DNA甲基化在癌症中的研究进展.docx

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DNA甲基化在癌症中的研究进展

DNA甲基化在癌症中的研究进展

摘要

　DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,调节着机体许多生物学过程。

DNA甲基化由DNA甲基转移酶催化,在多种调节因子的参与下,与组蛋白修饰相互作用,抑制基因转录,导致基因沉默。

探讨DNA甲基化与基因转录抑制之间的关系,对许多人类疾病的研究具有重要意义。

越来越多的实验表明，在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的混乱，包括基因组总体甲基化水平过低和某些基因启动子区域甲基化过高。

DNA甲基化异常可通过影响染色质结构以及癌基因和抑癌基因表达而参与肿瘤的形成。

现已在肿瘤的细胞周期调节基因、DNA错配修复基因、肿瘤抑制基因等多种基因中发现甲基化现象。

关键词：

DNA甲基化肿瘤基因表达

ABSTRACT

DNAmethylationisanimportantepigeneticmodificationwhichregulatesanumberofbiologicalprocesses.DNAmethylationcatalyzedbyDNAmethyltransferasesinteractswithhistonemodificationtoinhibitgenetranscription,inducegenesilencingattheparticipationofmanyregulators.DiscussingtherelationsofDNAmethylationandgenetranscriptionalsilencingtakesonimportantsignificancesforthestudyofmanyhumandiseases.MoreandmoreexperimentshaveindicatedthatthereisconfusioninthelevelandpatternofDNAmethylationduringthecarcinogenesisanddevelopmentoftumor，whichincludesthelowlevelofmethylationinwhole-genomeandthehighlevelofmethylationinthepromoterregion.TheDNAmethylationmaycontributetothegenesisoftumorbyaffectingthestructureofchromatinandtheexpressionofoncogenesortumorsuppressorgenes.IthasbeendiscoveredthatDNAmethylationexistsinthecellcycleregulatinggenes,theDNAmismatchrepairgenes,thetumorsuppressorgenesandsoon.

Keywords:

DNAmethylationtumorgeneexpression

一前言

DNA的甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DNMT）催化下,以S2腺苷甲硫氨酸为甲基供体,将甲基转移到基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位上,形成52甲基胞嘧啶（52methylcytosine,m5C）。

DNA的甲基化修饰是真核生物基因表达调控的重要方式,其生物学效应是使基因长期处于沉默状态。

一般来说,DNA甲基化关闭基因的活性,而去甲基化则可激活基因的表达。

DNA甲基化修饰具有可遗传性,能够对发育、生理、环境、病理等不同的信号作出反应,使遗传信息的表达按一定的程序发生变化,参与完成细胞的时序调控和适应调控。

因此,DNA甲基化已成为表观遗传学研究的重要内容之一,也是肿瘤发病机理及肿瘤表观遗传治疗关注的热点。

二本论

2.1DNA甲基化与肿瘤的发生

　肿瘤细胞中存在DNA甲基化水平和模式的混乱,这种甲基化异常,与肿瘤的发生发展密切相关。

首先,肿瘤细胞整个基因组存在着普遍低甲基化,这在肿瘤发早期是至关重要的,因为散在CpG甲基化的丢失,使染色体容易发生断裂、异位,甚至丢失,从而影响染色体稳定性,增加癌变机率。

其次,肿瘤相关癌基因启动子区的特定位点低甲基化,这与基因激活、转录密切相关。

DNA低甲基化是一种基因表达的开放结构,有利于基因高表达,这也是癌基因转化细胞的必要条件。

原癌基因甲基化程度越低的肿瘤,表现出更强的恶性侵袭能力。

与癌基因的低甲基化相反,肿瘤基因组中抑癌基因和一些生长调节基因启动子区CpG岛为高甲基化状态,其表达亦关闭[4]。

这将导致相关基因的沉默,从而直接参与、影响或调控肿瘤的生、发展过程。

在近20%的不同肿瘤中发现p16的5’CpG岛的新甲基化,但正常组织无此现象,显示甲基化是人类肿瘤细胞中抑癌基因失活通常的途径。

DNA甲基化异常的最终结果是影响基因组的稳定性和细胞增殖分化相关基因的正常表达,造成细胞失去对正常过程的控制,从而促进肿瘤的生成和发展。

2.2DNA甲基化在肝细胞癌（HCC）中的研究现状

　国内外学者对HCC中抑癌基因的甲基化状况进行了大量的实验研究,发现多基因的启动子甲基化是HCC发生中的1种早期、普遍的事件。

在HCC中发现越来越多的基因发生了不同频率的高甲基化。

这些基因涉及肿瘤形成的多条分子途径:

①细胞周期调节相关基因如p16INK4a、p14ARF、CASP8、TMS1/ASC等。

②细胞转移和黏附相关基因如CDH（E2cadherin、M2cadherin、H2cadherin）、TIMP23、TFPI22。

③DNA修复基因如hM2LH1、hMSH2、hMSH3、MGMT。

④其他如FHIT、GSTP1、SOCS、RASSF1A等。

基因组广泛低甲基化主要涉及重复序列、癌基因和转移相关基因。

Tao等在二氯乙酸及三氯乙酸诱发的大鼠肝癌中发现c2jun、c2myc、IGF2Ⅱ基因呈低甲基化状态且过表达。

Takai等在小鼠及人肝癌组织中发现LINE21重复序列区明显低甲基化,可导致反转位的发生及基因组的不稳定[5]。

有学者报道在人HCC组织中DNA甲基化水平明显降低,低甲基化增加基因组的不稳定性,而且基因组的低甲基化不仅仅是HCC发生前期和发生早期的历史事件,而是贯穿于肿瘤发生发展的整个过程。

2.3.1DNA异常甲基化与卵巢肿瘤的发生发展

基因组范围低甲基化可促进卵巢肿瘤的发生,其方式之一是卫星DNA的低甲基化。

着丝粒附近卫星DNA低甲基化可导致染色体结构和数量异常。

Qu等研究了不同恶性程度卵巢肿瘤卫星2DNA的甲基化情况,发现1号和16染色体卫星2DNA低甲基化程度不但与全基因组低甲基化相关,而且与卵巢肿瘤的恶性程度相关。

癌基因的低甲基化可导致癌基因的开放表达[1]。

近年来对DNA高甲基化导致的抑癌基因表达下调或失活与卵巢肿瘤的关系已进行了大量研究。

McCluskey等用甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR,MSP）检测了不同上皮性卵巢肿瘤中p16基因的甲基化情况,并用免疫组化法检测了p16蛋白的表达情况,结果显示,p16基因异常高甲基化与p16蛋白表达下调及失活相关,并且在低度潜在恶性卵巢肿瘤中,p16基因甲基化改变是其基因沉默的最重要机制。

2.3.2　DNA异常甲基化与卵巢肿瘤的诊断

DNA异常甲基化在卵巢肿瘤早期即可出现。

许多研究发现DNMT在多种肿瘤的早期表达明显增高,其发生往往先于甲基化模式异常,因而是早期肿瘤细胞的特征性分子改变。

陈春玲等检测了55例卵巢癌和20例正常组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表达情况,发现DNMT3a在正常卵巢及癌变组织中表达无明显差异,而DNMT1和DNMT3b在卵巢癌早期表达明显增高。

Wilcox等和Choi等对卵巢肿瘤RASSFIA和BRCA1基因甲基化的研究表明,这些基因的异常甲基化是卵巢肿瘤的早期事件,有望成为卵巢肿瘤早期诊断的标志。

多基因的甲基化检测可提高卵巢肿瘤早期实验室诊断特异性和敏感性。

DNA异常甲基化在肿瘤早期即可在血清、血浆、尿液及肿瘤组织等不同临床样本中检测出来。

异常甲基化可以作为区分肿瘤良恶性的标记物。

Henrique等的研究发现,前列腺癌患者GSTP1甲基化是肿瘤早期最常见的改变,定量检测该基因的甲基化水平,可区分肿瘤的良恶性。

用甲基化改变来区分卵巢肿瘤的良恶性尚未见报道但已有研究发现良性卵巢肿瘤和恶性卵巢肿瘤基因的甲基化水平具有显著差异。

　细胞周期调控相关基因、凋亡相关基因、介导细胞间连接的基因等特殊基因的DNA异常甲基化与肿瘤的发展及转移相关,这些基因的甲基化水平改变可反映病情的进展,作为肿瘤预后评估的指标。

Jones[10]等研究了不同类型BRCA1与卵巢肿瘤预后的关系,在63名晚期卵巢癌患者中,BRCA1异常甲基化有11例,突变型BRCA122例,野生型BRCA130例,结果显示异常甲基化患者的无瘤生存率及总生存率明显低于突变型患者,而这两类患者的生存率又明显低于野生型患者。

2.3.2去甲基化治疗与卵巢肿瘤

由于基因的异常甲基化可通过药物使逆转,深入地研究基因的甲基化可能为肿瘤的防治提供一条新的思路。

目前广泛使用的去甲基化药物为针对DNA甲基转移酶（DNMT）的抑制因子,已用于临床的药物主要为52氮222脱氧胞苷、52氮2胞苷等。

这些药物属核苷衍生物,仅在细胞周期的S期具有活性,通过竞争性的结合DNMT发挥去甲基化作用。

近年来研究发现了多种新型酶抑制剂,如普鲁卡因胺、多酚2表没食子2儿茶酚232没食子盐（EGCG）、RG108、MG98等,属非核苷类DNMT抑制剂,通过直接抑制DNMT的活性发挥作用。

2.4子宫内膜癌中DNA甲基化的研究

目前研究发现的与子宫内膜癌发生发展相关的过甲基化基因包括：

细胞周期调节基因、DNA错配修复（mismatchrepair，MMR）基因、肿瘤抑制基因、抑制肿瘤转移和浸润的基因、血管形成抑制基因等。

p16INK4A基因是一种重要的细胞周期负调控基因。

其抑制细胞增殖，被认为是重要的抑癌基因。

在大多数肿瘤中p16INK4A基因失活，失活机制有缺失突变和启动子甲基化等。

p16INK4A表达产物P16蛋白是近年发现的重要的多重抑癌蛋白，参与细胞周期的调控，控制细胞的生长和分化，是细胞周期依赖性激酶CDK4和CDK6的抑制剂，P16蛋白与细胞周期蛋白D（CyclinD）竞争结合CDK4和CDK6，抑制CDK4和CDK6活性，使肿瘤细胞周期调节中抑癌基因Rb的表达产物（PRb）不能磷酸化而保持活化状态，抑制转录因子EF解离，使细胞周期进展最关键的G1/S转换停滞，对细胞周期起负调控作用。

目前已在多种肿瘤中发现，5′CpG岛异常甲基化是p16抑癌基因灭活的主要机制。

甲基化的p16失去功能，结果癌细胞不断地增殖并逃避正常的衰老凋亡机制。

2.4.2DNAMMR基因

DNAMMR系统是近年来在遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）综合征中分离出来的一组遗传易感基因，是人体细胞的一种能修复DNA碱基错配的安全保障体系，对维持基因的稳定性有重要作用。

目前人类的MMR系统中参与MMR功能的基因有6个，分别为hMSH2，hMSH6（GTBP），hMSH3，hMLH1，hPMS1和hPMS2，这些基因负责识别和修复DNA在复制过程中出现的基因缺失、插入及点突变等错误。

MMR基因的缺陷使细胞在增殖过程中错误掺入与缺失不能修复，表现广泛的MSI，整个基因组不稳定，随机突变率增高，导致一系列靶基因如涉及细胞生长、分化、凋亡及癌转移等的相关基因的改变，从而导致癌的发生或肿瘤的转移。

2.4.3抑癌基因

第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen，PTEN）PTEN是近年发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，又称MMACI基因。

其定位于染色体10q23，由9个外显子组成，编码450个氨基酸组成的蛋白质，相对分子质量为5000～50000，主要是通过脂质磷酸酶活性即PIP3脱磷酸，降低细胞内的3，4，5-三磷酸磷脂酰肌（PIP3）水平，阻断蛋白激酶B（PKB/Akt）途径，使细胞周期阻断在G1期或促使细胞凋亡，对细胞的生长起负调节作用。

RASSF1A是一种已在多个肿瘤中证实发生甲基化的肿瘤抑制基因。

Harry[7]等报道70例患者中有36例发现RASSF1A甲基化，且晚期淋巴转移的病例中更频发，甲基化及无甲基化的患者5年生存率分别为77.8%和97%，提示RASSF1A甲基化可作为提示肿瘤侵袭性的有力指标。

CDH13是一独特的钙粘蛋白。

近年研究表明，CDH13是一个抑癌基因，此外，其在细胞黏附、信号转导及细胞生长调节等方面也发挥着重要作用。

CDH13表达的沉默可由其基因5′启动子区的异常甲基化或等位基因的缺失与异常甲基化的联合作用导致。

RUNX3基因是近年来发现的一个新型抑癌基因,其启动子区域CpG岛的甲基化是导致基因失活的主要机制。

Yoshizaki等分析肿瘤抑制基因RUNX3，发现21例子宫内膜癌中18例（86%）其启动子超甲基化，9例正常子宫内膜中只有2例（22%）（P＜0.01），认为RUNX3失活可能在子宫内膜癌发生过程中起重要作用。

DNA甲基化研究将广泛应用于子宫内膜癌的分类、早期发现、治疗以及预测肿瘤转移复发等。

全面了解子宫内膜癌及其癌前病变的甲基化状态，分析DNA甲基化的建立和维持机制有赖于更进一步的研究。

2.5胃癌中Runx3基因甲基化表达

胃癌是世界范围内发病率仅次于肺癌的恶性肿瘤,在我国胃癌是发病率和死亡率很高的恶性肿瘤之一。

通过研究表明,胃癌是一类多基因疾病,其发病分子机制是由于端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引发的多因素、多阶段及多基因变异综合病变过程。

尽管癌基因的活化是促使肿瘤发生的关键因素之一,但抑癌基因的失活在胃癌的发生、发展过程中可能起到更加常见、更加重要的作用。

Runx基因（runt2relatedtranscriptionfactorgene）是近年来发现的一种新型抑癌基因,与人类多种肿瘤的发生、发展有着极其密切的关系,受到国内外学者的广泛关注。

Runx家族基因的产物分别具有不同的生物学功能,其中Runx3对脊神经节的神经发育及胃粘膜上皮细胞的增生有调节作用,在胃癌中Runx3基因对癌细胞的生长有明显的抑制作用。

Runx3基因在胃癌中主要以基因纯合或杂合缺失以及启动子区域过度甲基化方式失活,其中基因甲基化是表达下调的重要机制。

Waki[8]等研究10个胃癌细胞系,有7010%（7/10）细胞系被检测Runx3基因甲基化,而通过胃癌患者手术标本研究显示,45%肿瘤组织（42/93）和8%（7/93）癌旁正常组织发生了Runx3基因甲基化。

本文采用MSP方法检测了9个胃癌细胞系,发现有7718%（7/9）细胞系被检测到Runx3基因过度甲基化;在35例胃癌患者手术切除标本胃癌组织及其癌旁组织Runx3基因甲基化与报道的研究结果相似。

长江大学医学院何小兵[3]等利用RT2PCR方法显示在9个胃癌细胞系中,2个Runx3基因启动子区域未过度甲基化的细胞系存在Runx3基因表达,其结果与MSP结果相符。

在胃癌组织中Runx3基因的表达量明显低于癌旁正常组织,Runx3基因在伴有淋巴结转移组及低分化组中的表达明显低于未转移组和高分化组。

本研究通过对胃癌细胞系及癌组织中Runx3基因甲基化与表达情况研究,推断Runx3基因启动子区域的过度甲基化可能是导致该基因转录失活及其表达下调的主要原因,从而与胃癌的发生发展密切相关。

因DNA甲基化在肿瘤的形成中普遍存在,DNA甲基化改变是一种可逆的表观遗传修饰,因此,DNA甲基化转移酶（DNMT）成为目前DNA去甲基化恢复抑癌基因功能的热点靶分子,通过DNMT抑制剂,可以使肿瘤中许多过甲基化的基因被重新激活。

这提示我们在胃癌中可以Runx3基因为治疗靶点,用DNMT抑制剂,如52aza22’2deoxycytidine（decitabine）、Fazarabine、zebularine等诱导沉默的Runx3基因重新表达的方法对胃癌进行基因治疗。

2.6喉癌与Runx3基因启动子甲基化及其蛋白表达的关系

　Runx3基因是LevanonD.等于1994年发现的,最初被命名为急性髓性白血病2基因,以后又被称作多瘤病毒强化因子结合蛋白2基因、核心结合因子3基因,因其在小鼠胚胎发育过程及人类多种恶性肿瘤的发生、发展中起重要作用而倍受关注。

Runx3基因家族由Runx1、Runx2和Runx33个成员组成,其家族成员均含123个氨基酸的RuntDomain（RD区域）,Runx3定位于人染色体1号短臂1p36.1上,含有P1和P22个启动子,6个外显子和1290bp的开放阅读框,总长约67kb,它含有2个高度保守的CpG岛,其中一个富含GC启动子的特征CpG岛较大,位于Runx3基因启动子P2周围,控制Runx3基因转录。

Runx3基因则作为一种肿瘤抑制基因,与多种肿瘤的发生、发展相关,包括胃癌、婴儿生殖细胞肿瘤、肺癌、胰腺癌等。

南昌大学肖栋[6]等人研究表明,喉癌中Runx3蛋白的表达率明显低于癌旁正常黏膜组织（P<0.05）,癌旁正常黏膜组织中无Runx3基因启动子甲基化,而在喉癌组织中有58.2%检测到甲基化存在（P<0.05）,这与KimT.Y.等的研究结果接近。

Runx3基因启动子甲基化阳性大多伴随Runx3蛋白阴性,两者呈明显的负相关（r=-0.7093,P<0.01）,因此Runx3基因启动子区域的高甲基化（CpG岛甲基化）可能是导致基因转录失活及其表达下调的主要原因。

Runx3基因启动子区域高甲基化导致了其在喉癌组织中表达明显下调,并且与喉癌的发生密切相关,而与性别、临床分型、病理分级、有无淋巴结转移均无关（均P>0.05）。

Runx3基因作为一种新近发现的肿瘤抑制基因,其能调控细胞的生长、发育和凋亡,对细胞的信号转导和其他生物学效应有着重要而复杂的转录调控作用。

关于其失活机制、抑癌机制及其与肿瘤关系的研究正在不断深入,Runx3基因可能有望成为肿瘤诊断标志物和基因治疗的靶点。

2.7　DNA甲基化检测方法新进展

　随着对甲基化与肿瘤发生发展的深入研究,目前特异位点甲基化的检测方法已有很大进展。

现在大规模分析多重CpG岛的方法包括:

限制性基因组扫描、特定的甲基化杂交、甲基化特定的寡核苷酸微阵列等,但在处理临床样本时尚存在一些实际问题,如由于在甲基化和非甲基化等位基因中杂交效率的不同降低了探针的分辨能力,而且这些检测方法有损于先进的芯片学和生物信息学技术,使其应用受到限制。

以下是常用的甲基化检测方法[9]。

2.7.1　MSP　

它是先将DNA用重亚硫酸盐处理,使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,然后进行PCR扩增。

该法的优点是:

快速,敏感性高,可以检测1/1000的等位基因发生甲基化的肿瘤细胞,可用于超微量分析及同源分析,特异性接近100%,而且可用于石蜡包埋样品的分析。

缺点是①引物设计要求高,可靠的MSP引物设计需包含两个或多个完全甲基化或非甲基化的CpG位点;②只能做定性研究,不能作为定量检测;③存在重亚硫酸处理不完全导致的假阳性。

2.7.2　结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法（COBRA）

以重亚硫酸盐处理的DNA为基础进行PCR扩增,处理后原甲基化的胞嘧啶被保留,非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶。

然后利用限制性内切酶BstUI对PCR产物进行切割,以识别DNA甲基化的状况。

该方法的优点是:

①不需要预先知道CpG位点及样本序列;②可进行甲基化水平的定量研究;③需要样本量少,可进行石蜡包埋样本的分析。

缺点是只能获得特殊酶切位点的甲基化情况,检测阴性不能排除样本DNA中甲基化存在的可能。

2.7.3　甲基化敏感性斑点分析（MS2DBA）　

先用重亚硫酸盐处理标本DNA片段,然后以非CG区的引物进行PCR扩增。

将扩增产物转移到尼龙膜上,用3′端的DIG标记的含有2个CG或TG的双核苷酸探针与DNA杂交,然后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应,通过比较斑点上荧光的强度进行甲基化的定量。

该方法简便易行,但检测序列不能过长。

若重亚硫酸盐处理不完全或探针错误杂交,可能出现假阳性或假阴性的结果。

2.7.4　甲基化特异性多连接依赖性探针扩增（MS2MLPA）法　

用MS2MLPA探针与标本DNA进行杂交形成DNA2探针复合物,然后加入连接酶及甲基化敏感的限制性内切酶,如果DNA中被识别的CpG位点存在甲基化,则探针顺利连接,PCR照常进行;若为非甲基化,则两个寡核苷酸链不能连接,复合物将消化而不能扩增。

其优点是①需要的样本数量少,只需微量的DNA标本就可以检测多个基因的甲基化水平,且可用于石蜡包埋样本的检测;②实验方法简单,可以批量检测;③可以用于定量检测。

缺点是探针连接位点受限制性内切酶识识别位点的限制,且要考虑所用酶的适宜反应温度。

三结论

近几年，表观遗传学在很多学科领域中的研究和应用均被视为前沿和热点，不可否认，其在医学方面的研究成果确实帮助解决了部分重大的医学难题，随着肿瘤、自身免疫性疾病和异常的DNA甲基化修饰之间的相关性被揭示，基因的高甲基化有望成为治疗这些疾病的理想靶点，这也为疾病的早期诊断、预后判断和干预治疗提供了新的思路。

例如，阿扎胞苷（Azacitidine）作为美国食品药物管理局（FDA）批准的第一个用于支持治疗骨髓增生异常综合征的DNA甲基化抑制剂，已经进入了各种骨髓增生异常综合征亚型的Ⅲ期临床试验。

特异基因甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗的靶点和判断预后手段，这对临床肿瘤的诊治具有重要的意义[2]。

与基因突变不同，肿瘤发生中DNA甲基化等表观遗传学事件的发生是可逆转的。

因此，在肿瘤和癌前病变中通过去甲基化处理可以恢复某些关键性抑癌基因的功能而起到预防和治疗肿瘤的作用。

由甲基化引起基因沉默而出现的肿瘤，可通过DNA甲基转移酶非竞争性或竞争性抑制剂抑制甲基化的发生，活化沉默的抑癌基因，从而达到治疗肿瘤的目的。

参考文献:

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[2]姜绮霞.DNA甲基化与心血管疾病.生命的化学.2009,29

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[3]何小兵.胃癌中Runx3基因甲基化表达及临床研究.长江大学学报.2009.6,6

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[4]颜斌.DNA甲基化与基因转录抑制.国际病理科学与临床杂志.2006.12,26（6）.

[5]纪宗淑.DNA甲基化在肝细胞癌中的研究进展.实用癌症杂志.2009.7,24（4）:

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[6]肖栋.