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westblotting详尽方案

Western印迹法

这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。

Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。

这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。

仪器：

高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。

试剂：

单去污剂裂解液、0.01mol/LPBS（pH7.3）、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/LNaCl溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。

杂品与耗材：

各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸，

试剂配制：

（一）母液

1.0mol/LTris·HCl

Tris（MW121.14）30.29g

蒸馏水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

PHHCl

7.4约17ml

7.5约16m

7.6约15ml

8.0约10ml

1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF

PMSF0.174g

异丙醇100ml

溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。

0.2mol/LNaH2PO4

NaH2PO4（MW119.98）12g

蒸馏水至500ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

0.2mol/LNa2HPO4

Na2HPO4·12H2O（MW358.14）71.6g

蒸馏水至1000ml

溶解后，高压灭菌，室温保存。

10％SDS

SDS10g

蒸馏水至100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。

如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺0.1g

超纯水1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）

Tris（MW121.14）45.43g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）

Tris（MW121.14）15.14g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

40％Acr/Bic（37.5：

1）

丙稀酰胺（Acr）37.5g

甲叉双丙稀酰胺（Bic）1g

超纯水至100ml

37℃下溶解后，4℃保存。

使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20

Tween2020ml

蒸馏水至100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（50mmol/LTris·HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100g/mlPMSF）：

1mol/LTris·HCl（pH8.0）2.5ml

NaCl0.438g

TritonX－1000.5ml

蒸馏水至50ml

混匀后，4℃保存。

使用时，加入PMSF至终浓度为100g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。

0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）

0.2mol/LNaH2PO419ml

0.2mol/LNa2HPO481ml

NaCl17g

蒸馏水至2000ml

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250：

100mg

95％乙醇：

50ml

磷酸：

100ml

蒸馏水至1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15mol/LNaCl

NaCl（MW58.44）0.877g

蒸馏水至100ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）

BSA0.1g

0.15mol/LNaCl1ml

溶解后，－20℃保存。

制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩校

10％分离胶（两块胶，10ml）4％浓缩胶（两块胶，5ml）

超纯水4.85ml3.16ml

40％Acr/Bic（37.5：

1）2.5ml0.5ml

1.5mol/LTris·HCl（pH8.8）2.5ml－

0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）－1.26ml

10％SDS100l50l

10%AP（过硫酸胺）50l25l

TEMED5l5l

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/LTris·HClpH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）

0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39g

SDS0.5g

溴酚蓝0.025

甘油2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液（25mmol/LTris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS）

Tris（MW121.14）3.03g

甘氨酸（MW75.07）18.77g

SDS1g

蒸馏水至1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

转移缓冲液（48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）

甘氨酸（MW75.07）2.9g

Tris（MW121.14）5.8g

SDS0.37g

甲醇200ml

蒸馏水至1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

10X丽春红染液

丽春红S2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

蒸馏水至100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液（100mmol/LTris·HClpH7.5,150mmol/LNaCl）

1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml

NaCl8.8g

蒸馏水至1000ml

TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween201.65ml

TBS700ml

混匀后即可使用，最好现用现配。

1*TBST1L

Trisbase2.422g（MW121.4）

Nacl8.775g

Tween200.5ml

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g

TBST100ml

溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，一次性使用。

洗脱抗体缓冲液（100mmol/L2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5mmol/LTris·HClpH6.8）

14.4mol/L2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）700l（通风厨里加）

SDS2g

0.5mol/LTris·HCl（pH6.8）12.5ml

超纯水至100ml

配制时，在通风厨内进行。

4℃保存。

可重复使用1次。

显影液（5X）

自来水（加热至50℃）375ml（以下药品加到温水中）

米吐尔1.55g

亚硫酸钠（无水）22.5g

碳酸钠（无水）33.75g

溴化钾20.95g

补水至500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。

4℃保存。

使用时用自来水稀释至1倍。

定影液

自来水（50～60℃）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠240g

亚硫酸钠（无水）15g

冰乙酸12.6ml

硼酸7.5g

钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存

抗体

用TBST稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml

化学发光试剂

购自北京中山公司，为SantaCruz产品，分A和B两种试剂。

操作步骤：

（一）蛋白样品制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、按1ml裂解液加10lPMSF（100mM），摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）

4、每瓶细胞加400l含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

）

6、于4℃下12000rpm离心5min。

（提前开离心机预冷）

7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。

（2）组织中总蛋白的提取：

1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400l单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。

然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按

（一）操作外还应收集培养液中的细胞。

以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。

弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、用枪洗干上清后，加100l裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定

（1）制作标准曲线

1、从－20℃取出1mg/mlBSA，室温融化后，备用。

2、取18个1.5ml离心管，3个一组，分别标记为0g，2.5g，5.0g，10.0g，20.0g，40.0g。

3、按下表在各管中加入各种试剂。

0g

2.5g

5.0g

10.0g

20.0g

40.0g

1mg/mlBSA

－

2.5l

5.0l

10.0l

20.0l

40.0l

0.15mol/LNaCl

100l

97.5l

95.0l

90.0l

80.0l

60.0l

G250考马斯亮蓝溶液

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

1ml

4、混匀后，室温放置2min。

在生物分光光度计（Bio－Photometer，Eppentoff）上比色分析。

5、

（2）检测样品蛋白含量

1、取足量的1.5ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1ml。

室温放置30min后即可用于测蛋白。

2、取一管考马斯亮蓝加0.15mol/LNaCl溶液100l，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。

3、弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml），再用无菌水洗一次。

4、取一管考马斯亮蓝加95l0.15mol/LNaCl溶液和5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。

注意：

每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。

可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。

测得的结果是5l样品含的蛋白量。

（三）SDS－PAGE电泳

（1）清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

）短内长外

2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可（下层胶3.2－3.5ml左右）。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（正丁醇，封胶，缓慢加，高度5mm，如用水封胶，容易造成条带相连）。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

）

配胶，按顺序加，上下层胶一起配，节省时间和枪头，最后加AP和TEMED。

要混匀，但不要过度，防止氧化注意温度，温度与凝胶速度成正比

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。

）配胶后2h-4h再跑电泳

6、测完蛋白含量后，计算含50g蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。

（上样总体积一般不超过15l，加样孔的最大限度可加20l样品。

）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7、加足够的电泳液后开始准备上样。

（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板；加电泳液，内液加满，外液40cm。

）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样经验：

不要吸进气泡，对光加样，枪头先顶后下滑插至加样孔中一半的位置，加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出样品，一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane，未加样孔中加等量的上样缓冲液，防止边缘效应）。

加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：

1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。

电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。

2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。

倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶

（2）电泳

电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V（电泳：

上层胶90V下层胶

120V）。

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，清水冲洗胶板，小心取出胶，进行转膜。

转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。

还有人在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。

（四）转膜

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用（PVDF膜切好后在甲醇中浸泡15s以上，再在转膜液中浸泡3min）。

（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。

这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

（撬时一定要小心，玻板很易裂。

）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

）

（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

一般用60V转移2h或40V转移3h。

（6）转完后将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。

然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

将膜晾干备用。

转膜

蛋白质常用的转移方法主要有两种：

槽式湿转和半干转移。

前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。

以下为槽式湿转的操作步骤。

1.     将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。

注意：

如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。

2.     依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。

如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和15秒钟。

3.     装配转移三明治：

海绵®3层滤纸®胶®膜®3层滤纸®海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。

切记：

胶放于负极面（黑色面）。

4.     将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。

注意：

应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。

5.     转膜结束后，切断电源，取出杂交膜

（五）免疫反应

（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六）化学发光，显影，定影

（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：

显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

（七）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

改进一：

配胶

背景：

在配制SDS-PAGE胶的时候，加入分离胶的过程中常常会带入气泡，即使用双蒸水来压平界面也有可能因为力度不匀而导致胶面不够齐平，最后使跑出来的相同大小的蛋白条带不在同一个水平面上。

方法改进：

所做的改进很简单却很有效，加完分离胶后，用移液枪吸取酒精（浓度没有特别要求，干净无污染就好）加到分离胶上至覆盖界面，静置片刻后放到37℃恒温箱中可加速胶的凝固。

待到分离胶完全凝固之后倒去上层的酒精，就可以看到齐平漂亮的界面啦！

方法改进：

改进的方法很简单易行——取一张我们常常随身携带的面巾纸，打个结放入盛有脱色液的大培养皿里放到脱色摇床上，这样一来，原来过夜脱色达到的效果现在只需要短短的3、4个小时就可以轻松实现了。

PS：

希望大家这个时候用的面巾纸是质量比较好不容易掉屑的

背景：

在配制SDS-PAGE胶时，由于梳子两边的小的密封条很容易断掉，之后，这些断掉角的梳子，配出来的SDS-PAGE胶，大多时候，两边的几个孔总是坏掉了，比如15孔的胶，一般就得到13孔或者更少的可以用的孔。

这样，如果自己刚好有13个样或者14，15个的话，满孔的胶就很方便了，一块胶就可以搞定！

方法改进：

配置好的上层胶后用琼脂糖密封。

配置好上层胶，加好，同时配制一些1%左右的琼脂糖，微波炉溶解，放在冷水里冷一下，用移液器加在梳子的两头，起到密封作用。

（注意：

切忌用刚热好的琼脂糖直接加在两头，琼脂糖冷一点但还没有凝固时这样最好）这样配出来的SDS-PAGE胶一般是满孔的，大家可以试试！

上样电泳：

上样前蛋白样品最好离心，上样量不宜过多，以免看结果时，每个条带都弯弯地“笑”你贪多嚼不烂哦。

其他的操作，按照说明控制电流，不要过多重复使用电泳Buffer（别小气，重复使用会降低缓冲能力的），好像基本不会出问题了。

当预染的Marker告诉你，你要分辨的蛋白已经到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，OK，电泳结束了。

PVDF膜适用的检测方法也不少，化学发光、常规显色、同位素和标准染色都一样OK，但不适合荧光。

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡，才能用，而且适用过程中万一干了也要同样程序再处理（不过要真出现这种问题也是自己欠扁，谁要你不小心呢，转膜前处理也就罢了，转膜后再这样处理可能会影响后继的抗体识别呢）。

PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

内参是最容易被忽略的一项。

我们知道，要用We