宏基因组实验计划.docx

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宏基因组实验计划

因组学方法研究明永冰川的初步实验方案

起草人：

浩宇

因组学研究方向及意义

研究：

环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。

开掘：

环境应激和应答基因的多态性。

探究：

多态性基因的功能。

实验大体步骤：

I.环境样品的采集：

1〕防止人源污染，采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。

2〕样品的迅速处理保存。

有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。

带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液（多为PBS）重悬，离心收集沉淀。

分装成小份，冻存于液氮或者‐80℃冰箱中，防止反复冻融。

3〕如果后续用间接法提取总DNA的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。

II.DNA提取方法的选择：

总DNA的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。

直接提取法就是直接对样品进展裂解，释放其中的DNA。

间接提取法那么是先别离样品中的微生物，后对微生物进展裂解。

两种方法的适用围不同，各自都有优缺点。

直接提取法的优缺点：

直接提取法多用在提取固体样品（如土壤、污泥、湖泊沉积物等）总DNA的试验中。

其最大的优点在于得率高，在某些环境样品总DNA提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。

造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA；二是许多微生物与基质形成复杂的构造，间接提取法不易对其进展别离。

在样品较珍贵时多采用此法。

其缺点同样明显，所得DNA的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保存下来，使得所得DNA呈现黄褐色甚至黑色。

可以考虑MoBio和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。

间接提取法的优缺点：

间接提取法那么既可以用来提取固相样品总DNA也可以用来提取液体样品总DNA。

在提取液体样品（如海水、河流等样品）总DNA时，需要用抽滤的方式浓缩。

与直接提取法刚好相反，其最大的优点在于提取DNA纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA时，也可以用缓冲液对收集的菌体进展反复冲洗以去除外表所带杂质。

其缺点是DNA得率低。

土壤DNA直接提取法：

（1）从超低温冰箱中取出保存样品（5g）；

（2）于室温融化；

（3）参加13.5mlCTAB抽提缓冲液和50μl蛋白酶K贮存液；

（4）离心管于37oC225rpm水平振荡30min；

（5）参加1.5mL20%SDS；

（6）65oC水浴2h，每隔15min轻轻颠倒数次；

（7）室温6,000g离心10min，收集上清液，转移至一个新的50ml离心管中；

（8）沉淀中再参加4.5ml提取液和0.5ml20%SDS，轻轻涡旋至混匀；

（9）浸入液氮中冷冻3min后，于沸水中煮沸3min；

（10）室温6,000g离心10min，收集上清液，与上次上清液合并；

（11）重复（8）、（9）、（10）一次；

（12）将三次提取所获上清液与等体积的苯酚：

氯仿（1:

1v/v）混合，摇匀后于4℃

12,000g离心10min；

（13）将上层水相转移至一新的50ml离心管中，参加等体积的氯仿：

异戊醇（24:

1），

混匀后于4℃12,000g离心10min；

（14）再次转移上清至一新的离心管中，参加0.6倍体积的异丙醇于室温沉淀1h；

（15）室温12,000g离心20min；

（16）收集沉淀，用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；

（17）向离心管中参加1mlTE，于4℃放置过夜，分装保存于‐20℃。

实验过程中的考前须知及一些技巧：

（1）整个提取过程吹吸动作要轻柔，防止剧烈震荡（试剂盒提取除外）。

（2）用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，防止机械剪切。

（3）酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。

（4）异丙醇沉淀时不要放在低温，0.7倍体积室温沉淀足够了。

（5）DNA溶解时可以放在4℃静置过夜，次日离心取上清去除多余杂质。

（6）水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。

水样DNA间接提取法：

（1）抽滤的方式浓缩采集到的水样。

（2）采取差速离心取得水样中的菌体。

（3）取得微生物后进展裂解提取。

此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。

例如：

用多少的水样进展浓缩，差速离心的转速选择。

会不会有DNA的丧失等等。

Epicentre推出了因组DNA别离试剂盒〔MetagenomicDNAIsolationKitforWater〕,能从水样中别离已随机剪切的，可直接用于fosmid克隆的DNA片段。

此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物〔包括革兰氏阳性菌〕中提取40kb大小的DNA。

提取的DNA可立即进展末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS载体上。

优势：

1.无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。

2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。

3.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。

4.Fosmid载体与DNA的克隆只需要90分钟。

下列图为方法与流程：

粗提DNA的纯化

采用直接提取法提取的总DNA或多或少都含有腐殖质的存在。

它的存在对后续的分子生物学操作会有影响，时常会导致PCR扩增不出来，酶切困难，连接转化率低。

需要进展纯化。

纯化的方法包括：

胶回收，柱纯化，电泳/电洗脱，梯度离心。

a胶回收

胶回收最大的优点在于快捷，可以在很短的时间完成。

纯化后的DNA往往能够满足PCR要求。

但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DNA分子造成机械损伤，使得DNA弥散，完整度下降。

如果后续的实验室分析16SrDNA，那么这种纯化方式不失为一种好方法。

b柱纯化

柱纯化相对于胶回收来说更为快速，十几分钟可完成。

与胶回收相比，其纯化效果要差一些。

但通常情况下，纯化之后的DNA也能够满足PCR需求。

这种方法也会造成DNA分子的机械损伤，使得DNA弥散，完整度下降。

c电泳/电洗脱

电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点：

其一，其价格低；其二，整个过程都很温和，能够保证DNA的完整性；其三，纯化后的DNA纯度较之前两种要好一些。

但是其亦有些许不便：

其一，过程耗时长，包括透析袋的准备，电洗脱，洗脱液的浓缩等；其二，DNA损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。

如果样品不是很珍贵，并且后续要进展Metagenomic研究，这种方法不失为一种好方法。

如果有脉冲场凝胶电泳系统，用此方法可以得到高纯大片段DNA，可以满足后续的metagenomicC/Fosmid文库构建。

d蔗糖/氯化铯密度梯度离心

如果实验室有超速离心机（100,000g以上），那么这种方法无疑也是一种好方法。

与电泳电洗脱法一样，这种方法在连续介质中对DNA及杂质进展别离，可以很好的纯化DNA。

纯化得到的DNA经过低熔点凝胶电泳切胶回收，可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的metagenomicC/Fosmid文库构建。

纯化质量的检测

DNA纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：

其一，完整度判断；其二，纯度判断。

a完整度判断

完整度判断同前所述，千万要记得的是加纯化之前的DNA样品做对照。

结果可以告诉我们纯化得率及完整度。

同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。

b纯度判断

纯度判断通常可以采用两种方法：

分光光度计法和PCR扩增法。

分光光度计可以测定双链DNA在260nm处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。

通过不同波长吸收值的比，可以对DNA纯度做出判定。

通常这种方法由于灵敏性较高，所以在存在杂质时误差较大。

III.所提DNA完整性检测

DNA的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进展指示。

最好采用0.8%琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间跑。

至少要用lambdaDNA/HindIII做marker，如果在23kb处有一条完整或略拖尾的带，那么证明DNA完整性尚好。

如有条件，可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA的完整度进展分析。

用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个maker，至少还应该有完整lambdaDNA（约48kb）充当另一个maker。

以上为送测序前样品的采集，DNA的提取，验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。

Illumina所进展的测序是由GenomeAnalyzer测序仪所完成的：

以上为GenomeAnalyzer技术的根本原理

IV.在DNA提取，检验完成后送BGI进展后续测序。