非洲猪瘟防控工作中消毒剂的选择及使用畜牧兽医论文农学论文.docx

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非洲猪瘟防控工作中消毒剂的选择及使用畜牧兽医论文农学论文

非洲猪瘟防控工作中消毒剂的选择及使用-畜牧兽医论文-农学论文

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　　摘要：

　为评价含碘、季铵盐、过硫酸氢钾、二氧化氯这四类常用消毒剂对非洲猪瘟病毒（ASFV）的灭活效果，参考OIE参考实验室相关操作流程，基于畜禽栏舍、运载工具、器具消毒及皮肤黏膜消毒目的，根据说明书标明的浓度范围选择不同工作浓度，与ASFV分别在4℃和20℃条件下作用30分钟，10倍连续稀释后接种猪肺泡巨噬细胞，同时加入猪红细胞，培养观察红细胞吸附现象。

结果显示，本试验四类消毒剂对ASFV均有灭活作用，但灭活效果因消毒剂的种类和工作浓度不同有所差异。

相同工作浓度的同一消毒剂产品，在4℃和20℃这两种条件下的灭活效果基本一致。

季铵盐类和二氧化氯类消毒剂，在说明书推荐的工作浓度下，均有效灭活ASFV；多数含碘类、过硫酸氢钾类消毒剂，需在其说明书标明浓度范围的较高工作浓度时，才可有效杀灭ASFV。

本研究为非洲猪瘟防控工作中消毒剂的选择和使用提供参考。

　　关键词：

　非洲猪瘟;消毒剂;灭活;病毒;消杀;

　　Abstract：

　InordertoevaluatetheinactivationeffectoffourkindsofdisinfectantsagainstAfricanswinefevervirus（ASFV）includingiodinedisinfectant,quaternaryammonium,potassiumpersulfateandchlorinedioxide,withreferencetorelevantoperationproceduresofOIEreferencelaboratories,andbasedonthepurposeofdisinfectinglivestockandpoultrysheds,transportationvehicles,instrumentsandskinmucousmembrane,theabovedisinfectantsweresetatdifferentconcentrationsaccordingtocorrespondinginstructionsandreactedwithASFVfor30minutesat4℃and20℃,respectively.Thereactionproductswerediluted10timescontinuouslyandinoculatedinporcinealveolarmacrophages,meanwhile,porcineerythrocyteswereaddedintocultivateandobservetheadsorptionstatusofredbloodcells.TheresultsshowedthatASFVcouldbeinactivatedbyalltheabovedisinfectants,buttheeffectdependedonthetypeandconcentrationofthedisinfectants;thesamedisinfectantwithsameconcentrationcouldreceivesimilareffectat4℃and20℃；ASFVcouldbeeffectivelyinactivatedbyquaternaryammoniumandchlorinedioxidewiththeconcentrationasproposedinrespectiveinstructions;butfailedbymostiodinedisinfectantandpotassiumpersulfateunlessthehigherconcentrationwasreachedasindicatedincorrespondinginstructions.ThestudyprovidedsomereferencestoselectandusedisinfectantsinthecontrolofASFV.

　　Keyword：

　ASF;disinfectant;inactivation;virus;disinfectionandsterilization;

　　接触传播是非洲猪瘟（Africanswinefever,ASF）传播的重要方式。

据调查，在我国发生的多起规模化养殖场ASF疫情是由人员、运输工具携带非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus,ASFV）接触猪群引发。

同时，健康猪可通过接触ASFV污染的水、饲料、垫料等而造成感染。

因此，在生猪养殖、运输调运、屠宰加工、检验检疫等各环节，选择合适消毒剂杀灭病毒，阻断其接触传播途径，对于ASF防控非常重要。

　　ASFV属于囊膜DNA病毒，其衣壳由外脂膜下的数个同心的脂质和蛋白层组成，对乙醚和氯仿易感[1]。

针对ASFV的消毒剂选择，可借鉴已有针对囊膜病毒的消毒剂，如伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒等[2]。

甲醛、次氯酸钠、柠檬酸、苛性钠、酚化物、碘化物、季铵盐等均已证实对ASFV有杀灭效果[3,4,5,6]。

　　为评价我国市售消毒剂对ASFV的杀灭效果，本试验选择常用的市售含碘、季铵盐、过硫酸氢钾、二氧化氯等四类消毒剂，以OIE参考实验室有关操作流程为依据，开展消毒剂对ASFV灭活效力评价，以期为我国ASF防控工作提供技术支持。

　　1、材料与方法

　　1.1、消毒剂

　　收集市面常见的含碘、季铵盐、过硫酸氢钾、二氧化氯等四类消毒剂，其中含碘类7种，商品代号A1～7；季铵盐类1种，商品代号B1；过硫酸氢钾类5种，商品代号C1～5；二氧化氯类消毒剂1种，商品代号D1。

除A1、C5外，其余产品均注册有兽药产品批准文号，试验时所有产品均在有效期内（表1）。

　　1.2、病毒

　　中国非洲猪瘟病毒分离株AfricanswinefevervirusisolateCN2018/1株，由国家非洲猪瘟参考实验室分离鉴定。

　　表1消毒剂产品信息

　　1.3、试剂与耗材

　　DMEM培养基、胎牛血清为GIBCO公司产品；细胞瓶及96孔细胞板，购自Corning公司。

　　1.4、猪肺泡巨噬细胞、红细胞和血清制备

　　无菌采集健康猪肺脏，向肺脏注入灭菌PBS灌洗数次，收集灌洗液，离心收集猪肺泡巨噬细胞，按5106个/mL浓度100L/孔接种96孔板。

次日铺板，进行测试。

　　同步无菌采集抗凝血，离心收集血清，之后将细胞沉淀洗涤3～5次，弃去白细胞和血小板，用PBS配成10%猪红细胞悬液，4℃保存备用。

　　1.5、消毒剂对细胞状态影响试验

　　基于畜禽栏舍、运载工具、器具消毒及皮肤黏膜（部分含碘类消毒剂适用）消毒目的，按消毒剂说明书推荐，合理选择高、中、低工作浓度，并将消毒剂原液制成10倍工作浓度备用。

将0.1mL10倍工作浓度液加入到0.9mL含1%猪血清的PBS中充分混合，混合物分别在20℃和4℃条件下作用30min。

部分无法配制10倍工作浓度的，包括含碘类消毒剂A1、A4、A5的1:

2稀释工作浓度，取0.5mL消毒剂原液加入0.5mL含1%猪血清的PBS。

阴性对照组，直接取1mL含1%猪血清的PBS，按相同条件作用处理。

　　作用结束后，采用含1%猪血清的PBS连续10倍稀释各组作用后产物至10-8，每孔50L接种猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入1%猪红细胞10L，每个稀释度（含未稀释作用产物即原液）做4重复孔。

将96孔板置于37℃5%CO2条件下培养6d，观察记录细胞状态。

评估消毒剂对猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞状态影响，用于消毒剂对ASFV灭活作用试验参照。

　　1.6、消毒剂对ASFV灭活作用试验

　　参考OIE参考实验室开展的消毒剂对ASFV灭活效力评估操作流程，制定本试验方案。

按1.5方法，稀释消毒剂至10倍工作浓度备用。

测试组，将0.1mL10倍工作浓度液和0.1mLASFV培养物加入到0.8mL含1%猪血清的PBS中充分混合，混合物分别在20℃和4℃条件下作用30min。

部分无法制成10倍工作浓度的，包括含碘类消毒剂A1、A4、A5的1:

2稀释工作浓度，将0.5mL消毒剂原液和0.1mLASFV培养物加入到0.4mL含1%猪血清的PBS，按相同条件作用处理。

阳性对照组，将0.1mLASFV培养物加入到0.9mL含1%猪血清的PBS中充分混合，按相同条件作用处理。

阴性对照组，直接取1mL含1%猪血清的PBS，按相同条件作用处理。

　　作用结束后，用含1%猪血清的PBS连续10倍稀释各组作用后产物至10-8，每孔50L接种猪肺泡巨噬细胞培养物，同时加入1%猪红细胞10L，每个稀释度（含未稀释作用产物即原液）做4重复孔。

将96孔板置于37℃5%CO2条件下培养6d，每天观察，记录并统计各稀释度培养孔（含未稀释作用产物即原液）中红细胞吸附（HAD）反应结果；如结果可疑或无法判定，则再次传代后综合判定结果。

重复试验2次，统计消毒剂不同工作浓度下各培养孔中HAD结果，采用Reed-Muench法计算半数红细胞吸附量（HAD50），测定病毒滴度log10HAD50/mL。

参照卫生部颁布的2002版《消毒技术规范》[7]，计算消毒剂平均灭活对数值，消毒后平均灭活对数值4，判为有效灭活ASFV。

平均灭活对数值按如下方法计算：

设阳性对照组平均病毒感染滴度（HAD50）的为N0，试验（消毒）组平均病毒感染滴度（HAD50）为Nx。

平均灭活对数值=log10N0-log10Nx。

　　2、结果与分析

　　2.1、消毒剂对细胞状态影响试验

　　含碘、季铵盐、过硫酸氢钾、二氧化氯等四类消毒剂对细胞状态影响结果详见表2。

含碘类消毒剂中，A1～5成分主要为碘化物，对细胞状态影响不显着。

A6、A7主要成分为碘、磷酸、硫酸时，对细胞状态影响可见于原液、10-1～10-3稀释孔中，表现为猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞不同程度的破碎、崩解。

　　季铵盐类消毒剂对细胞状态影响见于原液、10-1～10-2稀释孔中，表现为猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞不同程度破碎、崩解。

　　过硫酸氢钾类消毒剂对细胞状态影响可见于原液、10-1稀释孔中。

其中，C4的1:

200、1:

800、1:

1600工作浓度原液孔中出现不同程度的猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞破碎、崩解；C1、C2、C5的1:

200工作浓度原液孔和C4的1:

200工作浓度10-1稀释孔，与阴性对照组相比，猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞轮廓模糊，折光性下降，状态相对较差，但形态未见明显异常。

　　二氧化氯类消毒剂对细胞状态影响较小，各培养孔中猪肺泡巨噬细胞和猪红细胞形态均未见明显异常。

　　2.2、消毒剂对ASFV灭活作用试验

　　阳性对照组，培养6d后，发生显着细胞病变，猪肺泡