植物组织培养实验报告.docx
《植物组织培养实验报告.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织培养实验报告.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
植物组织培养实验报告
院（系、部）化学与生物工程学院专业生物技术（师范）年级13级学号17130208姓名组别第二组课程名称植物细胞工程学实验日期2016.3-6
指导老师实验名称植物组织培养综合实验
一、实验目的
1.熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法
2.学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法；
3.掌握超净工作台上的接种方法与注意事项，了解接种室的灭菌方法；
4.了解组织培养的基本程序；
5.掌握接种的方法和材料的培养过程；
6.掌握无菌操作技术，包括外植体除菌和接种技术；
7.观察外植体的生长状况、染菌状况，剔除染菌外植体；
8.了解MS培养基和1/2MS培养基的区别
二、实验原理
1.植物细胞的全能性
一切植物都由细胞构成，细胞是构成植物体的基本结构与功能单位。
植物细胞含有全套遗传信息，具有形成完整植物的潜能。
2.植物细胞表现出全能性的条件
1.离体状态；
2.有一定的营养物质，激素和其他外界条件（无菌、温度、pH）；
3.选择性能优良、细胞全能性表达充分的基因型
3.无菌条件
把植物的组织、器官等，使其在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖。
用于进行组织培养的组织、器官和细胞称为外植体。
在组培中外植体都死带菌的，在接种前必须进行表面消毒，这时取得培养成功的最基本和重要的前体。
组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，所以所有的器材、植物体、接种室都应是无菌的。
4.脱分化与愈伤组织
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化形态，转变为具有分生能力的胚细胞的过程称为脱分化。
脱分化所用的化学物质与MS培养基的区别是需要激素诱导。
所以脱分化培养需在MS培养基上添加激素进行愈伤组织诱导。
5.培养基
植物组织培养常用的培养基为MS培养基。
常用的凝固剂是琼脂,它的主要作用是使液体培养基凝固，琼脂本身并不提供任何营养，它只是一种高分予的碳水物从海藻中提取出来，仅溶解于热水，成为溶胶，冷却后（40℃以下）即凝固为固体状凝胶。
琼脂的用量一般在4—10克／升之间。
琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解而丧失凝固能力，存放时间过久，琼脂变褐，也会逐失去凝固能力。
MS培养基属于富盐平衡培养基，特点是：
无机盐浓度较高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，因而在培养的过程中可维持较好的稳定性；营养丰富，在一般培养中无须额外加入复杂的有机成分；微量元素种类全，浓度高。
这类培养基是目前使用最广泛的培养基。
6.生长调节物质
包括天然植物激素额人工激素类似物。
植物激素是一类植物自身合成、同时对其生长发育具有重要调节作用的有机化合物。
生长调节物质对于离题培养中的细胞分裂分化、器官形成和个体再生等均起着重要而明显的调节作用。
一般来说，基本培养基只能保证培养物的生存，维持其最低的生理活动，而只有植物激素的配合使用，才能完成离体培养物中按照需要设计的各个调节环节。
常用的植物组培激素种类主要有生长素类、细胞分裂素类、赤霉素。
1）生长素的生理作用主要是促进细胞分裂和生长，有利于外植体脱分化并启动细胞分裂，有利于形成愈伤组织。
同时生长素和细胞分裂素的协调作用，对于培养物的形态建立十分必要。
在离体培养的分化调节中，生长素促进不定根的形成而抑制不定芽的发生。
在液体培养中，生长素还有利于体细胞胚胎发生。
常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、奈乙酸（NAA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚丁酸（IBA）等。
在使用2，4-D时，必须严格控制使用浓度和培养时期，因为高浓度的2，4-D常常抑制器官的发生，在分化培养时不能使用2，4-D代替其他生长素。
2）细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂，调节器官分化，延迟组织衰老，增强蛋白质合成等。
此外，它还能显着改善其他激素。
离体培养中，细胞分裂素能够促进不定芽的发生，与生长素协调使用能有效调控培养物的生长与分化。
常用的细胞分裂素包括6-卞基嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、异戊烯氨基嘌呤（2ip）、玉米素（ZT）等。
3）赤霉素（GA）是一类广泛存在于植物体内的激素，目前已发现的天然赤霉素有20多种。
自然界植物体内的赤霉素具有促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠及诱导单性结实等生理功能。
在离体培养条件下，赤霉素的主要作用时促进细胞伸长生长，与生长素协同作用对形成层的分化具有一定影响，同时还能刺激体细胞胚进一步发育成植株。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1.植物材料：
马齿苋、番茄种子诱导的无菌苗、外植体（盘龙参、波斯菊、金叶女贞、黄花苜蓿、菊花、香樟、杜鹃、月季）
2.实验药品（试剂）：
甲醛、MS培养基母液（见表1）、蔗糖、琼脂、1%升汞、酒精（75%和90%）、NaOH、HCl、6-BA、NNA、无菌水；
3.仪器设备和实验用具：
高压灭菌锅、天平、pH计、超净工作台、电炉、酒精灯、镊子、解剖刀、剪刀、烧杯、培养瓶、量筒、烧杯、玻璃棒、广口试剂瓶、牛皮纸、滤纸、培养皿、药勺、支架、打火机等。
四、实验步骤
（一）培养基母液的配制（2016/3/4）
1.MS培养基贮备液配制
贮备液I（g）（20×）
贮备液III（mg）（100×）
MgSO4·7H2O
3.70
500mL
FeSO4·7H2O
278
100mL
NH4NO3
16.50
Na2EDTA·2H2O
373
CaCl2·2H2O
4.40
生长调节剂
KNO3
19.00
6-BA
50mg
50mL
KH2PO4
1.70
NAA
50mg
贮备液II（mg））（100×）
贮备液IV（mg））（100×）
KI
8.3
100mL
肌醇
1000
100mL
H3BO3
62
烟酸
5
MnSO4·4H2O
223
盐酸硫胺素
1
ZnSO4·7H2O
86
盐酸吡哆醇
5
Na2MoO4·2H2O
2.5
甘氨酸
20
CuSO4·5H2O
0.25
称量溶解混合定容
CoCl2·6H2O
0.25
表1
1）每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，定容。
2）贮备液III需加热溶解。
混合后调至pH5.5，定容，保存在棕色玻璃瓶内。
3）6-BA：
1mg/mL（溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容）。
NAA：
1mg/mL（先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容）。
4）各种母液配制完成后，分别用玻璃瓶贮存，贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，放入冰箱冷藏室保存。
一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变,应立即需重新配制。
2.其他试剂的配置
1）1mol/L的NaOH：
1瓶
2）1mol/LHCL：
1瓶
3）0.1%的升汞或2%次氯酸钠：
每个超净工作台一瓶（用时处理5-30min）
4）70~75%酒精：
每个超净工作台一瓶
5）95%酒精：
每个超净工作台一瓶
6）75%酒精棉球：
每个超净工作台一瓶
（二）培养基的配制与灭菌
1.培养基配制
1）配制培养液（MS培养液）：
按每次配制500mL培养基计，用量筒或者移液管从各种母液中分别取出贮备液I25mL、贮备液II、Ⅲ、Ⅳ各5mL；
2）溶化琼脂：
用粗天平分别称取5g琼脂、15g蔗糖放入500mL搪瓷缸中，加入蒸馏水400mL，用用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至500mL，搅拌均匀。
3）调pH：
用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸（5.4～7.0）测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止（培养基的pH必须严格控制在5.8）。
4）培养基的分装?
溶化的培养基应该趁热分装。
分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入组培瓶（50mL或100mL）中。
注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。
组培瓶中培养基的量约50mL。
每500mL培养基，可分装10～15瓶。
5）培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。
最后在组培瓶外壁贴上标签。
2.培养基灭菌（高压灭菌）
1）放培养瓶。
将装有培养基的培养瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。
如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。
2）放置其他需要灭菌的物品。
将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。
3）待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。
在98kPa、121.3℃下，灭菌20min。
灭菌后取出培养瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。
最好放置1d后再使用。
3.其他灭菌
1）不耐热的物质将采用过滤灭菌
如赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素等。
过滤灭菌的原理：
溶液通过滤膜后，细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。
2）玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌
即利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀灭微生物。
3）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
（三）接种室和超净工作台的灭菌处理
1.接种室熏蒸灭菌
长期不用的培养室或接种室要进行熏蒸。
方法：
甲醛、高锰酸钾熏蒸。
甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。
室内准备妥当后，把称好的高锰酸钾放在瓷碗或烧杯内（最好在碗或杯下面铺一张报纸，以利清洗），然后将甲醛也倒入碗或杯内，立即出屋关门。
几秒钟后，甲醛溶液即沸腾挥发。
高锰酸钾是一种氧化剂，当它与一部分甲醛作用时，由氧化反应产生的热可使其余的甲醛挥发为气体。
甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。
甲醛对人的眼、鼻有强烈刺激作用。
因此，可在使用前用氨进行中和。
取与甲醛等量的氨水，倒在另一个烧杯里，迅速放入熏蒸室内，使甲醛和氨水发生中和反应，以消除甲醛味，减少对人体的刺激作用。
使用氨水应在工作前2小时进行。
对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸
2.准备组培室
将组培室打扫干净，调至适宜温度
3.超净工作台处理
1）材料准备
用75%酒精擦拭，准备好超净工作台内物品，包括酒精棉球、75%和90%酒精、废液缸、打火机、酒精灯、支架、镊子、解剖刀、解剖剪等
2）灭菌处理
实验开始前先用75%酒精擦拭工作台面，然后开启紫外灯，紫外照射20min-30min。
关闭紫外灯，开启风机10min后打开日光灯。
用70－75％的酒精拭擦台面并消毒双手。
试验用具也应该用酒精消毒。
点燃酒精灯，将金属器械在其火焰上灼烧，冷却待用。
注意：
所有操作应在火焰近处并经过灼烧进行。
金属器械不能过度灼烧，以防退火。
移液管不能灼烧，培养瓶口、塑料材料、橡胶材料过火焰不能时间太长。
（四）无菌苗的培养（2016/3/11）
1.培养基配制（方法同
（二）培养基的配制与灭菌）
种子的萌发采用1/2MS培养基
1/2MS培养基
贮备液Ⅰ
贮备液Ⅱ
贮备液Ⅲ
贮备液Ⅳ
蔗糖
琼脂
12.5mL
2.5mL
2.5mL
2.5mL
15g
5g
2.马齿苋（番茄）种子处理
1）洗去浮尘和上漂的种子，挑选饱满种子，置于培养瓶中流水冲洗30min后倒掉水备用；
2）将种子置于培养瓶中，用75%酒精消毒灭菌30~60s，用无菌水冲洗干净；
3）用1%升汞处理8~10min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌接种器械进行分离接种。
3.接种及培养
1）用酒精擦洗工作台和手，对接种器具进行灼烧灭菌；
2）打开培养瓶，瓶口在灯焰处旋转灼烧，用镊子（90%酒精浸泡并灼烧）将培养材料置于培养基上，灼烧瓶口，盖上瓶塞。
3）培养瓶贴上标签，做好标记，然后放到光照培养箱中或培养室培养架上进行培养，条件为2000-3000LX，26±1℃，培养一周。
实验结果：
所有马齿苋无菌苗均染菌（未拍照）
实验分析：
①马齿苋种子消毒、灭菌时间不足
②接种室和培养实灭菌不彻底，环境较脏
③实验操作不正确
④超净工作台不干净
（五）愈伤组织诱导（2016/3/25）
1.培养基的配制（方法同
（二）培养基的配制与灭菌）
愈伤组织诱导培养基
组别
6-BA
NNA
贮备液Ⅰ
贮备液Ⅱ
贮备液Ⅲ
贮备液Ⅳ
蔗糖
琼脂
一
0.5%
0.5%
25mL
5mL
5mL
5mL
15g
5g
二
0.5%
1%
三
0.5%
0.5%
四
1%
1%
2.无菌苗和外植体的处理
1）无菌苗处理
从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；
2）外植体处理
a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；
b将洗净植物切去叶柄，将叶片从叶脉处剪开，再切成3～4mm2的小块；嫩茎需切取两个节之间的节间部分，长约1cm，流水冲洗30min；
c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗
d用1%升汞处理12~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。
3.接种及培养（同无菌苗的建立）
4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养
5.观察实验现象
实验结果：
组别
材料
染菌率
枯死率
存活率
二
马齿苋
100%
（2）
所有叶柄基部没有散开，一起消毒
75%酒精15s
升汞：
15min
盘龙参根
0
0
100%
（2）
盘龙参-叶绿色
0
100%
盘龙参-叶基部
0
50%
（1）
50%
（1）
苜蓿（花+叶）
0
花-0
叶-50%
花：
100%
叶：
50%
波斯菊叶
0
0
100%
第一周（2016/4/8）
材料
马齿苋
盘龙参根
结果
材料
盘龙参叶
盘龙参叶基部
结果
材料
苜蓿花+叶
波斯菊叶
结果
第二周（2016/4/15）
材料
苜蓿花+叶
波斯菊叶
结果
开始长愈伤组织
无变化
愈伤组织长势良好
实验分析：
1、仅有无菌苗染菌：
无菌苗本身染菌，但未被发现；
实验培养基凝固不彻底，粘到瓶子壁上；
培养基pH未调好；
操作时，动作不正确
无菌苗仅用无菌水洗涤，未用酒精和升汞
2、外植体有部分枯死：
灭菌过度，时间过长
3、盘龙参组织无变化：
可能由于培养基中植物激素不适宜，培养室温度、光照等不恰当
4、波斯菊长愈伤组织明显，此培养基较适宜波斯菊
5、不同植物对植物激素的要求不同，所以在同一浓度下出现不同的结果
（六）生根实验（类似扦插）（2016/4/15）
1.生根培养基配制（方法同
（二）培养基的配制与灭菌）
生根培养基（1/2MS）
组别
6-BA
NNA
贮备液Ⅰ
贮备液Ⅱ
贮备液Ⅲ
贮备液Ⅳ
蔗糖
琼脂
二
0
0.2%
12.5mL
2.5mL
2.5mL
2.5mL
15g
5g
三
0.4%
四
0.6%
2.无菌苗和外植体的处理
1）无菌苗处理
从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，保留部分幼嫩叶片，切成0.5cm大小（材料尽量幼嫩），置于无菌培养皿备用；
2）外植体处理
a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；
b将洗净植物切去老叶，保留顶端嫩叶、嫩茎，切成长约2cm茎段，流水冲洗30min；
c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗
d用1%升汞处理13min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后（约1.5cm）进行接种。
3.接种及培养（同无菌苗的建立）
一瓶接种2~3个茎段，直接插入培养基中，形态学上端朝上；
4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养
5.观察实验现象
实验结果：
组别
材料
染菌率
枯死率
存活率
二
菊花茎
（1）
0
100%
0
75%酒精15s
升汞：
15min
月季茎
（2）
100%
（2）
月季花
（2）
第一周50%
（1）
第二周100%
（2）
女贞茎（4）
0
100%（1长愈伤组织、3无变化）
香樟
（1）
100%（有愈伤）
杜鹃
（1）
100%
波斯菊茎
（1）
100%（略长根，第二周长菌）
第一周（206/4/29）
材料
月季花
月季茎
结果
绽开，无根
花苞长真菌，无根
长真菌，无根
叶稍长，无根，未染菌
材料
菊花茎
香樟
结果
褐化，无根
无根
有白色菌点？
or愈伤组织？
材料
杜鹃
波斯菊茎
结果
无根，几乎无变化
长势旺盛，略微生根
材料
女贞茎
结果
无变化，无根
第二周（2016/5/6）
其余材料均无明显变化
材料
月季花
波斯菊
结果
开始枯萎，无根
波斯菊开始长菌，黄色细菌，菌落光滑
稍长根，但不明显
综合对比
不同浓度NAA对波斯菊生根的影响（2016/5/6）
NAA浓度低——————————>高
实验结果显示：
较高浓度NAA诱导长根效果更好。
如图所示，随NAA浓度的增加，波斯菊生根越多，长势越好
（七）生芽实验（2016/5/6）
1.生芽培养基配制（方法同
（二）培养基的配制与灭菌）
生芽培养基（MS）
组别
6-BA
NNA
贮备液Ⅰ
贮备液Ⅱ
贮备液Ⅲ
贮备液Ⅳ
蔗糖
琼脂
一
5%
0.4%
12.5mL
2.5mL
2.5mL
2.5mL
15g
5g
二
5%
0.2%
三
4%
0.4%
四
4%
0.2%
2.无菌苗和外植体的处理（同上）
1）无菌苗处理
从培养瓶中取出无菌苗，用无菌水洗净培养基，切成0.5cm大小，叶片较大的进行裁剪，置于无菌培养皿备用；
2）外植体处理
a将野外植物洗干净尘土并用洗衣粉刷干净；
b将洗净植物除叶留芽，切成长约2cm，流水冲洗30min；
c将外植体置于培养瓶中，用75%酒精持续消毒灭菌18s，然后用无菌水冲洗
d用1%升汞处理12~15min，然后用无菌水冲洗3~4次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯火焰下方，用无菌解剖刀切去两端后进行接种。
3.接种及培养（同无菌苗的建立）
4.剔除长菌严重的培养瓶，其余继续培养
5.观察实验现象
实验结果：
组别
材料
染菌率
枯死率
存活率
长芽率
二
波斯菊
第三周有染菌
12.5%
87.5%
100%
75%酒精15s
升汞：
15min
番茄
100%
第一周（2016/5/20）
材料
波斯菊
结果
有部分死亡，未死亡的均已生芽，长势好
该培养基适宜用于诱导波斯菊生芽
材料
番茄
结果
无生芽趋势，但是可能要长愈伤组织
该培养基浓度不适宜诱导番茄生芽
第二周（2016/5/27）
材料
波斯菊
结果
茎段生芽长势良好，开始形成愈伤组织
材料
番茄
结果
番茄长势较波斯菊缓慢，第二周生芽（腋芽较多），也形成愈伤组织
第三周（2016/6/3）
材料
波斯菊
结果
部分长势良好，愈伤组织和芽军生长旺盛；波斯菊部分死亡，部分开始长菌，多数为真菌：
1、可能是植物本身含有的菌，培养一段时间后开始生长；
2、培养瓶盖子上部的通气孔有破损
3、培养室内不干净
材料
番茄
结果
番茄是无菌苗，未出现染菌情况。
芽和其遇上组织的生长旺盛
五、注意事项
1.配制培养液时应注意：
1）在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；
2）用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；
3）量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
4）溶化琼脂需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。
此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。
但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。
2.外植体放入培养基时，注意方向。
每瓶放置外植体的数量，应该根据培养瓶瓶的大小来确定，一般放置胡萝卜4-6块。
注意外植体也不要放得太少，以充分利用培养基中的营养成分。
3.接种用的酒精灯，火焰不要调得太高，接种时应靠近酒精灯火焰操作，接种的速度要快。
4.接种时严防超净工作台内着火。
5.无菌操作培养时：
1）进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
2）不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。
3）为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。
4）工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。
同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。
5）吸取营养液、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。
6）工作中不能面向操作区讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。
7）手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。
升级会员 