1000吨年苏云金芽孢杆菌厂生产工艺初步设计.docx

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1000吨年苏云金芽孢杆菌厂生产工艺初步设计

年产1000吨苏云金芽孢杆菌的发酵车间工艺设计

包文雨

（辽宁石油化工大学，石油化工学院，生物工程1102，辽宁营口，1132050215）

摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）于1901年在日本被发现，1911年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名.苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体蛋白对敏感昆虫有特异性的防治作用。

本设计首先初步介绍了苏云金芽孢杆菌的发展过程，然后就其产品化进行了讨论，苏云金芽孢杆菌的发酵共有两种工艺路线，即液体深层发酵和固态发酵。

它们都有其优缺点，但是经过对比论证，最终选择了液体深层发酵。

随后根据相关资料确定了苏云金芽孢杆菌的生产周期及期产量，依照期产量对其进行了物料衡算和热量衡算，最后对设备进行了合理的选型。

关键词：

苏云金芽孢杆菌；产品化；工艺路线；设备选型

1000tonsofBacillusthuringiensisfermentationprocessdesignworkshop

BaoWenyu

（Class1102,DepartmentofBiologicalEngineering,SchoolofEnvironmentalandBiologicalEngineering,LiaoningShihuaUniversity,LiaoningYingkou,1132050215,China）

Abstract

Bacillusthuringiensis（Bacillusthuringiensis）in1901,wasdiscoveredinJapanin1911bytheBerlinerfromtheMediterraneanflourmothlarvaeintheprevalenceofisolatedandfoundlocationsinGermanyaccordingtotheirprovinceandnamedBacillusthuringiensis.thuringiensisCalledBacillusthuringiensis,isendogenousGram-positiveBacillussoilbacteria,initiallyformedinthesporeformationofinsecticidalcrystalprotein（insecticidalcrystalprotein）,insectshavespecificsensitiverats.

ThepreliminarydesignofthefirstBacillusthuringiensisintroducedthedevelopmentprocess,andthenconductedadiscussionofitsproducts,thefermentationofBacillusthuringiensisTherearetwoprocessroutes,thatis,submergedfermentationandsolid-statefermentation.Theyallhavetheiradvantagesanddisadvantages,butaftercomparisonargument,Ifinallychosethesubmergedfermentation.ThendeterminedaccordingtotherelevantinformationofBacillusthuringiensisandproductioncycleofproduction,productionwascarriedoutinaccordanceofthematerialbalanceandheatbalance,thelastoftheequipmentforareasonableselection

Keywords:

Bacillusthuringiensis;productof;processroutes;equipmentselection

附录一生产原料35

第1章绪论

1.1项目背景

我国研究和应用苏云金杆菌起于1959年，于1965年在长沙和武汉进行了工业化生产，也就是工业生产初级阶段，到70年代工业产品每年1000t左右，1974年湖北宜昌地区，飞机防治松毛虫的面积达82.5万亩，取得了满意的效果。

1990年，我国苏云金制剂[1]的产量超过1500t，1994年，我国大田使用Bt杀虫剂达一万多吨，为1984年的100倍，在工业生产规模上得到了空前的发展。

我国在1995年国家高技术发展计划中，把构建一批杀虫Bt的工程菌列入了农业重组微生物重点项目，中国农业科学院植保所，华中农业大学以及中山大学等均进行了构建Bt工程菌的尝试，并取得了显著的成果。

发酵技术日趋成熟。

以液体深层发酵为代表的发酵技术应用于工业生产中，发酵水平及吨位逐步提高，由60年代的几百升，70年代的几吨，发展到目前的50吨以上。

随着离心喷雾，气流粉碎等技术生产工艺应用，代替了原来的压滤浓缩，烘干及粉碎等生产工艺，从而使剂型改变了过去以粉剂为主的状况，油剂，片剂，微囊剂等剂型的出现，使Bt的施用更具有针对性

1.2苏云金芽孢杆菌介绍

1.2.1苏云金芽孢杆菌定义

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）于1901年在日本被发现，1911年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名.苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体[2]蛋白（insecticidalcrystalprotein），对敏感昆虫有特异性的防治作用.1956年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养苏云金杆菌并用于防治菜青虫的报道，从而揭开了苏云金杆菌大规模培养的序幕.中国从上世纪60年代也同苏云金杆菌有关的研究，特别是有关分子生物学方面的研究正在持续展开，开始了规模化生产.但在发酵工艺方面还需进一步加强.随着人们的环保意识不断增强，生物农药正在引起越来越多的关注.苏云金杆菌制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在生物杀虫剂市场中所占份额也日益增加。

1.2.2苏云金芽孢杆菌资源

全世界被保藏的Bt估计有60000株,它广泛分布于世界各地,从热带雨林到北极冻土带。

已经从许多材料上分离获得该菌,如土壤、植物叶片、鲜水、粪便、动物活体、食物、仓储等,可见几乎无处不在。

土壤是微生物的大本营,Bt也是一种土壤习居菌。

Martin和Travers从土壤中找到新的Bt菌种,这一事实改变了Bt菌的历史。

因为起初科学家们认为,只有找到死昆虫才能找到这些细菌。

本来以为它是一种昆虫病,但实践证明,Bt实际上是多种土壤中的正常组份。

Martin和Travels发明的新技术,仅花了2年时间又鉴定出72个菌种,而大家熟知的24个菌种却花了85年时间才被发现事实上,在海拔近6.5km的高处几乎没有昆虫生存,而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的Bt菌种。

因此,“不管是取自喜马拉雅山的土壤,或汽车轮胎上的冰岛土壤,甚至猫脚底下的土壤,都可能使某种害虫致死”。

在世界范围内,平均有70.4%的Bt菌株来自土壤,其中美国土壤分离株占总菌株的59.9%,Delucca等1981发现美国土壤样本中芽孢杆菌的0.5%～0.005%是Bt。

欧洲占83.9%,新西兰占55.6%,东亚占94.3%,日本占36.8%,韩国占51%,越南占64.3%。

我国也有多家单位进行Bt资源的收集如中国林业科学院的戴莲韵、王学聘等,华中农业大学喻子牛、戴金元、李建洪,湖北农业科学院杨自文、陈在佴,中国科学院武汉病毒所李荣森、高梅影等,南开大学任改新、陈月华等,河北农业科学院冯书亮,连云港教育学院姚江,中国农业科学院黄大等,中山大学庞义,福建农林大学关雄、张灵玲等,获得了许多Bt菌株,如华中亚种,山东亚种,中华亚种,云南亚种等,但至今还没有详细地统计出具体数据。

20世纪90年代起,人们把寻找Bt的目光转到植物上。

1991年Smith和Couche从不同针叶树和落叶树叶片分离到Bt菌株,人们发现Bt实际上也广泛存在于植物叶片,1996年Ohba从25棵桑树1004片桑叶中分离出186个Bt菌落,其中棵桑树96%,112片桑叶11.2%均分离到Bt;Damgaard等从卷心菜叶、牧草和与卷心菜有关的昆虫上均分离获得Bt;Normander等第一次进行了豌豆叶面细菌的分布;Rizali等从印尼桑叶上分离了2株Bt菌株;Mizuki等从日本35种木本和草本植物分离出120株Bt菌株;Kaelin和Gadani用2年的时间1996—1997年调查了18个国家Bt在卷烟叶上的出现频率和分布情况;Maduell等从哥伦比亚安第斯山脉海拔1800～2500m之间3个高度采集胡椒科属13个种的35个叶片样本中分离出266株Bt,并进行了菌株伴孢晶体形态学的研究;张灵玲等也从2个科植物叶片中分离到54株Bt菌株,还首次从苔藓上分离获得杀虫新菌株。

1.2.3苏云金芽孢杆菌鉴定与分类

Bt属芽孢菌,能产生晶体是它区别于其他芽孢杆菌的标志。

Bt传统分类与其他芽孢杆菌一样也是根据细胞学、培养特性、生化反应以及遗传学特性。

血清学分类是该菌长期应用的一个最实用的指标,目前有70个血清型和84个亚种,所有血清亚种均可从法国巴黎的巴斯德研究所索取获得但其存在的缺点是无法反映致病性和寄主范围,因而还是有一定的局限性。

20世纪90年代后,PC等分子生物学的方法和技术广泛用于该菌的基因鉴定。

Bc类生物除自身外,还包括昆虫病原菌Bt,人类病原菌炭疽芽孢杆菌Bacillusanthracis,Ba以（及假根状的覃状芽孢杆菌Bacillusmycoides,）Bm。

近来，B.pseudomycoides和B.weihens2tephanensis也收入其中。

表型特征和有机物利用都无法区别Bt和Bc,如细胞脂肪酸含量、糖含量、多位点酶电泳、肠毒素[3]、噬菌体定型技术。

DNA同源分析如核糖体、16SrDNA序列、16S223S转录间隔区序列、基于Bc毒素产物的PCR和脉冲胶都无法区别Bt和Bc。

1992年Brousseau等用随机扩增指纹技术区别Bt和Bc,1997年Giffel等只发现少量Bt和Bc的16SrDNA序列有差异,1998年Beat2tie等采用傅里叶变换红外光谱技术区分Bc种类,总之,Bt和Bc是很难区分的。

随着2004年4月美国Bt全序列的公布,通过染色体结构比较基因组学和功能基因组学的研究,一定能更清楚地了解Bt和Bc的功能和区别。

1.2.4苏云锦芽孢杆菌生态学及安全性

Bt在自然界中的作用和循环至今不是很清楚。

有些假设认为它是植物共生或互利以保护植物不受食草动物的危害。

有些植物化学物质能钝化Bt,Luthy证明棉花叶片的提取液会使ICP失效。

在20℃情况下,Btk可在鲜水中存活70d,在海水中存活40d。

它在湖水中存活时间比自来水长得多,因为前者富含营养。

国内外大量试验表明,一般应用Bt还是安全的。

但是有点必须给予关注。

一是有些菌株含β有-外毒素,它对哺乳动物等有毒,欧美国家禁β止使用。

有些国家采用含-外毒素的Bt产品防治家蝇,但许多机构则禁止使用。

第二个问题也是争论比较多的是Bt如何与Bc分清楚。

因为后者会导致人的呕吐和腹泻。

二者都含有肠毒素基因,只不过根据研究,Bt的基因表达量很低而已。

丹麦市场的50%生物农药是Bt产品。

2005年,丹麦学者Rosenquist等从零售商场48901份样本中发现有0.5%的样本含有Bc类细菌,总量达10cfu/以上。

含淀粉及熟食类样品最多,新鲜黄瓜和番茄亦有发现。

随机选择40个菌株,发现至少包括一种致腹泻的基因或成分,而只在1株Bc中发现催吐毒素。

而在随机选择的40个Bc类菌株中,有31株是Bt。

因此,食品中大量的Bc类细菌可能应属Bt。

国际化学联合会IUPAC颁布了Bt发酵产品的国际标准Quinlan,1990。

它包括了产品中其他微生物及其代谢产物的污染。

各种微生物及其最大浓度的量是:

嗜温性微生物<1×10CFU/g,酵母和霉菌<100CFU/g,大肠杆菌类5<10CFU/g,金黄色葡萄球菌<1CFU/g,沙门氏菌<1CFU/10g,兰斯斐尔德氏链球菌D组<1×10CFU/g。

1.2.5苏云金芽孢杆菌产品化

国内外至少有100多种Bt产品,在世界范围内防治农业、林业和卫生等害虫广泛应用,Bt制剂占微生物4农药的90%以上。

Bt生产主要是液体深层发酵。

生产工艺主要牵涉到菌种，培养基和培养条件,后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。

许多科学家尝试进行菌种选育和改良,经过国内外10多年的努力,尽管我们利用分子生物学技术构建了大量的工程菌,但除国外的Ciba2Geigy等少数公司外,工程菌还没有大规模的应用于生产。

噬菌体污染长期是Bt生产的一大威胁,我国科学家和企业紧密配合,如湖北农业科学院、福建浦城绿安公司等先进的Bt企业在实践中摸索了一系列控制技术,有效地控制了因噬菌体而引起的“倒罐”。

采用先进的后处理工艺是大幅度提高Bt产品效价的根本性措施。

我国20世

纪50—80年代所采用的“板框压滤”技术,只能生产出低效价的产品,后来采用“连续离心”,改变了工艺,提高了效价,当今借鉴医药生产所使用的“超滤浓缩”和喷雾干燥,使得Bt产品得到突飞猛进的效果。

有关剂型,国外比国内要丰富得多,包括可湿性粉济、悬浮剂、水分散颗粒剂、油悬剂、胶囊剂和颗粒剂,而国内主要是悬浮剂和可湿性粉剂。

我国由于长期依赖于低成本的劳动力,再加上我们习惯于消费低质量低价格的农产品如蔬菜等,造成了只注重数量不注重质量的习惯,随着人们生活水平的不断提高和对食品安全的关注,相信一定会在生物农药工业做更大的投入,将生产出更多高质量的Bt产品。

1.3设计方案

1.3.1产品方案

产量的确定

产量5的大小直接影响到设备的配套、车间的布置和面积、公用设施和辅助设施的大小，以及劳动力的定员等。

班产量主要由原料供用量的多少、生产季节的长短、延长生产期的条件（如冷库及半成品加工措施等）、定型作业线或主要设备的生产能力、每天生产班次及产品品种的搭配以及厂房、公用设施的综合能力等因素制约。

另外，班产量的确定还与市场销售能力有关系。

生产班制

苏云菌芽孢杆菌生产企业每天生产班次为1～2班。

根据加工品的市场需求，酸乳厂生产工艺特点，原料特性及加工设备的生产能力和运转状况，一般淡季一班，中季二班，旺季三班。

生产天数及日产量

酸乳厂由于受到市场需要、季节气候、生产条件（温度、湿度等）和原料供应等方面影响，生产天数和生产周期大不相同。

酸乳生产旺季在夏季6月、7月、8月，旺季工作日（

）为82d。

2月、3月、4月为生产的淡季，工作日为78d（

），中季生产为140d（

），余下77d为节假日和设备检修日，则全年生产天数为：

（d）

计算班产量：

2+6+40=48（h）

=0.5

=

x300=150（班）

q=Q/kt=1000/0.75*150=9（t/班）

______一周期生产时间

______设备准备时间

______清洗设备时间

______生产Bt的周期

______每天的班次Q______一年要求达到的产量

q______每班达到的产量k——设备不均系数,在此取0.75

1.3.2选址

本设计是在通过充分的市场调研，根据田园集团的经验，，在选址方面贯彻了农药工厂选址“应远离重工业区，空气清新，水质清纯，环境幽雅无污染”的原则，其厂址选择在辽宁鞍山达道湾工业区

1.3.3车间生产过程设计

根据苏云金芽孢杆菌生产工艺要求，需以下建筑物或构筑物。

（l）主生产车间:

苏云金芽孢杆菌生产线。

（2）原、辅材料库:

存放生产用的辅料及包装材料。

（3）发酵室:

菌种发酵用。

（4）水处理间:

提供液态生产配料用的净化水。

（5）冷库:

存放苏云菌芽孢杆菌成品用。

（6）空压机房:

提供某些设备自动化控制所需的压缩空气及生产过程中的需求。

（7）化验室:

原辅材料的检验及车间成品的理化指标和微生物的检测[4]。

（8）更衣室、卫生间:

供车间工人使用。

（9）锅炉房:

提供生产所需要的蒸汽。

（10）配电室:

提供生产用电。

第2章工艺流程确定与论证

2.1工艺流程确定

2.1.1苏云金芽孢杆菌液体深层发

图1液体深层发酵基本工艺流程

Fig1SchemdiagramshowingsubmergedfermentationprocessofBt

1956年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养Bt，并用于防治菜青虫的报，从而揭开了Bt液体培养的序幕，Bt制剂之所以能广泛应用，关键在于能通过液体深层发酵大规模生产。

其工艺流程如图1所示。

液体发酵主要有分批发酵、补料分批发酵和连续发酵三种方式。

分批发酵一次性投料，工艺简单，但若要达到较高的发酵水平，需要较高的基质浓度，这种情况下很容易产生基质和代谢产物抑制，同时培养基的粘度增加后，由于影响[10]混合和流动而不利于氧的传递，最终可能使毒效大打折扣。

为此人们从反应器和工艺角度进行了改进。

采用外环流气升式反应器，通过气体喷射推动液体循环流动以取代传统的机械搅拌方式，由于能耗低、结构简单、传质效果好、换热面积大、剪切力低等优点，对Bt毒效的提高有很大帮助，但目前还缺乏大型生产的经验，尚处于研究阶段；提高搅拌速度或增大通风量以改善供氧环境，有助于毒效的提高，但势必以增加能耗为代价。

于是有人提出了流加工艺，逐渐提高基质浓度以削弱抑制，也因此实现了Bt的连续发酵，但长时间的连续发酵培养基很容易染菌，菌种也易发生退化或产生无孢突变株。

综合两者的优点，补料分批发酵被认为有较好的发展前景，即逐渐补料，一次出料。

补料方式又可分为连续式和间歇式，等研究发现间歇式补料比连续式细菌增殖快，芽孢密度大；连续式补料在补料过程中即使细胞增殖缓慢也不会像分批发酵那样很快转入芽孢期，补料浓度过高则不能形成芽孢。

通过控制pH值来调节补料，补料过程中pH保持在7.0左右，避免了营养过剩问题，苏云金素产量比分批发酵提高了89.51%。

2.2.2苏云金芽孢杆菌固态发酵

图2固态发酵基本流程

Fig2Schematicdiagramsolid-statefermentatiprocessofBt

固态发酵起源于我国传统的“制曲”技术，是利用颗粒载体表面所吸附的营养物质或颗粒本身提供的营养来培养微生物。

在相对小的空间内，这些颗粒载体可提供相当大的气液界面，从而满足好气微生物增殖所需要的水份、氧气和营养。

20世纪50年代，国外开始将这项技术用于Bt的发酵生产。

70年代，我国许多地区与单位都进行了Bt的固态发酵研究[15]，直到上世纪80年代，其生产工艺才逐渐完善。

传统的固态发酵按设计规模可分为网盘薄层法、皿箱式、大池通风法以及地坪式等发酵方式，如图2所示。

可用于苏云金固态发酵的原料很广泛，但选择时既要考虑物料的营养性，也要考虑载体的通气性。

通常使用的载体可分为有机载体和无机载体两类，有机载体如麦麸、米糠、黄豆饼粉、花生饼粉等，既可作为营养源，又兼有载体作用；无机载体如多孔珍珠岩、细沙等，这些物质通气性能较好，但需要另外添加营养成分。

杨淑兰等利用麸皮、棉籽饼粉、米糠、草木灰等为发酵原料，进行了百公斤级的Btsubsp.HD-1固态发酵试验，研究发现种龄、发酵温度、初始pH值、基质含水量与草木灰含量等是影响芽孢形成和毒效的重要因素，选择最佳培养条件可使发酵芽孢数稳定在2.0×1010CFU·g-1，在2000倍稀释度条件下对菜青虫的致死率为100%。

基质的通气性主要用含水量来控制。

适宜的初始含水量，使得培养基有合适的疏松度，颗粒间存在一定空隙，有助于菌体从培养基获得营养成分和氧的传递，从而促进生长繁殖，而过高的含水量会导致培养基粘结成团，多孔性降低，影响氧的传递；含水量过低，则使培养基膨胀程度降低，水的活度低，抑制菌体生长。

Capalbo等人将潮湿的稻谷装入聚丙烯袋接种Btsubsp.tolworthi进行了固态发酵实验室研究，湿度控制在50%~60%，产物田间毒效良好，48h死亡率可达100%。

固态发酵具有低投资、低成本、低排污等优点，但因输送、搅拌、温度、湿度、pH值[8]和供氧等诸多问题缺少工程解决手段而使其发展受到了限制。

陈洪章等人首先提出了压力脉动固态发酵技术，利用压力脉动周期刺激强化生物反应和细胞膜传质速率。

压力脉动避免了机械搅拌的缺陷，提高了传质传热效率，降低温度、O2和CO2浓度梯度，促进了毒效的提高。

目前，压力脉动固态发酵反应器[14]已成功放大到70m3的工业级生产规模。

2.2.3小结

在发酵过程中，液态发酵流动性好，传质、传热性能优于固态发酵，也便于控制；但在后处理过程中，液态发酵通常需要碳酸钙[7]助滤或离心浓缩，操作复杂且有效成分易流失，而固态发酵可以直接进行干燥、粉碎，能源消耗小，但可湿润性较差。

综上所诉，结合近年来工业生产的发展，采用液体深层发酵。

第3章

物料衡算

3.1生产条件

已知发酵培养接种量为1%，发酵时间为46h，发酵罐的搅拌转速为400~600r/min，通气量为1.75L/min，发酵液密度为1000kg/m3,粘度为0.1Pa·s。

年操作日300天，每升发酵液可以纯化得到Bt产品0.45kg，共需生产150个周期。

水蒸气170℃，冷却水进出口温度根据实际情况确定。

3.2各设备的物料衡算

发酵罐中成分啤酒糟1000g，，米粉15g，豆粕180g，KH2P032g水占60%密度为1000kg/

3.2.1发酵罐物料衡算

每周期发酵体积：

v=9*10^3/0.45=

装料系数

取

=0.7

30

选用三个10m3的发酵罐，另选一个作为备用罐

发酵液G=1000x10=10000kg

啤酒糟

=10000x1000/2992.5=3341kg

米粉

=10000x15/2992.5=50kg

豆粕

=10000x180/2992.5=138kg

KH2P03

=10000x2/3000.5=6.68kg

水

=10000x1000/3000.5=3341kg=3341L

3.2.2接种罐物料衡算

接种液为发酵液