小鼠实验方案.docx

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小鼠实验方案

酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验方案

酵母提取物抗氧化能力的测定

概述：

自由基是指是机体代谢的正常产物，在体内有很强的氧化反应能力，可以在细胞代谢的过程中不断地产生。

大量的研究结果证明，自由基是衰老的决定因素。

在生命活动过程中产生的各种自由基中轻自由基的作用最强，进攻性也最强，几乎可以和所有的生物分子、有机物或无机物发生不同类型的化学反应。

超氧阴离子不仅自身具有毒性，而且可以通过其他反应产生更多的氧自由基，进一步对生物体产生损伤作用。

试验拟采用DPPH自由基体系、超氧阴离子（O2-）自由基体系、羟自由基（HO-）体系以及还原力测定体系评价酵母提取物的抗氧化活性。

试验方法

1）DPPH自由基清除试验

DPPH储备液配制：

精密称取19.7mgDPPH溶解于25mL甲醇中，再吸取2.5mL溶液，以甲醇补足体积至25mL，得到200µMDPPH母液，暗处保存备用。

药品及对照品储备液配制：

酵母提取物采用甲醇溶解，得到终浓度为1mM的母液。

再将母液加甲醇稀释至一定浓度梯度，加3mL于比色管中（对照组加入3mL甲醇或水），再加入1mLDPPH母液，剧烈震荡后，与暗处保存30min，以甲醇做空白，测其517nm吸光值。

以Vc作为阳性对照，各组反应平行测定三次，DPPH自由基清除率按照下面公式计算：

DPPH自由基清除率（%）=

式中A0代表对照组的吸光值；

A1代表加药组的吸光值。

2）超氧阴离子（O2-）自由基清除试验

采用NADH-PMS方法评估酵母提取物对超氧阴离子自由基的清除能力。

试管中依次加入1mLNBT（81µM）溶液，1mLNADH（468µM）溶液，1mL不同浓度的待测溶液，0.4mLPMS（88µM）溶液，充分混匀，静置5min，在560nm处测其吸光值。

用水代替待测溶液做阴性对照，水代替PMS做本底组对照，Vc做阳性对照。

清除率计算:

清除率（%）=[1-（（Aa-Ab）/A0]X100%

式中Aa为样品吸光值，Ab为样品吸光值，A0为阴性对照值。

3）羟自由基（HO-）清除试验

本实验参照文献等提供的方法评估PEP对羟自由基的清除能力。

反应液的配制:

100mL的磷酸盐缓冲液（20mMpH7.4）中加入EDTA,FeC13和DR（终浓度分别为0.1mM,0.1mM和2.8mM）。

测定时，取反应液1.5mL，依次加入0.1mLVC（1mM）、0.35mLH2O2（20mM）及1mL不同浓度的样品溶液，37℃水浴。

20min后，加入1mLTBA（1%）和3mLTCA（2.8%），90℃水浴，15min后，532nm处测定吸光值。

D-Mannitol做阳性对照。

清除率的计算:

清除率（%）=[1-（（Aa-Ab）/A0]X100%

式中Aa为样品吸光值，Ab为样品吸光值，A0为阴性对照值。

酵母提取物对小鼠肝损伤保护作用试验

四氯化碳是一种强有力的肝毒素，被广泛用于诱导肝脏损伤的实验动物，本身对肝细胞没有毒性效应，但其受到肝微粒体酶活化成为CCL3.，以共价形式与蛋白质结合，导致蛋白合成障碍，脂质分解代谢紊乱，引起肝细胞内甘油三酯蓄积，同时CCL3*能迅速与氧气结合转化为CCL3OO*，导致脂质过氧化，引起细胞膜变性甚至坏死。

ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时，就会引起谷丙转氨酶和谷草转氨酶在血清中浓度会偏高，ALT和AST是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的指标。

TC和TG是临床血脂分析的重要指标，当肝细胞受损时二者的含量将会升高。

丙二酸（MDA）在体内是自然生成的，是氧化应激的标志物，MDA增加的越多可以间接反映机体细胞受到自由基攻击的程度越大。

谷胱甘肽（GSH）是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂，具有解毒和抗氧化能力，对肝脏有重要的保护作用，当肝细胞或者机体受到损伤时组织和血液里的含量就会降低；超氧化物在超氧化物歧化酶（SOD）催化作用下转化为氧气和过氧化氧，能清除超氧阴离子自由基，可见SOD具有使机体的超氧化物减少的作用，进而达到保护细胞的作用;谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）是机体内的一种重要的可以促进过氧化物分解的酶，它可以将体内的过氧化物进行分解，从而减轻机体或者组织受自由基或过氧化物带来的损害；在所有的机体内都存在着酶促反应体系和非酶促反应体系两种反应类型，这两种反应类型当然也涉及到了机体抗氧化的反应类型。

总抗氧化能力（T-AOC）反映了机体酶促反应体系和非酶促反应体系总的抗氧化水平的指标,当机体或者组织受到伤害时就会使T-AOC的活性水平降低。

当肝脏受到损伤时，GSH、SOD、GSH-PX和T-AOC含量的都会不同程度的降低。

试验动物：

昆明小鼠60只，雄性，体重18~22g。

试验试剂：

酵母提取物，联苯双酯配制成10mg/ml的溶液。

四氯化碳、花生油。

谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），总胆固醇（TC），甘油三脂（TG）谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽转移酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），总抗氧化能力（T-AOC）。

ALT和AST主要存在于肝细胞内，当肝脏发生损伤、坏死或受到破坏时，会引起谷丙转氨酶和谷草转氨酶在血清中浓度会偏高，和是迄今为止国内外应用最为广泛的反映肝细胞损害的指标。

和是临床血脂分析的重要指标，当肝细胞受损时二者的含量将会升高。

试验方法：

1.试验分组：

60只小鼠随机分为空白对照组、模型组、联苯双酯组和低、高、中酵母提取物量组，每组10只。

2.动物给药：

试验前让小鼠自由饮食和摄水，适应性喂养3天。

联苯双酯（BP）组小鼠给药0.5ml（500mg/kg·bw）；高中低剂量实验组中给药分别为8mg/kg·bw、5mg/kg·bw、2mg/kg·bw；空白对照组和四氯化碳组给予等量的生理盐水，所有组别每天灌胃一次。

所有组小鼠连续喂养21天后，第22天，除空白对照组外其余各组均腹腔注射0.8%CCL4油溶剂0.3ml，而空白对照组仅注射等量的花生油。

2h后所有动物禁食，水供应充足。

48h后对小鼠进行称重麻醉，实行颈椎脱位方式处死。

眼球釆血，剥离小鼠肝脏用生理盐水清洗后称重，计算肝脏指数（肝脏指数=肝体质量/小鼠体质量）。

离心后的血液样品储存于4°冰箱，小片肝脏冷藏在-80℃冰箱，以供进一步分析。

试验期间观察小鼠皮毛、活动性等，解剖期间观察肝脏颜色。

酵母提取物和柠檬苦素动物模型建立参照上述方法进行。

3.血清和肝匀浆的制备。

将离心后的血液分别吸取上清液以供实验分析，分别称取1g肝脏，加入0.9%的冷藏的NaCl溶液10ml，进行匀浆，3000r/min离心10min取上清液备用。

4.血清生化指标测定：

利用试剂盒测定小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、MDA、GSH、GSH-PX等生化指标。

5.病理石蜡切片

6.试验数据采用统计学软件spss对实验数据资料进行分析处理，数据用均数±标准差表

示，组间比较用t检验，且p<0.05有统计学意义。

酵母提取物中脂肪酸、甾醇组分的GC-MS分析

酵母提取物中脂肪酸、甾醇的降血脂作用

甾醇酯能够在人体内转化成甾醇和脂肪酸，所以其生理功能包括植物甾醇和脂肪酸两部分所具有的生理功能，具有与游离植物甾醇同等的降低血浆总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的效果，在某些方面甚至效果更好。

试验试剂：

甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（）、超氧化物歧化酶（SOD）。

试验动物：

昆明小鼠，雄性，体重18-22g

试验方法：

1．试验分组：

50只小鼠随机分为空白对照组、高脂模型组和低、中、高剂量酵母油脂提取物组，每组10只。

2．动物给药：

空白对照组：

喂食基础饲料（玉米面30%，面粉30%，麦麸35%，鱼粉2%，骨粉2%，食盐1%）

其余四组喂食高脂饲料,即基础饲料77%，猪油15%，胆固醇3%，蛋黄4.5%，脱氧胆酸钠0.5%。

持续喂养高脂饲料一周建立高脂模型。

一周后从空白对照组和高脂模型组随机分别选出4只,眼球取血,离心得血清测定其总TC、TG含量。

检验高脂模型是否建立。

高脂模型建立后除空白对照组外其余各组仍然喂食高脂饲料。

根据中国营养学会推荐的每人每天油脂的摄入量是25g,换算为小鼠大概10mg。

所以根据以上数据对各组进行灌胃试验。

每天早上灌胃一次，灌胃剂量为低剂量组（），中剂量组（），高剂量组（）。

空白对照组与高脂模型组均供给自来水。

喂养35天，各组小鼠禁食24h，摘眼球采血，分离血清后，测各项指标。

酵母提取物中脂肪酸、甾醇对细胞血脂调节作用研究

肝脏是人体合成内源性甘油三酯及胆固醇的主要场所，同时也是脂肪酸进行β-氧化最活跃的部位，通过促进脂肪酸的分解氧化，释放能量供机体利用。

HepG2细胞株虽属于癌细胞，但其保留了正常肝细胞的糖脂代谢等绝大多数生理功能，是国际公认的可用于降脂功效研究的细胞。

长链脂肪酸能够引起肝细胞脂肪变性，因此拟采用无脂肪酸的牛血清蛋白BSA代替胎牛血清，并通过外源添加油酸建立体外HepG2细胞脂质堆积模型，以消除血清中脂肪酸造成的干扰。

细胞培养（CellCulture）是指从机体内取出某种组织或者细胞,模拟机体内的生理条件,使其可以在体外生存、生长和繁殖的过程。

动物细胞的培养开始于本世纪初，1962年其规模开始扩大,发展至今已成为生物、医学的研究及应用中广泛采用的技术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、疫苗和单抗等,己经成为了医药生物高技术产业的重要部分。

利用动物细胞培养的技术生产的生物制品已经占世界生物高技术产品市场份额的50%。

动物细胞的大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。

培养技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、优化细胞培养环境、提高产品的产率与保证其质量等方面。

细胞培养可分为原代培养和传代培养两种情况。

原代培养（primaryculture）是指直接从机体中取出组织或细胞后,进行首次培养。

传代培养（subculture）是指当原代培养的细胞增殖到一定的密度后,将其从原培养容器中取出,以一定的比例转移到另一个或几个容器中所进行的再次培养。

传代培养可简称传代。

在体外培养的过程中,要使细胞能正常地生长以及繁殖,需要经常对细胞进行传代。

传代的累积的次数也就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、条件较多并且要求严格的实验性的工作。

由于细胞在体外的生长、繁殖会受到温度、酸碱度、营养物质及微生物等多种因素的影响,故细胞培养工作的各个环节如培养器皿清洗消毒、值调整、营养液配制和除菌、温度调节等操作环节都有严格的要求和规定,无菌操作尤为重要,这也是细胞体外培养的最关键的因素。

实验中几种常用的细胞模型

U937单核细胞

U937是巨噬细胞淋巴瘤细胞系。

悬浮生长，生长非常迅速,细饱圆形。

生长不好会表现为培养基中的杂质增多，细胞变形等。

HepG2细胞

HepG2是一种人肝癌细胞株，牵涉面非常广泛，影响因素众多。

广泛应用于乙型肝炎病毒感染机制、病毒培养遗传毒理学试验以及外源性生物性异物的细胞毒性等方面的研究。

因为该细胞容易培养传代，且胆固醇的合成及代谢与正常的肝脏相接近。

很多学者把它作为研究的细胞模型并检测其对胆固醇代谢的影响，进而研究降血脂的样品。

CHO细胞

CHO细胞是一个转化细胞系,是年从中国地鼠卵巢细胞得到。

广泛的采用K1亚克隆株需要脯氨酸，因为遗传学上有缺陷,所以不能将谷氨酸转变为谷氨酸-γ半醛。

该细胞是上皮样细胞,通常是贴壁生长,也可悬浮生长。

细胞被广泛地用来表达重组DNA的蛋白。

该细胞也是目前国际上用于研究胆固醇代谢的最好模型之一。

方案一（参考李建科学生论文）

细胞株：

成人正常肝细胞L02

首先，建立肝细胞L02脂肪变性模型，采用油红O染色法对肝细胞L02中的脂滴进行染色，在24h、48h、72h时间段，观察模型组细胞脂滴的融合情况和脂滴密度，判断50%胎牛血清的高脂培养液对肝细胞中脂肪含量的影响，确定肝细胞L02高脂肪模型最佳建立时间。

其次，测定细胞内TC含量进一步确定建立脂肪变性肝细胞模型的最佳时间及AST、ALT含量判断细胞的损伤程度，确保脂肪变性肝细胞模型成功建立，同时又减小对肝细胞的损伤，确定脂肪变性肝细胞模型建立的最佳时间。

细胞培养

1.细胞传代与培养

采用完全培养液，在温度37℃、空气湿度95%、CO2浓度5%的条件下，将成人正常肝细胞L02置于孵箱中培养。

细胞贴壁生长并呈梭状表明细胞长势良好。

待细胞长至80%左右，弃掉培养液，用PBS冲洗２次，加入2mL0.25%胰蛋白酶消化液，在孵箱中消化约３min。

待细胞悬浮、变圆且细胞间隙变大后，加入ｌmLRPM1-1640完全培养液终止消化。

随后用一次性无菌注射器缓慢吹打，直至细胞全部脱落。

将此细胞悬液收集于离也管中，1000rpm离心、３min，弃去上清液后再加入1mLRPM1-1640完全培养液，缓慢吹打均匀，以1×106cell／瓶的浓度接种于新培养瓶内，加入５mL完全培养液继续培养。

2.细胞冻存

待细胞长至80%左右，弃掉培养液，用PBS冲洗２次，加入２Ml0.25%胰蛋白酶消化液，在孵箱中消化约３min。

待细胞悬浮、变圆且细胞间隙变大后，加入ｌmLRPM1-1640全培养液终止消化。

随后用一次性无菌注射器缓慢吹打，直至细胞全部脱落。

将此细胞悬液收集于离也管中，1000rpm离心、３min，弃去上清液后加入1.6mL冻存液，吹打均匀后移入冻存管，在-4℃保存30min，-20℃保存2h，-80℃过夜后，放于液氮中长期保存。

3.细胞复苏

根据慢冻快融原则，将从液氮中取出的冻存管迅速置于３７Ｃ的水浴锅中，并缓慢晃动使其尽快融化。

将此细胞悬液与１０倍体积的ＲＰＭＩ１６４０完全培养液混合均匀，８００ｒｐｍ离也５ｍｉｎ，弃掉上清液后加入ｌｍＬＲＰＭＩ－１６４０完全培养液，吹打均匀，接种于细胞瓶中，补加４ｍＬ完全培养后置于脾箱培养。

建立成人正常肝细胞L02脂肪变性模型

1．50%胎牛血清诱导肝细胞

2．油红O染色法定性观察细胞内脂滴变化

3．胆固醇含量测定

4．转氨酶含量测定

酵母提取物对脂肪变性肝细胞L02胆固醇的影响

将试验分为正常组、模型组、阳性药物组和甾醇处理组。

待细胞生长至对数期时，按一定方法处理，细胞处理结束后，裂解细胞，用试剂盒测定各组细胞中TC含量。

各组处理方法：

正常组：

正常培养液培养48h

模型组：

造模培养液培养24h后，换用正常培养液培养24h

阳性药物组：

用10、20、40ug/mL的洛伐他丁处理，培养过程和条件同模型组

甾醇处理组：

分别用若干梯度的甾醇处理，培养过程和条件同模型组。

批处理完成后，测定各组中TC的含量，预计甾醇处理组会不同程度减少脂肪变性肝细胞L02内的TC含量，并与洛伐他丁降低TC的作用做对比确定甾醇对胆固醇降低的作用。

Ps：

《石榴皮多酚》中研究了胆固醇流出过程中LXR（肝X受体）等调控因子，判断样品能否调节这些基因的表达量，激活细胞信号通路，促进胆固醇流出以降低肝细胞中胆固醇含量，减少肝细胞中脂质积累。

方案二：

细胞株：

人肝癌HepG2细胞

采用无脂肪酸的牛血清蛋白BSA代替胎牛血清，以油酸诱导HepG2下形成体外高脂细胞模型，以清除血清中脂肪酸造成的干扰。

在细胞存活率实验（MTT法）的基础上，以脂质清除率为评价指标验证酵母提取物的降血脂功效。

试验试剂：

胎牛血清（FBS）、牛血清蛋白（BSA）、DMEM高糖培养基、尼罗红（nilered）和其他有机试剂。

Ps:

DMEM培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。

细胞培养

将细胞接种于25cm2培养瓶中，加入含10%FBS，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素的DMEM培养液，置于37°，5%CO2条件下，每2天换液一次，细胞密度为80%-90%时传代，取对数期细胞用于试验。

1.消化传代：

观察贴壁细胞铺满瓶底约80%以上时,即需要消化传代。

取出培养瓶,在超净工作台中弃去培养液,用PBS溶液冲洗两遍,加入消化液适量（没过瓶底）。

轻轻摇动培养瓶,使消化液覆盖细胞层,静置3-4min,倒置显微镜下观察细胞收缩变圆,间隙变大后,弃去消化液,加入适量的培养液,用吸管将细胞从瓶壁上小心的吹下,分装接种到新的灭菌培养瓶内,并置于37℃培养箱中培养。

2.冻存：

冻存的前一天换液一次,取对数生长期的细胞,常规消化制成单细胞的悬液,移至离心管,1000rpm，离心5min，弃去培养液,加入冻存液,用吸管吹打使细胞悬浮,移至冻存管中（冻存的细胞密度达107个/mL）,密闭后,并且标记时间细胞的名称,实行分段温:

4℃，30min,-20℃30min；-80℃，1h；液氮（-196℃）；最后保存于液氮罐中。

3.复苏：

从液氮罐中迅速取出冻存管,放入37℃水浴箱中,使冻存管中的冻存物迅速在1min之内融化,将细胞悬液吸到离心管中,加入10mL的DMEM培养液,吹打均匀,然后离心（100rpm，8min），弃去上清液,加入新鲜培养液洗两遍,将细胞移至培养瓶中加入适量的新鲜培养液,放置培养箱中培养。

取对数生长期的细胞进行实验。

细胞存活率的测定

将细胞悬液按8×104个/mL的密度接种至96孔板，每孔终体积100uL。

培养24h后，弃上清液，加样，每孔终体积200，24h后，每孔加入20uL5%MTT溶液。

4h后，弃上清液，每孔加入150uLDMSO，室温振摇10min后，用全自动酶标仪于490nm处检测吸光度。

细胞内脂质含量的测定

将细胞悬液按4x105个/mL的密度接种至6孔板，每孔终体积2mL。

培养24h后，弃

上清液，加样，每孔终体积2mL，培养至预定时间后，弃上清液。

pH7.4的磷酸缓冲液（PBS）洗2次，胰酶消化收集细胞，重悬细胞于1mLPBS，清洗一次。

用500uL4%多聚甲醛固定细胞15min,PBS洗2次。

加入尼罗红染液，终浓度为50ng/mL，水浴37C，避光染色

5min，用流式细胞仪测定细胞荧光强度几何平均值（激发光波长为488nm，发射光波长约

550nm，以未经药物处理，未加尼罗红染色细胞为空白调零）。

体外高脂细胞模型的建立

油酸细胞毒性试验

对照组采用含10%FBS的DMEM高糖培养基；试验组采用1%的BSA的DMEM高糖培养基，加入油酸使其终浓度分别为0-4.0mmol/L，培养细胞24h后测定存活率。

细胞脂肪病变试验

对照组釆用含10%FBS的DMEM高糖培养基；试验组分别加入油酸使其终浓度为0、

0.5、1.0、1.5mmol/L，培养细胞24h或后用流式细胞仪测定细胞内脂质相对含量。

细胞形态观察

将细胞悬液按2X105个/mL密度均匀接种至24孔板，每孔终体积0.5mL。

培养24h后，弃上清液，加样，每孔终体积0.5mL,24h后，弃上清液。

用PBS清洗2次，用0.5mL4%多聚甲醛固定15min后，用PBS清洗3次，每孔加入500uL1ug/mLHoechst33258染液，室温避光染色10min，弃染色液，PBS洗涤2次后，加入500uL50ng/mL尼罗红染色液，370℃避光染色5min后，PBS洗涤一次，荧光显微镜下观察。

酵母提取物的体外降脂实验

对照组采用含10%FBS的DMEM高糖培养基处理；试验组采用相同培养基，分别加样，测定细胞存活率。

以体外高脂细胞模型为对照；试验组与对照组培养基相同，加入无细胞毒性浓度的酵母提取物；培养后测定细胞内脂质含量，计算脂肪清除率。

Ps：

尼罗红是一种亲脂性荧光染料，它能透过细胞膜，与细胞内脂质发生特异性结合，在450-500nm激发光和543nm的发射光下发出红色荧光，荧光强度值越高，则表明细胞内脂肪酸含量越高。

HepG2细胞经油酸处理后细胞形态发生明显变化，由原来的梭状变成球状，细胞质内脂质含量明显增多，形成高脂细胞模型。

经不同的酵母提取物处理后，细胞内脂质含量有不同程度的减少。

酵母提取物中脂肪酸、甾醇对细胞血脂调节作用研究（利用中国仓鼠卵细胞CHO）

含甾醇类的植物与动物性固醇的化学本质一样,如海藻、豆类、蒲黄等多含有菜油甾醇、谷甾醇、豆甾醇等植物甾醇,这些物质在肠道中可与动物性固醇竞争,从而可以减少胆固醇的吸收。

酵母提取物配制成若干个浓度梯度的组别。

CHO细胞用含10%小牛血清的DEME培养基,在37℃,5%CO2的浓度的条件下培养,消化传代，加入约5mL培养液,挑选若干瓶长势较好的细胞给药，分别设置添加若干浓度梯度的酵母提取物另设置阴性对照组（阴性对照则是肯定不会出现结果的“实验组”，材料也是确定的）。

相同条件下培养24小时后,将各瓶细胞经胰腺酶消化后检测。

细胞内胆固醇的提取

1.细胞破碎：

将己消化的细胞离心（1000rpm，5min），弃上清，沉淀中加入2mL的生理盐水,进行超声波细胞破碎处理。

工作条件为：

功率200w,超声5s,间隔10s,工作次数为次20次。

2.萃取：

加入等体积的正己烷萃取，3000rpm，15℃离心5min，取上层有机相，重复一次,45℃烘箱内干燥后,加入0.5mL甲醇（色谱纯）溶解,3000rpm,15℃下离心5min,取上清液待测。

胆固醇含量检测

1.绘制胆固醇标准曲线：

称取胆固醇标准品，GC-MS进样分析，绘制胆固醇标准曲线。

2．用建立的GC-MS方法检测细胞内胆固醇的含量。

结果预测

样品组胆固醇含量降低