免疫荧光组织化学技术.docx

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免疫荧光组织化学技术

免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………

二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………

（一）直接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗原方法……………………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

（二）间接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗体（夹心法）方法……………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

3．检查抗原法………………………………………………………………………

（三）补体法………………………………………………………………………………

1．直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………

2．间接检查组织内抗原方法………………………………………………………

（四）双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………

（五）对照试验……………………………………………………………………………

1．直接方法…………………………………………………………………………

2．间接方法…………………………………………………………………………

3．补体方法…………………………………………………………………………

三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………

（一）荧光素………………………………………………………………………………

1．异硫氰酸荧光素…………………………………………………………………

2．四甲基异硫氰酸罗达明…………………………………………………………

3．得克萨斯红（Texasred）……………………………………………………………

4．其它荧光素…………………………………………………………………………

（二）荧光素标记抗体的方法……………………………………………………………

1．FITC标记抗体的方法……………………………………………………………

2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法……………………………………………

3．藻红蛋白标记抗体方法……………………………………………………………

4．蓝色荧光素标记抗体方法…………………………………………………………

（三）荧光抗体的质量控制………………………………………………………………

1．染色特异性和敏感性的测定方法…………………………………………………

2．F/P比值的测定方法………………………………………………………………

3．荧光抗体的保存……………………………………………………………………

四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………

（一）荧光抗体染色方法…………………………………………………………………

1．直接方法……………………………………………………………………………

2．间接方法（双层法）………………………………………………………………

3．间接方法（夹心法）………………………………………………………………

4．补体方法……………………………………………………………………………

5．膜抗原荧光抗体染色方法………………………………………………………

6．双重染色方法………………………………………………………………………

7．荧光抗体再染色方法………………………………………………………………

（二）荧光抗原染色方法…………………………………………………………………

五、荧光显微镜检查方法………………………………………………………………………

（一）荧光和荧光显微镜…………………………………………………………………

（二）荧光显微镜标本制作要求…………………………………………………………

1．载玻片……………………………………………………………………………

2．盖玻片……………………………………………………………………………

3．标本…………………………………………………………………………………

4．封裱剂………………………………………………………………………………

5．镜油…………………………………………………………………………………

（三）使用荧光显微镜注意事项…………………………………………………………

（四）荧光图像的记录方法………………………………………………………………

六、非特异性染色的消除方法…………………………………………………………………

（一）非特异性染色的主要因素…………………………………………………………

（二）消除非特异性染色的方法…………………………………………………………

1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法………………………………………………………

2．DEAE纤维素柱层析法……………………………………………………………

3．荧光抗体稀释法…………………………………………………………………

4．纯化抗原方法………………………………………………………………………

5．纯化抗体方法——免疫吸收方法………………………………………………

6．伊文氏蓝（Evansblue）衬染色方法………………………………………………

七、现状与展望…………………………………………………………………………………

免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述

免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事（1941）建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞（或组织）化学。

它与葡萄球菌A蛋白（SPA）、生物素与卵白素、植物血凝素（ConA等）相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescinactivatedcellsorter（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。

细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。

80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2,cy3,cy5,cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。

由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。

二、免疫荧光组织化学的原理

免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量（图3-2-1）。

图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图

用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。

用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。

免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。

（一）直接方法

1．检查抗原方法

这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。

此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。

（图3-2-2）

图3-2-2直接法

2．检查抗体方法

将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。

（二）间接方法

1．检查抗体（夹心法）方法

此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。

2．检查抗体方法

用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体（抗种属特异性IgG荧光抗体）与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。

此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。

3．检查抗原法

此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。

同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。

此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。

（三）补体法

1．直接检查组织内免疫复合物方法

用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原-抗体-补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。

2．间接检查组织内抗原方法

常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-抗体-补体—荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。

（四）双重免疫荧光组织化学标记方法

在同一组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TMRITC或RB200标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。

（五）对照试验

为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验：

1．直接方法

（1）标本自发荧光对照：

标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。

（2）抑制试验：

可分为二步方法和一步方法。

1）一步抑制方法：

先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。

2）二步抑制方法：

标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

（3）阳性对照：

用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。

结果：

如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

2．间接方法

（1）自发荧光对照：

同直接法。

（2）荧光抗体对照：

标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

（3）抑制试验：

同直接法。

（4）阳性对照：

同直接法。

结果：

如对照

（1）、

（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。

3．补体方法

（1）自发荧光对照

（2）荧光抗体对照

（3）抑制试验

（4）补体对照：

取新鲜豚鼠血清1:

10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

（5）抑制试验：

标本加灭活的第一抗体，再加1:

10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。

（6）阳性对照。

（1）~（5）结果阴性，6和待检标本阳性时，则为特异性荧光。

三、荧光抗体的制备

制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一，制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体。

（一）荧光素

荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光，停止能量供给，发光也瞬时停止。

可以产生明亮荧光的染料物质，称荧光色素。

目前主要常用于标记抗体的荧光色素如下：

1．异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）

FITC是一种呈黄色粉末状，性质稳定，在室温下能保存2年以上，在低温中可保存多年。

易溶于水和酒精。

最大吸收光谱为490~495nm，最大发射光谱为520~530nm，呈现黄绿色荧光，分子量为389.4。

（图3-2-3）

图3-2-3FITC的分子结构式

在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合,成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。

一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。

2．四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TMRITC）

TMRITC是一种紫红色粉末，较稳定。

其最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱620nm呈橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光对比清晰，与蛋白质结合方式同FITC。

它可用于双标记示踪研究（图3-2-4）。

3．得克萨斯红（texasred）

得克萨斯红是一种褐色粉末状，易溶于有机溶剂，性质稳定，在4℃下能保存2年以上，最大吸收光谱为590-595nm，最大发射光谱为620-630mm，共有四种结构，常用的分子量为625.15（图3-2-5）。

图3-2-4TMRITC的分子结构式图3-2-5Texasred的分子结构式

4．其它荧光素

如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）7-氨基甲基香豆素AMC呈兰色荧光；藻红素R（phycoerythrin-R）；花青（Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5,Cy7）等。

（二）荧光素标记抗体的方法

1．FITC标记抗体的方法

（1）Marsshall氏法

1）材料：

抗体溶液、0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25-50ml）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500ml）、pH7.2的0.01mol/LPBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等。

2）方法及步骤：

①抗体的准备：

取适量已知抗体浓度之溶液，加入三角烧瓶中，再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液，使最后抗体浓度为20mg/ml，碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10，混匀，将三角烧瓶置冰槽中，电磁搅拌（速度适当以不起泡沫为宜）5~10min。

②荧光素的准备：

根据标记的抗体总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。

③结合：

边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上（大约在5~10min内加完），加完后，在4℃左右继续搅拌12~18h，通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行。

④透析：

结合完毕后，将标记的抗体溶液离心（2000r/min）10min，除去其中少量的沉淀物，装入透析袋中再置于烧杯中用0.01MpH7.2缓冲盐水透析（0~4℃）过夜。

⑤过柱：

取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。

（图3-2-6，图3-2-7）

图3-2-6SephadexG-25

对FITC标记抗

体液（羊抗兔）柱

层析洗脱模型

图3-2-7FITC与家兔IgG球

蛋白在25℃和2℃时结合

的动力学（Kawamura

1964）

（2）Chadwick氏法

1）试剂和材料：

抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、0.01mol/LpH8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶（25ml）、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯（500ml）透析袋、棉线、玻棒等。

2）方法及步骤：

①抗体准备：

用0~4℃的pH8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml，置入三角烧瓶内，放于冰槽中。

②荧光素准备：

按每毫克蛋白加入荧光素0.01mg计算，称取所需之荧光素量，用3%重碳酸钠水溶液溶解。

③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合，充分搅匀，在0~4℃冰箱中结合18~24h。

④透析和柱层析：

方法同Marshall氏法。

（3）改良法

试剂：

1）0.01mol/LpH7.2PBS配法：

NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO40.2g，溶于2000ml蒸馏水中，校定pH至7.2。

2）0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：

取0.5mol/LNa2CO3（5.3%）10ml加入0.5mol/LNaHCO3（4.2%）90ml，混匀后，校定pH至9.0。

3）3%重碳酸钠水溶液配法：

称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成。

方法及步骤：

取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清，分离球蛋白，用盐水（0.15mol/LNaCI）及缓冲液（0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3pH9.0）稀释使每ml内含抗体10mg，缓冲液为总量的10%，降温至4℃，加入异硫氰酸荧光素，（蛋白：

荧光素=80mg:

1mg），在0~4℃下电磁搅拌12~14h。

然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离，除去未结合的荧光素，再用缓冲盐水透析，除去硫酸铵（用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止）。

将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01%，分装在1ml安瓿中，或冻干，保存于冰箱中（4℃）可以用半年以上，-20保存可达2年以上。

2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法

（1）取IgG10ml（6mg/ml）在0.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜。

（2）将四甲基异硫氰酸罗达明（每毫克IgG加入5~20g）溶于二甲亚砜（1mg/ml），取此溶液300l,一滴一滴加入抗体溶液中，同时电磁搅拌。

（3）在室温中搅拌2h，避光。

（4）把结合物移入直径3cm，高30cm大小的Bio-GelP-6层析柱，用0.01mol/LpH8.0的PBS平衡过柱，流速为1.5ml/min。

（5）收集先流出的红色结合物，即为标记抗体，分装，4℃保存备用。

3．藻红蛋白标记抗体方法

（1）巯基化藻红蛋白（phycoerthrin,PE）的制备600μl的15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺（iminothiolanehydrochloride）加到1.2ml的3.6mg/ml的PE中，和1.2mlPB（pH6.8）混合，装入透析袋置入50mmol/LpH6.8PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。

每个PE分子中可结合8个巯基。

（2）巯基PE-IgG制备异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl3-（2-pyridyldithio）propionate]30g（1.1mg/ml）的乙醇溶液，加入700μl的4.2mg/mlIgGPB溶液（50mmol/LpH7.5），在室温中反应2.5h。

再加入巯基化PE400μl（1.7mg/ml）加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基，在4℃用PB透析过夜。

加入0.01%NaN3分装，4℃保存半年。

（3）PE-标记蛋白A方法

1）取4.08mgPE溶于0.1mol/LpH7.4PB（含0.1mol/LNaCl）1ml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10μlSPDP无水甲醇液（2.6mg/ml），SPDP/蛋白摩尔比为10,22℃反应5min，过SephadexG-50（1×17cm），用100mmol/LpH7.4PBS（含0.1mol/LNaCl）平衡和洗脱。

2）0.5ml蛋白（2mg/ml）100mmol/LPBS（含有100mmol/LNaClpH7.4），加入2.6μl上述SPDP甲醇液，SPDP：

蛋白A=9：

5，22℃，40min,加入25μl二硫苏糖醇（DTT）pH7.4缓冲液，22℃，25min，同上过sephadexG-25，收集蛋白A峰。

3）取0.77mg/ml的PE和0.27mg/ml蛋白A等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol/LpH7.4PB（含有0.1mol/LEDTA、1mol/L碘乙酰胺、1%BAS和0.1%NaN3），0~4℃保存。

4．蓝色荧光素标记抗体方法

Kbaffan等（1986）首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双标记或多标记。

（1）取7-氨基-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin,AMC）260μg溶于二甲亚砜25μl中。

（2）将上液加入10mlIgG- 巴比妥缓冲液（0.5mol/L,pH8.5,内含50~100mgIgG）中，室温反应2h，过SephadexG-50除去游离荧光素,最大荧光波长430nm,最大吸收波长354nm。

（三）荧光抗体的质量控制

1．染色特异性和敏感性的测定方法

（1）特异性染色和效价测定直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如1：

2，1：

4，1：

8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度（效价）或单位。

实际染色应用时，可取低一个或两个稀释度（即2~4个单位），如染色效价为1：

64，实际应用时可取1：

32或1：

16。

间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价和直接法相同。

（2）非特异性染色测定根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。

（3）吸收试验在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜，3000r/min,离心30min，收集上清液，再用于相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。

2．F/P比值的测定方法

F（荧光素）和P（抗体蛋白）的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求F/P的克分子比值为1~2。

过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。

（1）蛋白质定量测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。

（2）结合荧光素定量先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC1mg，溶于10ml0.5mol/LpH9.0碳酸盐缓冲液中，再用0.01mol/LpH7.2PBS稀释到100ml，此时荧光素含量为10μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值（OD），以光密度为纵坐标，荧光素含量为横座标，作标准函数图。

荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。

F/P比值的计算：

可按以下公式计算。

FITCg/ml160000×103FITCg/ml

F/P克分子比值=———————×——————=0.41×

蛋白质mg/ml