手足口标本采集技术方案.docx

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手足口标本采集技术方案

附件1

手足口病标本采集及检测技术方案

一、采集标本的种类、保存和运输

（一）粪便标本。

采集病人发病3日内的粪便标本，用于病原检测。

粪便标本采集量5-8g/份，采集后立即放入无菌采便管内，外表贴上带有唯一识别号码的标签，4℃暂存12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

（二）咽拭子标本。

采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的15ml外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

4℃暂存并在12小时内送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃冰箱。

（三）血清标本。

各省（区、市）在手足口病流行年份中均应采集EV71和CVA16感染的手足口病患儿的双份血清。

采集急性期（发病0-7d）和恢复期（发病14-30d）双份配对血清用于阐明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗体的动态变化，评价血清学抗体试剂盒的敏感性和特异性。

静脉采集3-5ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签。

将血清置于-20℃以下冰箱中冷冻保存。

（四）疱疹液。

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到病毒即可确诊该病毒为病因，可同时采集多个疱疹作为一份标本。

先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3-5ml保存液（含5%牛血清维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

所采集标本4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

（五）肛拭子标本。

采集病人发病3日内的肛拭子标本，用于病原检测。

用专用采样棉签，从患儿肛门轻轻插入，适度用力弧型左右擦拭数下，拔出后,迅速将棉签放入装有3－5ml保存液（含5%牛血清细胞维持液）的15ml外螺旋的采样管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖，并密封，以防干燥。

（六）尸检标本。

采集脑、肺和肠淋巴结等重要组织标本，每一采集部位分别使用单独的消毒器械。

每种组织应多部位取材，每部位应取2-3份约5-10g的组织，淋巴结2个，分别置于15ml-50ml无菌的有外螺旋盖的冻存管中，采样管外表贴上带有唯一识别号码的标签。

（七）脑脊液标本。

出现神经系统症状的病例，可采集脑脊液标本，进行病毒分离或核酸检测。

采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为1.0-2.0ml。

采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立即（12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于－70℃冰箱。

但EV71感染神经系统时，很难在脑脊液中检测到EV71病原。

临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融。

标本采集后要全程冷藏或冷冻保存和运输，12小时内送达实验室。

依照《人间传染的病原微生物名录》，肠道病毒或潜在含有肠道病毒的标本按B类包装，置于冷藏保存盒内运输，尽量缩短运输时间。

可采用陆路或航空等多种运输方式，但在运输过程中应采取保护措施，避免强烈震动、重力挤压等现象。

在送到省、地、市级CDC实验室时，包装盒内应带冰且包装完整。

在上送标本的同时，需附带相关的《手足口病病例临床标本采样登记表》。

二、标本采集注意事项

在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分离到病毒即可诊断该病毒为病因。

用于采集咽拭子的无菌拭子要放在标本保存液中，如含5%牛血清维持液。

用于分子生物学诊断的标本采集与病毒分离标本的采集方法一样。

为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例发病后尽早采集，尽快检测。

不能立即检测的标本应冷冻保存。

对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采集，恢复期血清在发病两周后采集。

标本保存液的配置见下表：

保存液

Eagle`s液（MEM）

80.5ml

3%L-谷氨酰胺200mM

1.0ml

胎牛血清

5.0ml

7.5%NaHCO3溶液

3.5ml

青、链霉素

（各10000U/ml）

10ml

三、实验室检测操作流程

（一）病毒分离。

1.试剂配置

（1）细胞的生长液、维持液的配制见下表：

生长液（GM）

维持液（MM）

Eagle`s液（MEM）

86.5ml

92.5ml

3%L-谷氨酰胺200mM

1.0ml

1.0ml

胎牛血清

10.0ml

2.0ml

7.5%NaHCO3溶液

2.5ml

3.5ml

青、链霉素

（各10000U/ml）

1.0ml

1.0ml

（2）粪便标本和肛拭子的处理液

完全PBS液中加入P．S溶液，终浓度为青霉素100单位/ml，链霉素为100μg/ml。

完全PBS液的配置：

取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即为完全PBS工作液。

A液：

试剂品名

加入量

NACL

8.00g

KCL

0.20g

Na2HPO4（无水）

0.91g

KH2PO4

0.12g

用600～800ml蒸馏水溶解以上盐类，加蒸馏水补至1000ml，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌，即为不完全PBS工作液（不含钙、镁离子）。

B液：

试剂品名

加入量

MgCl2.6H2O

0.10g

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

C液：

试剂品名

加入量

CaCl2

0.10g

溶解于100ml蒸馏水中，10psi（70Kpa）15分钟高压灭菌。

2．病毒分离细胞系

许多细胞系可支持人肠道病毒（如EV71、CVA16）生长。

对于检测手足口病的病原来说，建议所有怀疑含EV71、CVA16等肠道病毒感染的标本均需接种到以下两种细胞系：

ØRD细胞，来源于人横纹肌肉瘤细胞。

ØHEp-2细胞，来源于人喉癌上皮细胞。

3．标本的处理

（1）粪便标本和肛拭子的处理

操作步骤：

1）在离心管上标记标本号；

2）每管中加入10mlPBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

3）在生物安全柜中将每一份粪便标本取大约2g加入标记好的离心管中（确保离心管上的标号与原始标本的标号一致）；肛拭子为2ml；

4）剩余的原始标本最好留在原容器中，冻存于－20℃；

5）确保拧紧离心管，用机械震荡器剧烈震荡20min；

6）在确保离心机的盖子盖好和离心桶密封的情况下，用冷冻离心机在1500g条件下离心20min；

7）在生物安全柜中将每1份标本的上清液分别吸入2个有外螺旋盖的冻存管中（如果上清液不清澈，应再用氯仿处理1次）；

8）1管粪便悬液冻存于－20℃作为备份，另1管存于4-8℃以备接种。

（2）疱疹液标本的处理

疱疹液标本通常直接用于RNA提取或病毒分离。

（3）脑脊液标本的处理

脑脊液标本通常直接用于病毒分离。

（4）咽拭子标本的处理

咽拭子要在标本运输（保存）液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等，用于病毒分离时，需要冻融一次（防止多次冻融），使细胞破裂，释放病毒颗粒。

然后在4℃条件下，10000rpm离心20min，用上清接种到细胞上或直接提取RNA。

如果发现有细菌污染，须用滤器过滤除菌。

4．接种和观察（病毒分离）

（1）通常使用８ml的斜面试管培养细胞，传细胞时，每管加细胞培养液1.5ml。

显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康、无污染的。

一个健康的单层细胞会在传代后48小时左右形成；

（2）倒掉生长液（GM），换上1-1.2ml的维持液（MM）；

（3）每一份标本需要同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞，正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数）；

（4）每一种细胞至少标记一管作为阴性对照；

（5）每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度要求36℃。

（或者使用吸附的方法接种病毒：

接种标本前，倒掉生长液（GM），每支试管接种0.2ml的标本悬液，培养温度为36℃；吸附1小时后，换上1.5ml的维持液（MM）。

同样每份标本需同时接种2支RD细胞和2支HEp-2细胞。

（6）使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征性的肠道病毒致细胞病变效应（CPE）的出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等）；

（7）记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周，记录CPE（1+—4+）、提示细胞受毒性反应、老化或污染的影响而发生的变化（1+，<25%;2+,25%-50%;3+,50%-75%;4+,75%-100%）；

（8）如果有特征性的肠道病毒CPE出现，要如实记录，并观察直到75%的细胞发生变化（3+CPE），然后储藏在－20℃以备二次传代；

（9）第一代培养见可疑细胞病变时应继续传代，待细胞病变稳定出现后－20℃或－70℃冻存；

（10）一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的CPE出现，将病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。

因二代病毒滴度高于一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定；

（11）如果7d之后没有CPE出现，那么盲传1代继续观察7d。

（注意：

同一病例标本的细胞培养物不能混在一起再传代，例如：

不同细胞的培养物应单独传代）；

（12）盲传两代后，仍然没有出现CPE的，则判定为阴性；

（13）注意：

如果接种后24h内出现CPE，很可能是标本中的非特异性成分导致的毒性反应。

取100μl阳性分离物传二代，继续观察；或者在接种标本吸咐1h后用维持液清洗细胞层，可能会降低毒性反应；

（14）几个概念：

A：

毒性反应：

如果在接种后1-2d内细胞快速凋亡，这可能是由于标本中含有毒性物质而导致的非特异性毒性反应。

这些已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型细胞中（此时是第二代）。

如果又出现了毒性反应，那么应该取原始标本用PBS稀释10倍，再次接种到同种细胞中。

这时应被认为是第一代。

B：

微生物污染：

由于细菌污染而造成培养液混浊或细胞死亡经常使病毒造成的CPE无法确定或根本无法出现。

重新取原始标本，用氯仿或抗生素处理，按上述步骤重新接种到新鲜细胞上。

C：

盲传：

有时一周之后传代细胞会老化，甚至细胞对照也出现了病变。

这时已接种标本的试管应在-20℃冻存，融化后取0.2ml接种到同一类型的新鲜单层细胞中，再观察7-10d。

如果盲传两代后仍然没有产生CPE，那么认为这个标本是阴性的。

5．病毒分离结果解释

RD细胞支持HFMD的主要病原体——CVA16和EV71等多种肠道病毒的复制，CVA16和EV71均能在RD细胞培养中引起特殊的肠道病毒致细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、分散、胞浆内颗粒增加，最后细胞自管壁脱落。

但相同滴度的CVA16和EV71在RD细胞中生长的速度不同，EV71的生长速度要快于CVA16，表现为EV71感染RD细胞后出现CPE的时间比CVA16早，EV71接种细胞后出现CPE很快，但CVA16一般要经过2次以上传代才出现明显的CPE。

若在使用RD细胞分离的同时再增加HEp-2细胞，可提高肠道病毒的分离率（分离出其他可能致HFMD的病原体，如一些柯萨奇B组病毒）。

但CVA16和EV71在HEp-2细胞中均不繁殖。

（二）测定人双份血清标本的中和抗体滴度。

比较患者急性期血清与恢复期血清中和抗体滴度，可作为肠道病毒感染的血清学诊断方法，最常用的是中和实验，即用微量板法测定抗体滴度，是目前人肠道病毒抗体检测的最常用方法，该方法精确且具有型特异性。

作为肠道病毒感染的诊断方法之一，可以测定血清中肠道病毒中和抗体的滴度，通常用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度4倍或4倍以上增高证明病毒感染。

但是，肠道病毒隐性感染也很常见，所以在评估检测结果时就要小心一些。

在中和实验中，一般要用人肠道病毒参考毒株（即原型株，EV71原型株为BrCr株，CVA16原型株为G-10株）或流行株，有时同时（或单独）使用临床分离株会有助于得到更准确的检测结果。

使用对肠道病毒敏感的细胞，如RD细胞。

用病毒（血清）稀释液（下面液体配制中的C液，可用维持液代替）稀释血清和制备病毒悬液，因为是用病毒来确定血清中抗体的滴度，所以要使用参考病毒（原型株），但有时使用所分离到的毒株（临床分离株）有助于得到更准确的检测结果，但分离株的滴度（100CCID50/0.05ml）要事先测定。

中和实验的检测原理：

病毒感染敏感靶细胞后，引起细胞形态学变化，出现CPE，特异性中和抗体与病毒结合后，可使病毒颗粒失去感染性，抑制CPE的出现。

1．液体配制

A液：

血清处理液：

（100ml中含下列试剂成份）

MEM85ml

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

胎牛血清2ml

青、链霉素（各10000U/ml）10ml

B液：

细胞营养液：

（按生长液配方配制，100ml中含下列试剂成份）

MEM85ml

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

HEPES1ml

胎牛血清10ml

青、链霉素（各10000U/ml）1ml

C液：

病毒（血清）稀释液：

（按维持液配方配制，100ml中含下列液体）

MEM93ml

3%L-谷氨酰胺1ml

7.5%碳酸氢钠2ml

HEPES1ml

胎牛血清2ml

青、链霉素（各10000U/ml）1ml

2．攻击病毒CCID50滴定和滴度梯度制备

（1）将增殖后的病毒悬液冻融3次，然后在4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清液分装于10支冻存管中，每管1.5ml，一般每管应在一次试验中用完，有剩余应高压后废弃；

（2）加Eagle液10倍系列稀释为10-1至10-8病毒液，各加入细胞板内，每孔50μl，每稀释度4孔细胞；

（3）每孔加细胞悬液50μl，同时设细胞对照（50μl稀释液+50μl细胞悬液），36℃培养7d，观察细胞病变；

（4）按Behrens-Kärber公式计算出分离病毒株的CCID50；

logCCID50=L-d（S-0.5），其中：

L=实验中使用的最低稀释度的对数值；

d=稀释梯度的对数值；

S=终判时阳性部分的总和（即出现CPE的细胞孔所占的比例之和）。

（5）正式试验前应先滴定攻击病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100CCID50的病毒载量；

（6）按照计算好的稀释比例配制攻击病毒，求出试验所需的病毒总量（即100CCID50/0.05ml）；

（7）取3支小试管，每只加病毒稀释液（液体配制中的C液）0.9ml；

（8）用带滤芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已经稀释好的攻击病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小试管中，换另一支ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释至1CCID50/0.05ml和0.1CCID50/0.05ml。

3．稀释血清

（1）发病1-3d内采取患者急性期血清，发病后2-4周采取恢复期血清，分别冻存在-20℃备检。

（2）取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（上面液体配制中的A液）0.3ml，加待测血清0.1ml，盖紧塞子，震摇混匀，放4℃冰箱过夜，即为1：

4稀释血清。

次日56℃、30min灭活。

（3）打开独立无菌包装48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（上面液体配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。

使用移液器吸取处理过的血清0.1ml加入第一孔（即为1：

16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即为1：

64），依次至1：

1024，血清稀释的过程中不必更换吸尖。

即每份血清标本进行4倍倍比稀释，即1：

4、1：

16、1：

64、1：

256、1：

1024。

（4）每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。

4．病毒中和抗体测定的操作步骤：

（1）取一块96孔板横向使用，每块板可以做8份（4对）待测血清，版面设计如下图所示。

A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:

1024稀释度的待测血清0.05ml，不必更换吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:

256稀释度的待测血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:

64稀释度的待测血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:

16稀释度的待测血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:

4稀释度的待测血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）为每份待测血清对照孔，每孔中补加稀释液0.05ml；

（2）上述孔中分别加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已经稀释为100CCID50/0.05ml）；

（3）盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO2孵箱中孵育2h；

（4）另取一块96孔板纵向使用，做100CCID50/0.05ml病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。

每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的C液）0.05ml，然后从0.1CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每个稀释度8孔，不必更换吸尖，一直加至100CCID50/0.05ml；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液，然后放入4℃冰箱中暂

存；

（5）在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为2×105个/ml，每块96孔板至少需要准备10ml；

（6）孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回滴板）分别加入0.1ml细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入36℃CO2孵箱中孵育培养；

（7）使用倒置显微镜每天观察CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价。

当100CCID50/0.05ml的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（约5~7d）；

（8）注意：

如果病毒对照结果（病毒回滴）不在32~320CCID50/0.05ml的范围内，实验无效，就要重复实验。

5．结果判定

当最高稀释度血清的2孔中有1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的倒数计即为该血清标本的中和抗体效价；当高稀释度2孔完全病变，相邻低稀释度2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价；当两个相邻稀释度血清均出现1孔细胞病变，另1孔不出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体效价。

对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CVA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1:

256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1:

128判定为可疑阳性。

（三）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）。

1．RNA提取

可使用多种商业化试剂盒来提取RNA，针对临床标本应选择质量较高的“用于临床标本病毒RNA提取的试剂盒”，也可使用全自动RNA提取仪进行提取。

针对病毒分离物，核酸提取比较容易，大部分商业化RNA提取试剂盒都可有效的提取到RNA。

RNA提取依据使用的试剂不同，严格按说明书进行操作。

2．逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）

（1）引物序列合成

国家脊灰实验室自行设计3对引物，分别为人肠道病毒通用引物、EV71特异性引物和CVA16特异性引物。

各省CDC依据引物序列在质量有保证的公司合成,引物合成后,需要做预实验，保证引物合成没有质量问题后,分发给地市级CDC。

1）人肠道病毒（包括EV71、CVA16）核酸检测通用引物序列：

PE2（上游）：

5`-TCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCC-3`

PE1（下游）：

5`-ACACGGACACCCAAAGTAGTCGGTCC-3`

2）EV71核酸检测引物序列：

EV71-S（上游）：

5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`

EV71-A（下游）：

5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`

3）CVA16核酸检测引物序列：

CVA16-S（上游）：

5`-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3`

CVA16-A（下游）；5`-TCAGTGTTGGCAGCTGTAGG-3`

（2）实验设计

1）在PCR记录纸（实验记录纸）上记录本次实验操作者姓名，实验日期，所鉴定标本的名称以及标本的顺序，与PCR仪排列的顺序一致。

2）标记好加标本和对照的PCR管（阳性对照，阴性对照和试剂对照）。

A：

阳性对照：

参比RNA，省级CDC提供（只是在初次使用，常规不建议使用，以防污染）。

B：

阴性对照：

使用正常细胞RNA或临床标本肠道病毒阴性的RNA（每次实验要设立）。

C：

试剂对照：

用去离子水代替标本（试剂初次使用时必须做）。

（3）RT-PCR扩增反应和条件

1）从临床标本或病毒中提取的RNA和各种RT-PCR试剂应该一直放在冰浴盒上；

2）配下列试剂主溶液：

10×PCRBuffer···································································5.0μl

dNTPs（2.5mMeach）·······················································2.0μl

上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

RNA酶抑制剂（RNasin,40U/μl）······································0.5μl

TaqDNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl

AMV逆转录酶（10U/μl）··················································1.0μl

模板RNA·······························