分子实验室细胞实验室常用配方.docx

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分子实验室细胞实验室常用配方

分子实验室、细胞实验室常用配方

2

（一）WB相关试剂及常用缓冲液

●RIPA（100mI）（最后要调pH为7.4）

终浓

度

Tris-HCI（pH7.450m

分子量称取

121.14605.7mg

）

NaCI

TritonX-100脱氧胆酸钠

M

150

mM

1%

1%

58.44

876.6mg

1mI

1g

EDTA

1mM292.2429.2248m

8

g

SDS

PMSF

（100mM）

0.1%

0.1g

使用时每

1ml加10ul

●10%过硫酸铵溶液AP（分装保存于-20度）

AP粉末1g

ddH010ml

2

●10％SDS（十二烷基硫酸钠）：

SDS粉末10g

ddH0定容到100ml

2

2

3

注意：

用磁力搅拌器搅拌不会容易起泡泡

●6X蛋白质samplebuffer

Tris-HCl（1M,pH6.8）

30mL

SDS

甘

30mL

10g

油

DTT（154.25）9.3g

溴

酚

蓝

0.06g

ddH0

2

容至100mL

●10XPBS缓冲液的配制：

NaCl80g

KCl2g

定

NaHPO

2

4

14.4g（十二水合

36g）

KHPO02.4g

24

加800mLddHO,根据开始的pH用NaOH或HCL调

2

pH到7.4，调好pH再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存最好是在4度

3

4

●PBST（1X）

PBS（1X）500ml

Tween20500μl

●50×Tris-乙酸（TAE）缓冲液配制1L溶液各成分的用量

Tris粉末242g

冰醋酸57.1ml

NaEDTA·2HO37.2g

22

ddH0定容到1L

2

●封闭液

脱脂奶粉5g

叠氮钠0.02g（现配现用时可不加）

PBS

100mL

●染色液（室温）

1L500ml200ml100ml

定容到

甲醇500mL250

100

50

乙酸100

50

20

10

R250考马斯亮蓝

mL

0.5g0.250.1g0.05

4

5

H0

2

400

g

20080

g

40

●

mL

脱色液：

（室温）

甲醇165mL

乙酸50mL

H0785mL

2

●8.8Buffer:

（调pH至8.8,4度保存）

Tris

10%SDS

100ml

18.17g

4mL

200ml

36.34g

8ml

ddH0

2

定容至200ml

100mL

●6.8Buffer:

（调pH至6.8,4度保存）

Tris

10%SDS

100ml

6．06g

4mL

200ml

12.12g

8ml

ddH0

2

定容至200ml

100mL

5

6

●转移缓冲液（10×transbuffer）：

（常温保存）

1L2L

甘氨酸144g288g

Tris粉30.3g60.6

末

ddH0

2

定容至

定容至

1L2L

使用时甲醇200mL转移缓冲液（10×）100mLddH0700mL

2

●电泳缓冲液（10×）（runningbuffer）：

（常温保存）

1L2L

甘氨酸144g288g

Tris粉30.3g60.6

末

SDS10g20g

ddH0

2

定容至

定容至

1L2L

●10Х）TBS:

（常温保存）

NaCl80.0g

6

7

Tris粉末24.2g

ddH0

2

定容至1L

●TBST（1X）

TBS（1X）500ml

Tween20500μl

●Strippingbuffer（可反复利用）温老师组配方

10%SDS10ml

Β-巯基乙醇350l

Tris-HCI（pH6.8）6.25ml（6.06加到50mL水）

加入ddHO

2

至50mL

●Strippingbuffer（可反复利用）郭老师给配方

甘氨酸15g

SDS1g

Tween201ml

ddddHO1L

2

作这个buffer洗20min，然后用PBST洗3次，再重新封闭孵抗体。

7

8

8

9

（二）细胞和细菌培养基、抗生素●LB培养基（当天灭菌后放4度存放）

1000ml500ml300ml250ml200ml

氯化10g

5g

3g

2.5g

2g

钠

蛋白10g

5g

3g

2.5g

2g

胨

酵母5g

2.5g

1.5g

1.25g1g

提取

物

ddH0

2

定容至定容至定

容定容至定容

1000ml500ml

至

300ml

250ml

至

200ml

●LB平板：

（当天灭菌后倒平板，放4度存放）

1000ml500ml300

ml

250ml200ml

氯化10g5g

3g

2.5g2g

9

10

钠

蛋白10g

胨

酵母5g

5g

2.5g

3g2.5g2g

1.5g1.25g1g

提取

物

琼脂15g7.5g4.5g3.725g3g

ddH0

2

定容至定容至定容定容至定容

1000ml500ml

至

300ml

250ml

至

200ml

SOB培养基

将下列组分溶解在0.9L水中：

蛋

白

胨

20g

酵母提取物5g

氯

0.5g

化

钠

1mol/L

2.5ml

氯化钾

用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml的小

10

11

份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁

●1MIPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3））溶液

IPTG粉末2.383g

ddH0定容到10ml

用0.22μm滤器过滤2除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。

●Amp+（50mg/ml）

Amp+粉末50mg

ddH01ml

注意：

分装保存于-20度，使用时按1000：

1的比例用

●Kana+（50mg/ml）

Kana+粉末50mg

ddH201ml

注意：

分装保存于-20度，使用时按1000：

1的比例用

●胰酶：

抽滤，长期保存可放负20度

粉末0.25g

EDTA0.02-0.03g

1XPBS100ml

●高糖DMEM培养基：

抽滤保存在4度

粉末

全部

碳酸氢钠3.7g

ddH0

2

调pH值到：

7.2-7.4）

定容到1L（用盐酸

11

12

●G418母液（100mg/ml）用0.22M滤菌，分装存于-20度

粉末1g

PBS10ml

●zeocin母液（100mg/ml）用0.22M滤菌，分装存于-20度

粉末1g

ddH2O10ml

●Blasticidin（100mg/ml）用0.22M滤菌，分装存于-20度

粉末0.3g

PBS10ml

12

13

（三）利用His-tag从细菌中纯化蛋白配方透析液配方

终浓度

母液浓量取体

Tris-HCl（pH:

8.0）20mM

13

度

1M

积

20ml

溶解

14

NaCl

MgCl

2

20mM

2mM

4M

1M

5ml

2ml

DTT

1mM

1M

1

ml

甘油

ddHO

2

50%

500

472

ml

ml

●

超声裂解液（lysisbuffer）

：

2011年做蛋白纯化时用

NaPO（164）8.2g（50mM）

34

NaCl（58.5）17.55g（300mM）

加800mLddHO溶解，用2MNaOH或者

2

2MHCL调pH到8.0，再定容到1升。

配好后用高压蒸气灭菌后常温保存。

洗涤液（washbuffer）

●

：

2011年做蛋白纯化时用

NaPO

3

4

8.2g（50mM）

NaCl17.55g（300mM）

咪唑0.681g（10mM）

加800mLddHO,根据开始的pH用2MNaOH或

2

者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升

●洗脱液（elutionbuffer）

：

2011年做蛋白纯化时用

14

溶解

15

NaPO

3

4

8.2g（50mM）

NaCl17.55g（300mM）

咪唑17.025g（250mM）加800mLddHO,根据开始的pH用

2

2MNaOH或者2MHCL调pH到8.0，调好pH再定容到1升）

PrepEase®Histidine-TaggedProteinPurificationKits-HighSpecificity

●8XLEWBuffer（Lysis-Equilibrium-WashBuffer）：

（室温保存）pH：

8.0

NaHPO.2HO6.2404g（400mM）242

NaCl14.0256g（2.4M）

dH0

2

定容到100mL

（调节pH：

8.0）

●4XElutionBuffer：

（室温保存）pH：

8.0

NaHPO.2HO3.1202g242

（200mM）

NaCl7.0128g

（1.2M）

咪唑6.81g（1M）15

16

dH0

2

（调节pH：

8.0）

●EDTA:

（100mM）

定容到100mL

EDTA2.923g

dH0

2

定容到100mL

●NiSO:

4

NiSO

4

.6HO2.6285g

2

（100mM）

dH0

2

定容到100mL

●溶菌酶：

（使用时1ml溶液加入20ul）粉末50mg

ddH201mL

16

17

17

18

（四）利用His-tag从细胞中富集蛋白配方

●磷酸钠缓冲液

按图示比例混合0.2MNaHPO溶液和0.2

24

MNaHPO溶液，得到两种缓冲液，pH分别调节成24

为8.0和6.3.

pH

0.2MNaHPO体积0.2MNaHPO体积

2424

6.3

8.0

/mL

11.25

47.35

/mL

38.75

2.65

●细胞裂解液（最好新鲜配制，当天使用）

Cell

终

配

配

配

配

配

lysis

buffer

浓10ml15ml20ml40ml30ml度

盐酸胍

（g）

6

M

5.73

18

8.59

77

11.4

636

22.9

272

17.1

954

18

19

Tris（g）10.010.010.020.040.03

021148171422884566342m

M

pH

8.0buffe

r（ml）

1

0

0

m

M

57.5102015

（注意胍盐是有害试剂注意这里用的磷酸钠缓冲液pH必须8.0!

）

（注意二价阳离子螯合剂，还原剂，会导致镍从树脂上的洗脱）

本实验的所有试剂中EDTA浓度不得超过1mM,DTT浓度不超过5mM，巯基乙醇浓度不超过20mM。

pH8.0的洗脱溶液（最好新鲜配制，当天使用）

pH8.0的

终浓

配

配

配

配

配

wash

度10050m20ml40ml30ml

buffer

ml

l

19

20

Urea尿素

（g）

8M48.24.9.6019.214.404802496192144

Tris（g）10mM0.10.00.020.040.03

21160542288456634247

pH8.0NaPO

3

4

100502510

20

15

buffer（ml）mM

Triton

0.1%1005020

40

30

X-100（ul）（vol

/vol

）

b-mercapto5mM3517.

71410.5

ethanol.巯基乙醇（ul）

5

pH6.3washbuffer（现配现用）

pH6.3的

终浓100

配

配

pH6.3的

wash

度

ml50m30m

wash

buffer

l

l

buffer

Urea尿素

（g）

Tris（g）

8M48.24.14.

048024414

4

100.10.00.0

20

Urea尿素

（g）

Tris（g）

21

mM211605363

4

742

pH6.3NaPO

3

100502515pH6.3Na3PO

4

buffer（ml

）

Triton

mM

0.1%1005030

4buffer（ml

）

Triton

X-100（ul）（vol

/vol

）

X-100（ul）

注意使用pH为6.3的磷酸缓冲液，而且pH不得低于6，pH要精确配制，非常重要！

Histidine的质子化，会导致镍树脂上的解离，所以要精确测定pH，并且以pH试纸校对，而不是仅仅依靠pH仪器。

洗脱溶液

200mMImidazole咪唑，

5%（wt/vol）SDS，

150mMTris-HCl（pH6.7）30%（vol/vol）丙三醇720mM巯基乙醇

21

22

0.0025%（wt/vol）溴酚蓝

注意wt/vol是质量/体积之比例，而vol/vol是体积：

体积的比例。

22

23

（五）双向电泳溶液配制

水化上样缓冲液（I）：

尿素（8M）

CHAPS（4%）

DTT（65mM）

加）

23

4.805g

0.4g

0.098g（现

24

Bio-Lyte0.2%（w/v）

50I（40%

现加）

溴酚蓝0.001%10I（1%溴

酚蓝）

MilliQ水

定容到

10mI,分装成10小管，-20度冰箱保存

●上样缓冲液（II）：

尿素（7M）4.2g硫脲（2M）1.52gCHAPS（4%）0.4gDTT（65mM）0.098g（现加）

Bio-Lyte0.2%（w/v）

50I（40%现加）

溴酚蓝0.001%10I（1%溴酚蓝）

MilliQ水

装成10小管，-20度冰箱保存●上样缓冲液（III）

定容到10mI,分

尿素（5M）3g

硫脲（2M）1.52gCHAPS（2%）0.2g

SB3-10（2%）0.2gDTT（65mM）0.098g（现加）

Bio-Lyte0.2%（w/v）

24

50I（40%现加）

25

溴酚蓝0.001%10I（1%溴酚蓝）

MilliQ水

装成10小管，-20度冰箱保存●平衡缓冲液母液

定容到10mI,分

尿素（6M）36g

SDS（2%）2g

Tris-HCI（pH8.8）0.375M25mI（1.5M）甘油（20%）20mI

MilliQ水

定容到100mI，分

装10管，-20度保存

●胶条平衡缓冲液I（充分混匀，用时现配）

胶条平衡缓冲液母液

10mI

DTT0.2g

●胶条平衡缓冲液II（充分混匀，用时现配）

胶条平衡缓冲母液碘乙酰胺

●低熔点琼脂糖封闭液

10mI

0.25g

低熔点琼脂糖0.5%0.5g

Tris（25mM）

0.303g

甘氨酸（192mM）1.44g

SDS（0.1%）溴酚蓝（0.001%）

1mI（10%SDS）100I（1%溴酚

25

26

蓝）

MilliQ水

热溶解至澄清，室温保存

定容到100mI,加

（六）同位素实验相关试剂BERreactionbuffer（10ml,分装于-20度）

分子配

称取

终浓

量

10ml

母液

度

Hepes-KOH（p

H7.8）

KCI

238.1M称

312.383

1g

74.51.4M

0.4mI40m

M

0.5mI70m

5

称

1.043

7g

M

DTT154.1M称

10I1mM

EDTA·2Na

25

1.542

5g

372.1M称

5I0.5m

23

3.722

3g

M

26

22

2

27

MgCI·6HO203.1.4M

50I7mM

30

称

2.846

2g

ATP

ddHO

100m0.2mI2mM

M

8.835

mI

●2XligaseIactivitybuffer

终浓度

母液

配

10ml

Hepes（pH7.5）60mM

1M

取

0.6ml

KCl

MgCI·6HO

22

DTT

BSA

ddHO

2

60mM

16mM

2mM

200g/ml

1M

1M

1M

0.6ml

0.16ml

0.02ml

2mg

至10ml

●2XAnnealingbufferTris-HCI（pH7.5-8.0）20mM

NaCI

100mM

27

28

EDTA

2mM

●2X同位素反应buffer（polymerasebeta聚合反应）

终浓度

母液

10ml

Tris-HCl

100mM（pH8.0）1M

1ml

MgCI·6HO20mM

22

1M

0.2ml

DTT

NaCl

甘油

ddHO

2

4mM

40mM

20%

1M

4M

0.04ml

0.4ml

2ml

至10ml

●2XAPE1活力鉴定buffer

Trls-HCL

终浓度

100mM

母液

1M

配10ml

1ml

（pH8.0）

KCl

60mM

1M

0.6ml

MgCl2·6H2O10mM

1M

0.1ml

甘油

ddHO

2

20%

2ml

至10ml

●同位素电泳上样buffer（2X）（100ml）

终浓度

取

28

29

甲酰胺染料EDTA·Na2

90%

30mM

90ml

111.669gX10

-2

溴酚蓝（17kd）0.02%

0.02g

二甲苯蓝

0.02%

0.02g

●10XTBEbuffer

Tris0.89M26.945g硼酸（pH8.3）0.89M13.757gNa2EDTA20mM1.86115g●15%DenaturedDNAPAGEgel（100ml）10XTBE15ml

40%,19:

1gelstock37.5ml

ddH2O16ml

Urea

48g

存放在4度，使用前加200l10%AP和20lTEMED

●20%DenaturedDNAPAGEgel

10XTBE15ml

40%,19:

1gelstock50ml

ddH2O3.5ml

Urea（尿素）48g

存放于4度，使用前取35ml混合液加140l10%AP和140lTEMED

29

30

●硼氢化钠（1M）37.83

粉末0.7566g

ddHO10ml

2

●2XdRPbuffer（分装保存于负20度）

分子量母液终浓配10ml度

Hepes（pH7.5）238.311M

MgCl2·6HO203.301M

2

100mM1ml

20mM0.2ml

●

KCl

DTT

ddHO

2

74.551M

40mM0.4ml

154.251M

4mM0.04ml

8.36ml

DNAbindingbuffer

终浓母分子配度

液量250ml

Tris-HCI（pH8.0）50mM1M

12.5

NaCl

MgCl·6HO

22

Glycerol

NP-40

100mM

10mM

10%

0.1%

58.31.4625g

203.30.51g

25ml

0.25ml

30

31

（七）酶切打质谱相关配方

NHHCO（79.06）100mM

43

粉末0.7906g

ddHO定容到100ml,pH7.8-8.02

DTT（154.25g）100mM

粉末0.01542g

ddHO1ml

2

IAA（碘乙酰胺，184.96）200mM

31

24

32

粉末0.036992g

ddHO1ml

2

（八）其他配方

●2XHEPES-缓冲液（潘老师给的配方做细胞转染，需要调pH为7.05，用0.22M滤菌，分装存于-20度）。

NaCI

KCI

分子量

58.5

74.55

终浓度

280mM

10mM

称取

1.6g

0.074g

NaHPO141.96

1.5mM

0.021g

葡萄糖

HEPES

ddH0

2

180.06

238.31

12mM

50mM

0.21g

1.19g

定容到

●CaCI2·2H2O（2M）147.02方做细胞转染

80ml

潘老师给的配

粉末5.88g

ddHO20ml

2

0.22m滤菌，分装存于-20度

32

33

●5XTBS（1L体系）（在利用flagtag带磁珠的抗体富集蛋白时用）

Tris-HCI（250mM）30.275g

NaCI（750mM）43.875g

ddH0

2

定容至1L

（调节pH为7.4）

●MMS甲磺酸甲酯（Sigma密度为1.3g/mI,M=110.13）

1M体系：

液体85IddHO915I

2

●Hochest

母液：