水
（mL）
DNS
（mL）
葡萄糖含量
（mg）
光密度值
（OD540nm）
0
0
2
1.5
0
1
0.2
1.8
1.5
0.2
2
0.4
1.6
1.5
0.4
3
0.6
1.4
1.5
0.6
4
0.8
1.2
1.5
0.8
5
1.0
1.0
1.5
1.0
6
1.2
0.8
1.5
1.2
（2）摇匀后置于沸水浴中加热5min后，冷却定容至20ml。
（3）摇匀后以0号管为对照于520nm处测定OD值，以葡萄糖含量mg为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
3.羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定
（1）酶液提取：
将菌株接种于NA培养基，30℃，l80rpm培养4d，从培养基中取5ml菌液放人试管，4000rpm离心5min。
移取上清液，即为酶液
（2）柠檬酸缓冲液的配制：
11.4mL0.1M柠檬酸溶液+8.6mL0.1M柠檬酸钠溶液
（3）酶活测定：
取0．5ml于试管中，加入含0．5％CMC—Na的柠檬酸缓冲液（0．05mol／L，pH4．4）1．5ml，50℃水浴锅准确作用30min，在每试管内加1.5mlDNS试剂，沸水浴5min，立即冷却，定容到20mL，520nm处测定其OD值，对比标准曲线，求葡萄糖含量。
五、注意事项
（1）CMC-Na粉末较难溶于水，在溶解时，应少量多次慢慢加入水中，并边加边用玻棒搅拌。
（2）葡萄糖使用前需要放入烘箱烘干，以免葡萄糖受潮对测定结果产生影响。
六、实验结果与讨论
1、实验结果
（1）刚果红培养基初筛
无明显水解圈
（2）DNS法测纤维素酶酶活结果：
管号
1mg/mL葡萄糖标准液
（mL）
蒸馏水
（mL）
DNS
（mL）
葡萄糖含量
（mg）
光密度值
（OD540nm）
0
0
2
1.5
0
0
1
0.2
1.8
1.5
0.2
0.107
2
0.4
1.6
1.5
0.4
0.306
3
0.6
1.4
1.5
0.6
0.517
4
0.8
1.2
1.5
0.8
0.762
5
1.0
1.0
1.5
1.0
0.967
6
1.2
0.8
1.5
1.2
1.173
用excel作图，以葡萄糖含量mg为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线如下
测得样品的吸光值为：
0.043，计算得还原糖生成量为0.104mg。
2、分析与讨论
（1）在刚果红培养基中粗筛，并没有得到明显的水解圈。
在DNS法中测得酶活只有0.00693U。
可以明显看出本小组所分离纯化的待测放线菌不利用纤维素或是不会生成胞外纤维素酶。
（2）本次实验中，仅对细菌是否具有外分泌型的纤维素酶进行的测定，可以得出该细菌没有胞外纤维素酶。
但是待测放线菌是否具有胞内的纤维素酶还有待测定。
可以重新设计实验进行探究。
（3）本小组测定酶液酶活时并为用无菌的液体培养基作为空白对照进行试验，这是本次试验中的一个缺漏，以往实验中需要注意，但从实验结果中，该缺漏无较大影响。
（4）标准曲线的R值仅为0.9932，属于较不准确的标准曲线。
考虑到实验条件的的影响，该结果还可以接受。
但建议如果有需要制作标准曲线的实验尽量采用较为精密的移液器和配套的枪头，或是成套的玻璃仪器。
以提高R值。
实验五、细菌16srDNA提取和基因测序
1、实验目的
1、理解PCR扩增技术的原理并学会PCR扩增技术；
2、熟练掌握PCR仪器的使用；
3、熟练掌握凝胶电泳的原理和方法。
二、实验原理
1、聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互补链。
它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
2、凝胶电泳的原理：
当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极,这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率。
当核酸分子被放置在电场中时,它们就会向正电极的方向迁移。
在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型,分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子迁移要快些。
以此来分离不同片段的DNA并确定其分子量。
三、实验材料
1、菌种：
在28℃培养了20h的待测菌
2、试剂：
PCR试剂盒，无菌水。
3、实验器材：
PCR仪，PCR管，超净工作台，移液枪，枪头，马克笔。
四、实验步骤
1.对数期新鲜菌液直接PCR扩增
（1）PCR扩增体系（25ul）
Mix………………12ul
27F………………1ul
1492R……………1ul
菌液……………2ul
ddH2O……………9ul
（2）PCR扩增条件
98℃………………5min
95℃………………1min
72℃………………1min
54℃………………1min40s（回到第2步，重复35次）
72℃………………10min
4℃………………∞
2.PCR产物进行凝胶电泳
（1）胶的制备：
称1.2g琼脂糖置于小锥形瓶中，加入100mL1*TAE稀释缓冲液，加热直至琼脂糖完全溶解（透明溶化液）；待冷却至60℃戴手套操作：
小心加入5µL核酸染料，摇匀；将琼脂糖倒入胶模中，插入样品梳；待凝固完全后，双手均匀用力轻轻拔出样品梳；取下凝胶，移入电泳槽，倒入电泳缓冲液直至浸没凝胶面2-3mm。
（2）点样：
用移液枪依次将所提取DNA与加样缓冲液（loadingbuffer）5:
1混合后点入加样孔内。
（3）电泳：
180V电泳15-20分钟。
（4）UV下观察并拍照
3.将在UV下可观察到条带所对应的PCR产物送去公司测序
五、注意事项
（1）倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用枪头小心吸去；
（2）操作时不能说话，以防止外源DNA和核酸酶进入，对实验结果产生较大影响；
（3）加样时，要在冰上进行，以防止酶活性受到影响。
（4）加样完成后需立马进行PCR或者先放入4℃保存，并且进行PCR前需要将样品混匀，不能有气泡。
6、实验结果与讨论
1、实验结果
电泳结果：
测序结果：
Streptomycessp.Js-1（2011）16SribosomalRNAgene,partialsequence
2、分析与讨论
（1）电泳结果显示所得DNA片段大概为1500bp左右，与测序结果1381bp相近。
（2）比对结果显示本小组所分离的放线菌为链霉菌属细菌，但是未能定种。
综合其他实验可以推断本小组分离纯化出的放线菌为革兰氏阳性菌、最适生长温度28℃左右、无胞外纤维素酶的链霉菌属放线菌。
附录1：
生长曲线原始数据
23℃
管重
离心烘干
净重
0
1.8969
1.898
0.0011
2
1.901
1.9023
0.0013
4
1.8761
1.8779
0.0018
6
1.907
1.9096
0.0026
8
1.8931
1.8955
0.0024
10
1.9036
1.9056
0.0020
12
1.8838
1.8859
0.0021
14
1.8977
1.9019
0.0042
16
1.9076
1.9179
0.0103
18
1.9269
1.9377
0.0108
20
1.8046
1.8149
0.0103
22
1.8686
1.877
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