医学免疫学实验指导.docx
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医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导
（供医学、药学各专业使用）
主编：
刘彦平
编委：
邵嘉会陆东明李萍高翔
青海大学医学院病原生物学与免疫学教研室
2008年10月
前言
医学免疫学是医学院校必设的基础课程之一，按教学大纲要求医学免疫学的实验课时占总学时的1/3左右，说明该学科具有理论与实践紧密结合的特点及实验教学在学科中的重要性。
本课程设置要求学生不仅要掌握基础理论、基本知识，而且要学习和掌握各项基本技能。
据此，我们编写出《医学免疫学实验指导》一书，力求规范实验教学，从整体提高教学水平和教学质量。
本书结合教学工作实际，共编写14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，并附有一定量的思考题。
本书依教学进程安排实验次序，可帮助学生巩固基础理论知识，培养学生基本技能，提高教学效果。
免疫学和免疫学技术的发展日新月异，医学教育的改革不断向纵深发展，限于编者的学术及认识水平，本书难免存在缺点和不足。
为此，希望广大师生对本书提出宝贵意见，以便及时加以改进。
编者
2008年10月
实验室规则
实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为
保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：
一、学生在实验课前，应认真预习所要进行实验的内容，明确实验目的，了解实验原理，熟悉所要使用的仪器、药品的性质及操作程序，如有疑问，应事先请教指导教师。
二、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必须要带的物品如书本、文具应放在远离实验操作的指定位置。
三、进入实验室应穿白大衣，离开时将白大衣脱下并反折叠带走，在实验室内应保持安静，遵守秩序，不得大声喧哗，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
四、实验室内禁止吸烟、进食及饮水，严禁用嘴吸移液及湿润标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。
五、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应及时报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。
六、实验中所被污染过的器材、物品及其他盛过有菌物的容器、应用完后立即投入已准备的消毒剂（如来苏尔、氯胺液）中，不可随意仍放。
七、注意观察分析实验结果，独立思考解决实验中所遇到的问题，要严格按操作程序进行实验。
八、要爱护公共财物，节约水电及试剂材料，不得将实验物品私自带出实验室。
如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。
九、实验结束后，应清理实验用品，实验废弃物（包括实验动物尸体）应收入或倒入指定的地方和容器内。
每一同学均应服从卫生值日安排，认真负责地做好清洁卫生。
十、离开实验室前，应用84消毒液将双手浸泡5—10分钟，然后用清水洗净。
最后离开的同学应注意关水、关电、关窗、关门。
如有借用的物品和仪器要及时归还。
实验一显微镜的结构与使用
【实验目的】
1.熟悉光学显微镜的结构和成像原理。
2.掌握普通光镜的使用方法，尤其是油镜的正确使用。
3.了解暗视野、相差显微镜的原理和使用方法。
【实验用品】
1.器材：
普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2.标本：
细菌革兰染色玻片标本、普通变形杆菌24h内培养液、啤酒酵母新鲜培养的活标本。
【内容和方法】
一、普通光学显微镜的结构和使用方法
微生物是肉眼看不见而必须借助于光学或电子显微镜将其放大数百乃至数万倍才能观察到的微小生物，因此显微镜是认识和研究微生物最重要和最基本的工具之一。
因此，掌握其使用方法是进行微生物研究的基本技能。
1.普通光镜的基本结构
普通光镜无论其外观形状如何，它都由两大部分组成，即机械装置部分和光学系统部分。
机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘以及升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。
光学系统包括反光镜、聚光器、物镜和目镜。
它的作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像映与眼帘，是肉眼本不能分辨的物体得以清楚观察（图1-1）。
光学系统是光学显微镜的核心部分，而物镜又是其中最重要的部件。
一般的光镜配有3-4个物镜，有10倍的低倍镜、40倍的高倍镜和100倍的油浸镜（有的配有一个4倍的物镜头）。
标本的放大主要靠物镜。
为了使用方便，常用红、黄、蓝、白的色圈分别标记物镜倍数。
另外，在镜头上还刻有一些符号和数值，低倍镜上刻有10/0.25、160，10指放大倍数，0.25指镜口率（N.A），160表示镜筒长度（mm）。
高倍镜刻有40/0.65和160/0.17，40为放大倍数，0.65指镜口率，160表示镜筒长度，0.17则表示使用时所要求盖玻片的厚度。
油镜上刻有100/1.25和160/0.17，该数值也表示放大倍数、镜口率、镜筒长度、盖玻片厚度，除此之外，油镜头上还常刻有一个
“油”或“oil”字。
2.普通光镜的使用方法
（1）对光和调焦：
首先将显微镜平置于实验台上，转动物镜转换器使低倍镜与镜筒垂直到位（听到“咔”声即可），然后将反光镜凹面对着光源翻动，侧面观察聚光器明亮或从目镜观察视野明亮即说明对光完成。
如果此时虽对光较好却是也不够明亮时，应检查聚光器的光圈是否打开，聚光器是否升至最高。
对好光后即将标本置于载物台上的标本夹中（注意标本面向上），先用低倍镜观察。
用粗调节器调出物像后，再用细调节器调出清晰物像。
在换高倍镜观察时，由于高倍镜视野范围比低倍镜小，故须先将观察内容移至视野中央后再换之。
有时显微镜存在偏心现象，此时要记住其偏心的方向和距离。
（2）油镜的原理、使用、保护
在免疫学中主要使用的是油镜。
油镜是因为在使用时需用香柏油等作介质而得名。
光学显微镜的放大倍数与玻璃透镜的大小有关。
油镜的透镜小，镜孔也小，观察时由于聚光器聚集的光源要通过载玻片、空气，才能进入物镜中。
玻璃与空气的折光率不同，会产生折射，使一部分光线失掉，进入物镜的光线减少，致使观察视野暗淡，物像不清。
如果使用折射率与玻璃相近的油介质，即可减少折射，增加视野亮度，提高分辨率。
如图1-2所示。
最常用的油介质为香柏油和石蜡油，其折光率分别为1.515和1.46，与玻璃的折光率1.52相近似（空气为1）。
故可达到上述减少折射，增加光亮度的效果。
使用油镜时应先将集光器升至最高，光栅增至最大。
转开物镜镜头，在玻片上加一滴镜油，再转换油镜头。
眼从侧方看，调节粗调节器，使镜头浸入镜油中，以轻轻接触玻片为止（注意勿压碎玻片）。
眼看目镜，调节粗调节器缓慢下降载物台，看到物像，立即停止，改用细调节器调出清晰物像。
观察结束后，应用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭油镜头，再用于擦镜纸擦去残存二甲苯。
下降集光器，竖起反光镜，将物镜镜头摆成“八”字型，对号送入镜盒内。
二、暗视野显微镜和相差显微镜简介
观察暗视野显微镜和相差显微镜实物或图片。
暗视野显微镜是将普通光学显微镜换装上特制的暗视野聚光器或者在普通光镜聚光器上加一个中央遮光板改装而成。
使用暗视野聚光器或光板，光线不能通过聚光器的中心部位透入物镜；而只能从周边斜射经标本反射进入物镜，因此视野背景是暗的，标本成为亮点。
使用暗视野显微镜可检查不经染色，在普通显微镜下不易看清的活体微生物，如活的细菌、螺旋体等，它的缺点是不能观察生物体的内部结结构。
相差显微镜也称相衬显微镜。
相差显微镜具一个特殊的由环状光圈和聚光镜组合的转盘聚光镜和一组特别的相差物镜（内装相位板），能使直射光和绕射光产生干涉，改变其光相与振幅，形成明暗差，增强观察物体的立体感，并使细胞的内部构造清晰，因而可观察活体微生物的形态及某些内部细微结构。
【注意事项】
1.取送显微镜时动作要轻，一只手托镜座，一只手持镜臂，防止反光镜、目镜、物镜等脱落损坏。
2.油镜用后一定要擦洗，以防止油干影响其使用寿命。
注意擦镜时一定要用专用擦镜纸。
3.使用油镜时，一定要等标本干后才能加香柏油。
滴油时应避免气泡形成。
【实验报告与思考题】
1.为什么用油镜要等标本片干后才能滴加香柏油？
2.油镜有哪些标志？
如何使用油镜？
3.如果视野中光线太强或太弱，应该怎么做？
4.用油镜观察革兰染色细菌标本并绘图。
实验二白细胞的吞噬及溶菌酶试验
【实验目的】
1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。
2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。
【实验原理】
机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。
小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。
它们构成机体天然防御机能。
本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。
【实验用品】
1.器材：
显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。
2.材料、试剂：
3.8％枸橼酸钠、2％碘酒、75％酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6％可溶性淀粉、1％鸡红细胞悬液、溶壁微球菌（100mg／m1）、l／15mol／L磷酸盐缓冲液（pH6.4）、琼脂、标准溶菌酶（100ug／m1）、新鲜鸡蛋清（1:
10）、生理盐水、香柏油。
3.菌种：
白色葡萄球菌24小时斜面培养物。
4.动物：
小白鼠
【内容和方法】
一、小吞噬试验（中性粒细胞吞噬功能试验）
1.方法
（1）取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8％枸橼酸钠溶液。
（2）依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。
（3）将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。
（4）将上述凹玻片放人湿盒，于37℃温箱中作用45分钟，注意每15分钟混匀一次。
（5）取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血3—4环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。
接种环烧灼灭菌后放回原处。
（6）待血片自干后，用瑞氏染液染色。
用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。
然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。
2.结果分析
油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。
如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。
随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。
二、大吞噬试验
1.试剂配制
（1）6％可溶性淀粉肉汤：
取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4℃冰箱保存（只能保存一周）。
使用时37℃水浴溶解。
（2）1％鸡红细胞悬液：
取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。
2.方法
（1）试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤lml（注射时切勿刺伤内脏）。
（2）试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1％鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。
（3）注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。
用瑞氏染液染色。
（4）油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象（鸡红细胞为有核红细胞），并计算吞噬细胞的百分率。
瑞（Wright）氏染液：
瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。
配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。
三、溶菌酶测定
1.试剂配制
（1）溶壁微球菌菌液的制备：
菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mg／ml菌液。
经70℃水浴l小时杀菌，放置4℃冰箱备用。
（2）pH6.41／15mol/L磷酸盐缓冲液（沙伦生PBS）：
甲液：
无水Na2HPO49．46g溶于1000ml蒸馏水。
乙液：
无水KH2PO49．078g溶于1000ml蒸馏水。
然后取甲液27ml，乙液73ml，加NaCl0.5g即成。
2.方法及结果
（1）将1％磷酸盐缓冲液琼脂100rnl加热溶化，待冷至50—60℃时加入微球菌菌液1m1（每m1琼脂内含标准溶壁微球菌1mg）混和均匀，注入无菌平皿，每个平皿15ml。
（2）琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打4个孔，孔径5mm，孔距相等。
（3）用1m1注射器吸取唾液（由实验者收集自己的唾液于洁净平皿中取下层清液使用），加入琼脂孔内，以注满为度。
同时以标准溶菌酶、鸡蛋清作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照，分别作好标记。
（4）将平皿置于实验台上于室温中过夜，第二天观察琼脂孔周围的溶菌环。
根据溶菌环直径的大小比较唾液及二个阳性对照的实验结果，分析试剂中溶菌酶的含量。
【注意事项】
1.小吞噬实验中要掌握好抗凝剂与血液的比例，否则会使红细胞及白细胞破坏，影响结果的观察。
2.大吞噬实验时使用小白鼠处于直立姿势有利于腹腔渗出液的抽取。
3.溶菌酶实验中应注意无菌操作，否则杂菌生长会影响溶菌环的观察。
【实验报告与思考题】
1.在吞噬细胞中发现细菌时，如何区别吞噬的细菌和粘附在吞噬细胞表面的细菌?
2.简述机体非特异性免疫的概念及特点?
实验三巨噬细胞（白细胞）移动抑制试验
【实验目的】
1.熟悉巨噬细胞或白细胞的移动抑制试验的原理方法及意义。
2.通过本实验了解细胞免疫的特异性。
【实验原理】
根据白细胞可以游走的特点，将事先用布氏杆菌致敏的小鼠腹腔渗出细胞置毛细玻璃管中37℃培养，24小时候白细胞可从管口向外移动扩散成扇状。
若再次遇到相应的抗原时，由于致敏淋巴细胞能释放出巨噬细胞移动抑制因子（MIF）或中性粒细胞移动抑制因子（NIF），抑制巨噬细胞、中性粒细胞的移动，故白细胞游出毛细管口面积减少。
根据此情况计算的移动指数（MI），可反映机体的细胞免疫水平。
因此本实验是检测细胞免疫功能的方法。
【实验用品】
1.材料药品：
布氏杆菌致敏的小鼠、布氏杆菌抗原、Hanks液、RPMI1640培养液、凡士林、8%淀粉肉汤。
2.器具：
水平离心机、解剖显微镜（或低倍显微透射仪）、恒温箱、毛细玻璃管（内径1mm，两端粗细一致，长7~8cm）、平底凹孔玻璃板（凹孔直径2cm）、盖玻片、注射器、砂轮、带盖瓷盘。
【内容和方法】
一、动物细胞制备
布氏杆菌致敏的小鼠腹腔注射8%淀粉肉汤0.5ml，3～4天后将动物处死，向腹腔内注射2mlHanks液，无菌取出腹腔渗出细胞。
配成10%的细胞悬液（或用Hanks液洗涤2次后，配成8×107个/ml的白细胞悬液）。
二、操作方法
1.用长针头注射器吸取10%的细胞悬液，装入预先封好一端的毛细玻璃管内（约3/4体积），每份标本实验组和对照组各装4支，装入各管的细胞悬液应相等。
2.将毛细管置于离心管中，于水平离心机内，2000r/min离心5分钟后，用小砂轮沿毛细管的细胞-液面之间划痕，小心折断。
3.将含有细胞的毛细管端沾少量凡士林，置平底凹玻片中固定，加入RPMI1640细胞培养液，实验组培养液中加入相应的抗原，即2×106/ml布氏杆菌，对照组使含细胞培养液，加盖玻片，将凹玻片水平置于带湿纱布的瓷盘中，37℃孵育24小时后观察结果。
三、结果分析
取出凹玻片，用解剖显微镜或低倍显微透射仪测出各毛细管的巨噬细胞或白细胞移动的扇面长短直径，按以下公式计算出移动指数（MI）。
实验组（加抗原）移动直径平均值
MI=
对照组（不加抗原）移动直径平均值
MI＜0.8为阳性，0.8＜MI＜1.2为正常值
【注意事项】
1.在实验中，一批试验用的毛细管口径要相同。
2.试验中需严格按无菌操作方法进行，不能接触洗涤剂、消毒剂等，以免影响结果。
【实验报告与思考题】
1.记录结果，计算出MI，并作解释。
2.白细胞移动抑制试验有何实际意义?
实验四硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验
细胞生化功能的改变也可以间接地反映有关细胞的非特异免疫功能，本次实验进行中性粒细胞的硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验。
【实验原理】
细菌感染时给你正常的中性粒细胞能量消耗剧增，耗氧量增加，糖代谢活跃。
有氧化还原反应，糖氧化过程中所脱的氢可被吞噬的或渗透到中性粒细胞胞质内的NBT染料接受，使淡黄色的NBT还原成蓝黑色的甲臢，以折光性强的点状或斑块状颗粒沉积于细胞内。
镜下检查NBT阳性细胞数量，便可推知中性粒细胞的杀菌功能。
【实验用品】
1.NBT染液：
取0.28gNBT加入100ml生理盐水，用超细玻璃滤器过滤，分装，4℃保存。
2.0.77%沙黄O染液。
3.肝素：
用无菌生理盐水配制25U/ml肝素溶液。
4.培养液：
取0.5ml正常人血清加入0.3ml无菌生理盐水和0.6mlNBT染液。
5.甲醇、无菌生理盐水等。
6.碘酒与酒精棉球、温箱、凹玻片、湿盒、注射器、吸管等。
【操作方法】
1.取肝素抗凝外周静脉血0.1ml和培养液0.1ml加于凹玻片孔中混匀，置湿盒37℃20min，中间摇动一次，再置室温15min。
2.取一滴混悬液于载玻片一端推成薄片，空气中快速干燥。
3.甲醇固定1-2分钟。
4.用0.77%沙黄O染液5min，水洗，干后油镜下检查。
【结果判断】
凡中性粒细胞胞质内含有斑点状或块状的甲臢颗粒沉积者为NBT阳性细胞，计数100～200个中性粒细胞，计数NBT阳性百分率。
【实验讨论】
1.注意事项①NBT染液应过滤，不要残留颗粒。
②所用器皿应洁净，避免玻璃表面因素参加NBT的还原作用。
③单核细胞还原NBT的能力很强，在计算NBT阳性细胞时应除外。
2.方法评价该实验简便、快速、便于重复，但特异性差，易出现假阳性和假阴性结果。
3.临床意义正常人参考值应在10%以下；全身细菌感染病人NBT阳性细胞在10%以上；病毒感染、无菌血症的局部感染或循环中无细菌产物（如内毒素）时，NBT值正常。
慢性肉芽肿等吞噬细胞功能缺陷病无NBT阳性细胞，故可作为诊断该病的指标。
实验五凝集反应
【实验目的】
1.了解凝集反应的原理、基本类型及其用途。
2.熟悉玻片凝集试验、试管凝集试验、间接凝集试验的实验方法和结果分析。
【实验用品】
1.材料试剂：
伤寒杆菌、大肠杆菌18～24小时琼脂斜面培养物、伤寒杆菌H血清、伤寒杆菌H菌液、待测孕妇尿液、HCG阳性孕妇尿液、1:
10稀释伤寒杆菌诊断血清、ABO血型标准血清、类风湿免疫诊断试验（用变性IgG致敏的乳胶颗粒）、HCG致敏乳胶试剂、兔抗HCG诊断血清、待测血清、生理盐水。
2.器材：
洁净载玻片、巴氏吸管、乳胶皮头、接种环、酒精灯、特种铅笔（或记号笔）、小试管、牙签、采血针、75%酒精棉球、无菌干棉球、试管架；1ml、5ml刻度吸管、37℃恒温箱（或37℃/56℃水浴箱）、显微镜。
【内容和方法】
一、玻片凝集试验（slideagglutination）
1.原理
玻片凝集试验（slideagglutination）是将已知的抗体直接与未知的颗粒性抗原物质（如细菌、立克次体、钩端螺旋体等）混合，在有适当电解质存在的条件下，如两者对应便发生特异性结合而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。
此法属定性试验，主要用于检测抗原，如ABO血型鉴定、细菌鉴定和分型等。
2.方法
（1）取载玻片一张（平置实验台上），用特种铅笔或记号笔划分为3格，并标明1、2、3。
（2）取巴氏吸管一支，套上乳胶皮头后，吸取1:
10稀释的伤寒杆菌诊断血清1～2滴于第1、2格内，另取巴氏吸管一支，吸取生理盐水1～2滴于第3格内。
（3）将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后取少许伤寒杆菌菌培养物与第1、3格内的诊断血清、生理盐水混合并涂抹成均匀悬液。
然后用同样方法取少许大肠杆菌培养物与第2格内的的诊断血清混合并涂抹成均匀悬液。
静置数分钟后观察结果。
3.结果观察与判定
如上述混合悬液由均匀混浊状变为澄清透明，并出现大小不等的乳白色凝集块者即为阳性（＋）；如混合物仍呈均匀混浊状则为阴性（－）。
如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
本次实验结果第1格内应出现大小不等的乳白色凝集物（阳性），第2、3格内无凝集物，混合液仍呈均匀混浊状（阴性）。
【注意事项】
（1）伤寒杆菌为肠道致病菌，在实验中务必严格无菌操作，遵守实验规则，用后的载玻片应立即投入指定的容器中，接种环必须做灭菌处理。
（2）取细菌培养物时，不宜过多，与抗血清混合涂抹时，必须将细菌涂散，涂均匀，但不宜涂得太宽，以免很快干涸而影响结果观察。
二、人类ABO血型鉴定试验（玻片法）
1.原理
人类ABO血型抗原有A和B两种。
A型红细胞膜上有A抗原，B型红细胞上有B抗原，AB型有A和B两种抗原，而O型则不含有A和B抗原。
据此，如分别将抗A和抗B血清与待测红细胞混合，抗A和／或抗B血清与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况便可判定受试者的血型（见表5-1）。
表5-1血型鉴定试验结果与判定
凝集反应诊断血清
血型
抗A抗B
A
+-
B
-+
AB
++
O
--
“+”表示凝集，“-”表示无凝集。
2.方法
（1）用酒精棉球消毒无名指指端皮肤或耳垂，待酒精干后用无菌采血针刺破表皮，用毛细吸管取血1～2滴，放入含1m1生理盐水的小试管中，混匀，即成待检红细胞悬液
（约2％）。
取血后，应立即用无菌干棉球压迫针眼止血。
（2）取凹玻片或载玻片一张，用记号笔分为两格，并注明A、B字样。
（3）用巴氏吸管吸取抗A血清、抗B血清各一滴分别滴于A、B格内（也可用2ml的一次性注射器代替巴氏吸管）。
（4）另用巴氏吸管取待测5%红细胞悬液，于A格和B格内各加一滴。
然后分别用牙签将抗血清与红细胞搅拌均匀（也可轻轻晃动载玻片以促其充分混匀），以加速其反应。
将玻片放置于实验台上静置数分钟后，在白色背景下观察凝集情况。
3.结果观察与判定
如混合液由均匀红色混浊状逐渐变为澄清，并出现大小不等的红色凝集块者即为红细胞凝集；若混合液仍呈均匀混浊状，则表明红细胞未发生凝集。
如肉眼观察不够清楚，可将玻片置于显微镜下用低倍镜观察。
不凝集（-）凝集（+）
4.注意事项
（1）试验用凹玻片或载玻片要清洁，注明A和B字佯。
（2）所用抗A、抗B血清必须在有效期内（注意试剂包装说明的有效期限）使用。
（3）待检红细胞悬液不宜过稀或过浓。
（4）要及时观察结果，以防时间过长使标本干涸而影响结果观察和判定。
三、试管凝集反应
1.原理
试管凝集反应是一种定量试验，常用已知颗粒性抗原来检测未知抗体及其含量。
方法是用生理盐水将待测血清在试管中进行连续倍比稀释，然后于各管中加入等量已知抗原悬液，37℃过夜或56℃水浴2小时后，观察有无凝集并根据凝集程度，判定待检血清抗体的效价。
本法主要用于某些传染病的辅助诊断及流行病学调查，如伤寒、副伤寒及布氏杆菌病的诊断等。
2.方法
（1）取洁净小试管8只并依次排列于试管架上，用特种铅笔或记号笔按顺序注明号码。
（2）将1ml刻度吸管套上乳胶皮头，吸取生理盐水0.9ml加至1号试管，余下每管中分别加入
0.5ml生理盐水。
（3）用1ml刻度吸管取0.1ml抗伤寒杆菌“Ｈ”血清于第1管中。
（4）用1ml吸管在1号管内连续吸吹三次，使血清与生理盐水充分混匀，然后吸取0.5ml加至2号试管，随后按上法进行倍比稀释直至7号试管，最后从7号管中吸出0.5ml混合液弃去。
至此，1～7号试管的血清稀释度依次为1:
10，1:
20，1:
40，1:
80，1:
160，1:
320，1:
640，而8号管中只有0.5ml生理盐水，此管系阴性对照管（见图5-1
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