自己整理实验室常用技术.docx

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自己整理实验室常用技术

实验室常用技术资料

Lab.experimenttechnology

LQ

细胞冻存

1.实验前准备：

细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液

2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。

3.适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。

吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。

4.用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。

（可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养）

5.用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO（二甲基亚枫），用枪头轻轻吹打使细胞均匀。

6.冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时（或隔夜）---液氮槽长期储存。

（-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些）。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏

冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。

细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。

1材料：

37℃恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/离心管/培养瓶

2步骤：

1、操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。

2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。

3、取出冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。

4、常温离心1000rpm，5min，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。

5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2培养箱培养。

G418和筛选

1、筛选之前由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

1.G418的配制：

取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：

取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量（10000个/ml）接种入24孔培养板中，过夜培养，开始加药。

3.制备筛选培养基：

在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、400ug/ml。

。

。

。

1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选:

吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

方法同4。

6.确定最佳筛选浓度：

在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

一般400-８００左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。

2、确定了最佳筛选浓度后做稳定转染

1、转染：

选取对数生长期细胞，接入平皿（4X105个/ml,5ml）,转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：

4密度传代，接入12孔板，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合。

2、加G418:

去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

3、换液：

根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。

当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。

筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大。

4、挑单克隆：

显微镜下观察单克隆，加入胰酶消化，将单克隆吸入96孔板（每孔接1个克隆），加培养液继续培养。

待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

（及早冻存）

5、单克隆鉴定：

细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。

Lf2000转染：

质粒DNA转染

转染前应筛选合适的DNA:

Lf2000转染比例。

一般按照1:

1，2:

1，3:

1进行筛选。

选择转染比率最高者为合适比例。

筛选合适的细胞汇合度，看高汇合度还是低汇合度转染效率高。

筛选时注意观察最佳转染时间。

以下操作以24孔板为例：

1、贴壁细胞：

转染前一天，去不含抗生素的培养液500ul接于培养板（细胞密度0.5-2X105个/ml），转染时细胞融合可到90-95%。

悬浮细胞：

准备转染前取即可，取500ul细胞悬液（4-8X105

个/ml），培养液不含抗生素。

2、准备混合物：

A：

将DNA稀释于50ulOpti中，轻柔混匀。

B：

使用前轻柔混匀Lf2000，取合适剂量用50ulOpti稀释，

室温放置20min（注意：

到stepC时要在25min内完成）。

C：

加入A和B，轻柔混匀，室温放置20min.

3、每孔中加入100ul混合物，前后晃动培养板，轻柔混匀。

4、培养箱培养18-48h，转然后4-6h换液。

PBS配制

500ml

NaCl4g

KCl0.1g

Na2HPO4.12H2O1.7907g

KH2PO40.12g

用400ml蒸馏水溶化，HCL/NaOH调PH至7.3-7.4，加水至500ml,高压灭菌。

胰酶配制

1、PBS500ml

胰酶1.25g

EDTA0.1g

搅拌4h

2、滤膜、滤纸用双蒸水浸泡2h,

3、装好滤器，勿按紧，包好，晾干后高压。

4、略烤干

5、层流室过滤

6、分装到高压过的小瓶

7、-20C保存备用，同时做无菌试验。

CuSO4配制

2%CuSO41500ml

硫酸铜30g

双蒸水1500ml

高压灭菌后，将液体倒入37C恒温箱。

双抗配制

青霉素100u/ml培养液，链霉素100ug/ml培养液

青霉素100万单位

链霉素1g

PBS100ml

配制后浓度为10000u/ml，使用时取10ul/ml培养液。

电泳缓冲液TAE配制

贮存液（50X），1L

Tris碱242g

冰乙酸57.1ml

0.5mol/lEDTA（PH8.0）100ml

加水定容至1L

ALB培养基配制（400ml）

细菌培养用蛋白胨4g

细菌培养用酵母提取物2g

氯化钠4g

预先在三角烧瓶中加入200ml双蒸水，将上述配方加入其中，搅拌。

5mol/LNaOH调PH至7.4.，加入双蒸水定容至400ml。

取200ml做固体培养基装入A瓶，200ml做液体培养基。

称取3g琼脂加入A瓶。

另取一小瓶，加入100ml双蒸水（配氨苄）。

将以上三瓶液体高压，15psi,20min。

配氨苄，过滤除菌。

待A、B瓶冷却至50oC，照100ug/ml浓度的氨苄，每瓶加入200ul，之后将A瓶液体倒入培养皿中，将B瓶和培养皿（倒置）贮存于4oC。

注：

溶液尚未冷却时，轻轻转动，使溶解的琼脂均匀分布，应避免产生气泡。

使用前1-2小时应取出贮存的平皿。

细胞组织RNA提取（整个过程在冰上进行）

一、溶解细胞

（1）贴壁细胞：

吸去瓶内培养液，PBS冲洗两遍，加入胰酶消化，吸去胰酶加入PBS吹打，制成细胞悬液，将悬液移入EP管，离心1000rpm,10min，弃上清。

加入Trizol1ml。

反复吹打，使沉淀溶解。

（可以先加上500ul吹打，再加500ul充分混匀）

（2）悬浮细胞：

将细胞离心，加入Trizol反复吹打，使沉淀溶解。

Trizol量为1ml/5-10X106个细胞（动植物及酵母）或1ml/1X107个细菌。

（3）组织：

将组织切成小块（100mg），PBS冲洗干净，装入EP管，剪碎（非常碎，剪成组织悬液，时间可稍长些），加入上500ulTrizol吹打使组织溶解，再加500ul充分混匀。

二、水相与有机相的分离

将上述所得液体于室温放置5min以使蛋白体解离，加入氯仿（0.2ml/mlTrizol）,盖上管盖，剧烈震荡（不要用振荡器）15s，室温放置2-3min。

2-8OC下离心12000rpmX15min,离心后液体分三相：

下层红色的酚-氯仿相，中间及上层水相。

RNA全部位于水相，体积约占加入Trizol的60%。

三、沉淀RNA

将水相移入新的EP管（若要是提取DNA或蛋白质保留有机相）加入异丙醇（0.5ml/mlTrizol）,-20OC放置90min（可过夜），2-8OC离心12000rpmX10min，可见管底部凝胶状沉淀，即为RNA。

四、洗涤RNA

用75%酒精（1ml/mlTrizol）冲洗沉淀，2-8OC离心7500rpmX5min,弃上清。

将所得沉淀置于空气或真空（操作台内）中，干燥（注意不要过干，过干RNA难以溶解）。

加入不含Rnase的水或0.5%SDS溶液溶解RNA。

琼脂糖凝胶电泳检测。

-20OC保存。

反转录

RNA3ul（量可改变）

OLIGO1ul65OC水浴，5min

H2O5ul（量可变）

冰上静置1min

5Xbuffer4ul

Rninhibitor1ul

DNTP2ul全部取好混匀后再分加

M-MVLV1ul

混匀，瞬离，42OC水浴60min

70OC水浴5min,终止反应

PCR

H2O12.2ul

Buffer2.5ul19.2ul

DNTP2.5ul

MgCL22ul

上游引物0.75ul25ul

下游引物0.75ul

TAQ0.3ul

cDNA4ul

石蜡封口，用PCR仪器，设定PCR条件。

待反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测基因表达。

ATF5PCR条件：

94OC5min

94OC30s

55OC30s35cycle

72OC30s

72OC10min

琼脂糖凝胶电泳

1、制胶：

称取1.2g琼脂糖（跑PCR产物时胶的浓度可大些1.5-1.8g）,加入100ml0.5XTAE，加热融化后冷却至60OC左右，加入5ulEB，混匀。

倒入胶板，除去气泡。

冷却30min。

硬化后放入电泳槽。

（用不完可用保鲜膜包好放入4OC保存）。

电泳槽内加电泳缓冲液0.5XTAE，使液面高出凝胶表面1-2mm。

2、上样：

取5ul样品与上样缓冲液按4：

1混匀，用微量加样器小心加入凝胶样品孔内，注意勿溢出孔外。

3、电泳、紫外光检测和分析

接通电源，电压为5v/cm。

电泳完成后，切断电源，紫外灯下观察条带。

质粒转化（操作过程需严格在无菌罩内操作）

1XTSS两步转化法

1、菌种的复苏：

用无菌铂丝直接挑取冻存的大肠杆菌菌株，在LB琼脂平板表面划线，（同时在ALB固体培养基划板，验证大肠杆菌，正常不生长）置37oC培养12-16小时。

2、从培养板中挑取单个菌落转到3mlLB液体培养基中，于37oC摇床震摇,培养过夜直到OD值约0.6再转入含有10mlLB（按比例1：

100接）液体培养基的烧瓶中剧烈震摇4h,200rpm/min。

3、取1ml细菌培养物转移到EP管中，冰上静置10min,离心3500rpmX5min,弃上清。

（注意分组）

4、加入100ulTSS溶液，反复轻柔吹打以重悬菌液（打开细胞壁）。

5、加入连接产物1ul（体积不能超过10ul），轻轻混匀后水浴40min。

6、42oC热休克90s。

7、冰浴2min，以冷却细胞。

8、于EP管中加入100ul37℃预热的LB培养液，37oC震摇30min。

9、将100ul菌液均匀涂在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上。

37oC培养12-16h。

[若所转化质粒可用a-互补筛选重组阳性克隆，则加入80ul/40ulX-Gal（20mg/ml）和8ul/4ulIPTG（20mg/ml）,混匀后涂板。

10、将平板置4oC数小时后，观察培养结果（若非蓝白斑选择质粒无需此步）。

实验设计

1、转化时设对照组（不转染任何质粒）和转化组（转化目的质粒）

2、第9步时，对照组分别在LB固体培养基和ALB固体培养基上涂板，转化组只需用ALB固体培养基

3、预期结果：

对照组在LB固体培养基生长旺盛，在ALB固体培养基上不生长；转化组在ALB固体培养基生长。

质粒DNA的分离与纯化

碱裂解法小量提取质粒

[材料]

LB液体培养基

STE溶液（0.1MNaCl，10mMTris-HClPH8.0，1mMEDTA）

SolutionI溶液（50mM葡萄糖，25mMTris-HClPH8.0，10mMEDTA）

SolutionⅡ溶液（0.2MNaOH，1%SDS，现用现配）

SolutionⅢ溶液（5M乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，H2O28.5ml）

3M乙酸钠溶液pH5.2、纯水、无水乙醇、70%乙醇

苯酚/氯仿/异戊醇（25：

24：

1）、TE缓冲液（10mMTris-HClpH7.5，1mMEDTA）

[方法]

1、挑取含质粒的宿主菌单个菌落接种于5mlALB液体培养基，37℃振荡培养20小时以上，至OD600约为0.5。

2、将1.5~3ml菌液转入EP管中，12000rpm离心2分钟沉淀菌斑，弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。

3、加入预放置于4℃的STE溶液100ul重悬菌斑，12000rpm离心1分钟，弃上清，倒置于吸水纸上是液体流尽。

4、加入4℃的100ul的SolI重悬菌斑，必要时可振荡重悬，4℃放置5~10分钟。

5、加入200ul新鲜配制的SolⅡ，倒置混匀5~10次，冰上放置2~3min（勿振），使细菌裂解。

6、加入150ul预置4℃的SolⅢ，温和颠倒数次混匀5sec，冰上放置5min，使质粒DNA复性。

然后15000rpm离心10分钟，上清入新EP管，勿吸沉淀。

7、加入等体积（约450ul）的苯酚/氯仿/异戊醇振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管，再加等体积的氯仿，振荡混匀，15000rpm离心5min，将上层水相入新EP管。

8、上清入新管，加入二倍体积的预置于－20℃的无水乙醇，再加入原液1/10体积的3MNaAc，颠倒混匀，－20℃放置1小时，以沉淀质粒DNA。

9、15000rpm离心10min，将上清去掉，再加入1ml70%的乙醇，沿管壁加入，8000rpm离心10min，小心将上清弃去。

10、在空气中完全干燥后加入纯水或TE缓冲液30ul溶解沉淀，37℃水浴30min后放置－20℃保存备用。

质粒提取试剂的配制

SolutionⅠ：

50mmol/L葡萄糖；25mmol/LTris-HCL（pH8.0）；10mmol/LEDTA

配制方法：

200mmol/L葡萄糖25ml（葡萄糖0.99085g）

0.5mmol/LEDTA（pH8.0）2ml

1mmol/LTris-HCL（pH8.0）2.5ml

加ddH2O定容至100ml,高压蒸汽灭菌15min,贮存于4℃。

SolutionⅡ：

200mmol/LNaOH；1%SDS（现用现配）

配制方法：

5mmol/LNaOH40ul

10%SDS100ul

ddH2O860ul

SolutionⅢ：

5mol/L乙酸钾60ml；冰乙酸11.5ml；ddH2O28.5ml；PH4.8

配制方法：

乙酸钾29.442g

冰乙酸11.5ml

加ddH2O定容至100ml，贮存于4℃。

STE缓冲液:

10mmol/LTris-HCL（pH8.0）；0.1mol/LNaCL；10mmol/LEDTA（pH8.0）

配制方法：

NaCL0.5844g

1mmol/LTris-HCL（pH8.0）1ml

0.5mmol/LEDTA（pH8.0）0.2ml

加ddH2O定容至100ml,高压蒸汽灭菌15min,贮存于4℃。

10%SDS（十二烷基磺酸钠）

SDS10g

ddH2O80ml

加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值为7.2，加ddH2O定容至100ml。

（注：

SDS为表面活性剂，称量时要戴面罩。

10%SDS无须灭菌。

）

1mmol/LTris-HCL（pH8.0）

Tris碱12.114g

浓盐酸5.03ml

ddH2O80ml

用浓盐酸调节溶液的pH值为8.0，补ddH2O定容至100ml。

0.5mmol/LEDTA（pH8.0）

EDTA-Na18.61g

ddH2O80ml

在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值为8.0（约需2gNaOH）ddH2O

定容至100ml，高压灭菌备用。

（注：

EDTA二钠盐需加NaOH将pH至调至接近8.0时才能完全溶解。

）

3mol/L乙酸钠（pH5.2）

冰乙酸钠40.81g

ddH2O80ml

用冰乙酸调节pH至5.2，ddH2O定容至100ml，高压灭菌备用。

质粒小提试剂盒（所有过程在室温下进行）

E.Z.N.ATMPlasmidMiniKitI

自备物品：

13000×g转离心机

无菌1.5ml离心管（4个）

实验前准备：

将RNaseA加入到SolutionⅠ瓶中，并置于4℃保存。

用无水乙醇稀释DNAWashBuffer。

使用前检查SolutionII，SolutionIII有无结晶析出，如果有将其37℃温育，使其溶解。

1、①挑取冻存的含有质粒的大肠杆菌接种ALB固体培养基，37℃培养至长出单菌落。

②挑取含有质粒的大肠杆菌（DH5α、JM109）单克隆，接种于1-5ml的ALB中，37℃，300rpm活化12-16h。

2、取1.5-5ml菌液，10000g，室温离心1min，弃上清。

3、加入250ulSolutionI/RNaseA,吹打或涡旋重悬菌斑（吹打至看不到固体颗粒）。

<充分重悬有利于提高产量>

4、加入250ulSolutionII，轻柔颠倒混匀数次，清洗裂解产物<禁用振荡器，用力过猛会导致染色体DNA断裂，SolutionII盖子要拧紧>，可室温静置2min（管中拉丝，水膜形成）。

5、加入350ulSolutionIII，轻柔颠倒混匀数次，直至白色絮状沉淀生成。

<加入SolutionIII后立即混匀，必须完全混匀>

6、13000×g，室温离心10min。

（迅速进行下一步）

7、准备柱子，向柱内加入100-200ulBufferGPS,10000g离心2min,去除BufferGPS

8、将上层清夜小心加入干净的HiBindMiniprepColumn

（1）{将HiBindMiniprepColumn

（1）套入2ml收集管}注意不要混入沉淀，确保没有细菌通过柱子。

10000g室温离心1min,使液体完全通过柱子。

9、弃滤液，重新使用离心管。

<将滤液暂存于另一离心管>向柱子中加500ulBufferHB，10000×g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。

10、向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNAWashBuffer，10000×g，室温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。

11、向柱子中加入700ul无水乙醇稀释的DNAWashBuffer，10000×g，室

温离心1min，弃滤液，重新使用离心管。

12、13000×g，室温离心2min，离心空柱子以除去柱子内的酒精。

13、将柱子放入干净的1.5ml离心管，加入30-50ulElutionBuffer（10MmTris-HCl,PH8.5）或高压过的双蒸水到柱子上，室温静置1-2min,13000×g，室温离心1min，洗涤DNA，将所得DNA分装入EP管，-20℃保存。

（可以进行第二次离心，将残余的质粒洗脱，但是浓度很低）

14、用琼脂糖凝胶电泳测提取质粒大小，用紫外分光光度计检测质粒浓度。

DNA浓度=A260X50ug/ml

MTT

材料：

培养液、0.25%胰蛋白酶、MTT（5mg/ml,滤过除菌）、培养板、大、中枪和枪头、EP管、5ml离心管、细胞计数板、DMSO

步骤：

1、吸掉细胞培养瓶中的旧培养液。

2、加入适量的预温PBS，轻轻晃动培养瓶，吸掉PBS。

3、加入0.25%胰酶，以刚好覆盖瓶底为宜，轻轻左右摇动培养瓶。

4、镜下观察，待细胞消化变圆竖起培养瓶，吸掉胰酶。

5、加入含10%胎牛血清的1640，轻轻反复吹打，使细胞脱落形成单细胞悬液。

6、将细胞转移至EP管中，吹打混匀。

7、倒置显微镜计数。

8、调整细胞数为5×104个/ml，（取部分悬液于一新的5ml离心管，家培养液）

9、转移细胞于96孔板，每孔200ul，每接一空混匀5ml管。

（每种药物3块板，以得3个平行测定结果）

10、37℃培养24h。

（细胞进入对数生长期时开始加药）

11、换为不含血清的1640

12、继续培养24h。

13、取8个新EP管，做好标记，每管加入相应量的无血清培养基

14、向EP管中加药，从最高浓度到最低浓度稀释（最高浓度下多数细胞被杀死，最低浓度下不会杀死细胞，5倍一列稀释，共制备8个浓度），充分混匀。

15、取出96孔板中的细胞，以每一浓度重复3个复孔，按不同浓度做好标记。

16、吸弃孔中培养液（可倾斜平板），每孔加入200ul含有药物的培养基。

17、放入培养箱，按要求培养一定时间（SKOV3一般作用48小时）

18、药物作用结束后，取出细胞培养板，加入5mg/mlMTT（锡纸包裹的1.5ml离心管中），每孔20ul。

19、37℃孵育4-8h（锡箔包板），以形成蓝色甲赞结晶。

20、取出细胞培养板，小心吸掉上清。

21、每孔加入150ulDMSO，溶解MTT-甲赞结晶。

22、待结晶充分混合后即可上机检测（分光光度计490nm）

①调零孔（培养基、MTT、DMSO）

②对照孔（细胞、药物、培养基、MTT、DMSO）

③以药物浓度为横坐标（x轴）、吸光值为纵坐标（y轴），平均吸光值作为对照吸光值。

④对照组吸光值减少一半时所需药物浓度为IC50浓度

⑤试验孔吸光值/对照组吸光值×100=抑制百分率以抑制百分率为纵坐标，绘制标准曲线。

GuavaNexinReagent

标记早期凋亡细胞并描述早期凋亡与晚期凋亡细胞/死亡细胞间的差异

步骤：

1、培养细胞：

包括阳性和阴性对照组（适当时间诱导细胞凋亡）

2、将GuavaNexinReagent从冰箱取出，恢复至室温

3、准备用GuavaNexinReagent孵育的所有细胞标本，保证准备的细胞样本中至少含1%BSA、1%FBS或10%NHS

①将细胞上清和脱落细胞转移到15ml离心管中。

②用胰酶消化平皿内的细胞，吸出绝大多数胰酶，加入含10%血清的1640中和胰酶，并轻柔吹打至单细胞悬液。

③将平皿内的单细胞悬液移植15ml离心管内，再次吹打均匀。

④1500rpm，离心10min，弃上清。