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生物化学第四章核算化学刘博整理
第四章核酸化学
第一节导言
一、核酸分类和分布
脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid,DNA）:
遗传信息的贮存和携带者，生物的主要遗传物质。
在真核细胞中，DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中均有各自的DNA。
原核细胞没有明显的细胞核结构，DNA存在于称为类核的结构区。
每个原核细胞只有一个染色体，每个染色体含一个双链环状DNA。
核糖核酸（ribonucleicacid,RNA）：
主要参与遗传信息的传递和表达过程，细胞内的RNA主要存在于细胞质中，少量存在于细胞核中，病毒中RNA本身就是遗传信息的储存者。
另外在植物中还发现了一类比病毒还小得多的侵染性致病因子称为类病毒，它是不含蛋白质的游离的RNA分子，还发现有些RNA具生物催化作用（ribozyme）。
细胞核RNA
1、mRNA与hnRNA
mRNA约占细胞RNA总量的5%，是蛋白质合成的模板。
真核生物mRNA的前体在核内合成，
包括整个基因的内含子和外显子的转录产物，形成分子大小极不均匀的hnRNA。
2、snRNA
snRNA主要存于细胞核中，占细胞RNA总量的0.1~1%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在，在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、协助细胞内物质运输、构成染色质等方面有重要作用。
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二、核酸研究简史
1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时,发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物,并在所有细胞的核里都找到了此物质,故命名核质（Nuclein）。
1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成部分:
A,T,C和G。
1889年Altman建议将核质改名为“核酸”,并且已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。
1909年Levene发现酵母的核酸含有核糖。
1930年Levene发现动物细胞的核酸含有一种特殊的核糖即脱氧核糖,得出了一个错误概念:
植物核酸含核糖,动物核酸含脱氧核糖。
这个错误概念一直延续到1938年，这时方清楚RNA和DNA的区别。
Levene还提出了核酸的“磷酸-核糖（碱基）-磷酸”的骨架结构,解决了DNA分子的线性问题,还在1935年提出“四核苷酸”学说,认为这四种核苷酸的聚合体是构成核酸的基本单位。
1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。
1952年Hershey&Chase的噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质
1950年Chargaff,E和Hotchkiss,R.D.采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分,得知[A]=[T],[G]=[C],[A+G]=[C+T]
1953年Watson,Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果,提出了DNA的双螺旋模型（Doublehelix）。
几星期后提出了半保留式复制模型。
1957年MeselsonStahl用密度梯度超离心法,证实半保留复制假说。
1958年Kornberg得到高纯度的DNApolymerase,这种酶需要一个模板DNA。
1960年Cairns拍摄了复制中的细菌DNA的电镜照片。
1970年发现第一个DNA限制性内切酶。
1972年建立DNA重组技术。
1978年建立DNA的双脱氧测序法。
1990年开始实施人类基因组计划。
2003年人类基因组计划宣告完成测序任务。
三、核酸的生物功能
（一）DNA是主要的遗传物质
1928年Griffith的细菌转化实验
1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验，证明DNA是遗传物质。
但人们对此持怀疑态度，理由是：
（1）因认为蛋白相对分子质量大，结构复杂，二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字，可作为一种遗传信息。
而DNA相对分子质量小，只含4种不同的碱基，人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异。
（2）认为转化实验中DNA并未能提得很纯，还附有其它物质。
（3）即使转化因子确实是DNA，但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应，而不是充当遗传信息的载体。
噬菌体感染实验1952年美国Hershey噬菌体感染实验
（二）RNA功能的多样性
1.某些病毒的遗传物质;
2.控制蛋白质的合成;
3.遗传信息的加工;
4.基因表达和细胞功能的调控;
5.催化功能;
6.在细胞分化和个体发育中发挥重要作用;
7.在生命起源中可能有重要作用。
各类RNA的重要功能
RNA种类
功能
mRNA
将信息从基因传递到蛋白质
tRNA
携带活化氨基酸参与蛋白质生物合成
rRNA
构成核蛋白体（蛋白质合成场所）
SnRNA
参与mRNA前体剪接加工
M1RNA
RNaseP的催化单体
端粒酶RNA
端粒合成的模板
引物RNA
起始DNA复制
第二节核酸的组成成分
一、元素组成
经元素分析证明，核酸由碳、氢、氧、氮、磷5种元素组成，其中磷的含量在各种核酸中变化范围不大，大约占整个核酸重量的9.5%左右，即1ｇ磷相当于10.5ｇ核酸。
因此在核酸的定量分析中可通过含磷量的测定来估算核酸的含量。
这是定磷法的理论基础。
核酸含量=含磷量×10.5二、核糖和脱氧核糖
三、嘌呤碱和嘧啶碱化学式
碱基的氨基态与亚氨基态互变异构
四、核苷
五、核苷酸核苷-5´-磷酸的基本结构（N=A、G、C、U、T）
碱基、核苷、核苷酸的关系
腺嘌呤核苷酸（AMP）Adenosinemonophosphate
鸟嘌呤核苷酸（GMP）
胞嘧啶核苷酸（CMP）
尿嘧啶核苷酸（UMP）
脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）Deoxyadenosinemonophosphate
脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGMP）
脱氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）
脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）
cAMP（cGMP）的结构Cyclicadenylie（Guanine）acid几种修饰核苷酸
各种核苷三磷酸和脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA和DNA合成的直接原料。
在体内能量代谢中的作用：
ATP——能量“货币”UTP——参加糖的互相转化与合成
CTP——参加磷脂的合成GTP——参加蛋白质和嘌呤的合成
第二信使——cAMP
两类核酸的基本成分
成分
RNA
DNA
磷酸
磷酸
磷酸
戊糖
D-核糖
D-2-脱氧核糖
嘌呤碱
A、G
A、G
嘧啶碱
C、U
C、T
（五）一些重要的核苷酸
能量物质：
ATP等；酶辅助因子：
NAD+、NADP+和FAD等；
信号传导：
环腺苷酸（cyclicAMP,cAMP）,环鸟苷酸（cyclicGMP,cGMP）;
重要代谢中间物：
SAM、UDPG、CDP-胆碱（乙醇胺）等。
第三节RNA的结构
一、RNA的种类和分布
（一）细胞质RNA
1.rRNA（核糖体RNA）RibosomeRNA
约占全部RNA的80%，与蛋白质（40%）共同组成核糖体。
是核糖核蛋白体的主要组成部分。
rRNA的功能与蛋白质生物合成相关。
2.tRNA（转移RNA）TransferRNA
约占总RNA的10-15%。
它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体的作用。
已知每一个氨基酸至少有一个相应的tRNA。
RNA分子的大小很相似，链长一般在73-78个核苷酸之间。
3.mRNA（信使RNA）MessengerRNA
约占总RNA的5%。
不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大。
它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质。
（二）其他小分子RNA
除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA（smallnon-messengerRNAs,snmRNAs）。
snmRNAs的种类:
核内小RNA核仁小RNA胞质小RNA催化性小RNA小片段干涉RNA
snmRNAs的功能:
参与hnRNA和rRNA的加工和转运。
（三）核酶
催化性RNA（ribozyme）作为序列特异性的核酸内切酶。
具有自我催化能力，完成rRNA的剪切拼接。
二、RNA的一级结构
概念：
RNA分子的一级结构就是指组成RNA分子的核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链中核苷酸的排列顺序（碱基序列）。
一级结构的走向的规定为5´→3´。
不同的RNA分子具有不同的核苷酸排列顺序。
常碱基序列由RNA链的5′→3′方向写。
RNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的RNA链中可能有的不同序列总数为4n。
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（一）核苷酸的连接方式4546
磷酸二酯键书写方法：
5pApCpTpGpCpT-OH35ACTGCT3
读向：
碱基序列从左到右表示5’—3’，由3’,5’-磷酸二酯键连接。
若两链反向平行，则需注明每条链的走向。
如：
5’A-T-G-C-C-T-G-A3’3’T-A-C-G-G-A-C-T5’
（二）RNA一级结构的特点
tRNA：
5末端磷酸化；3末端为CCAOH；多修饰成分；
rRNA：
5S：
5末端pppU；3末端为UOH；43~47位为CGAAC，与tRNA相互识别、相互作用的部位；16S3末端为ACCUCCU，mRNA识别部位；
mRNA：
真核细胞mRNA的3‘-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸（polyA），称为“尾结构”，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。
（三）核酸的降解
将大分子核酸分解成若干个小分子片段。
1.化学降解
1）碱降解：
稀碱液可将核酸水解。
得到2′-核苷酸，3′-核苷酸。
与DNA不同。
2）酸水解：
不同浓度的酸可使RNA降解成各种不同产物。
2.酶法降解
特异性降解RNA的酶，称为核糖核酸酶。
核酸酶是在实验室中切割和操作核酸的工具。
生物体内存在多种核酸水解酶。
这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。
根据作用方式又分作两类：
核酸外切酶和核酸内切酶。
核酸外切酶的作用方式：
是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；
核酸内切酶的作用方式：
和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。
在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。
这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。
核酸酶的分类
1）根据对底物的专一性分为核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，非特异性核酸酶
2）根据切割位点分为核酸内切酶，核酸外切酶
核酸酶的作用特点
外切核酸酶对核酸的水解位点
牛脾磷酸二酯酶（5´端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3´端外切3得5）52
限制性内切酶：
原核生物中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列，并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末端，这类酶称为限制性内切酶（ristrictionendonuclease）。
限制性内切酶的命名和意义
例：
EcoRI，这是从大肠杆菌（E.coli）R菌珠中分离出的一种限制性内切酶
E属名co种名R株名I序号
限制性内切酶是分析染色体结构、制作DNA限制图谱、进行DNA序列测定和基因分离、基因体外重组等研究中不可缺少的工具，是一把天赐的神刀，用来解剖纤细的DNA分子。
限制性内切酶可分为三类
限制性内切酶
酶分子
识别位点
切割位点
限制作用是否需用ATP
Ⅰ类
三亚基双功能酶
非对称
至少在识别位点外1000bp
Yes
Ⅱ类
内切酶与甲基化酶分子不在一起
4-6bp,大多数为回文对称结构
在识别位点中或靠近识别位点
No
Ⅲ类
二亚基双功能酶
5-7bp非对称
在识别位点下游24-26bp
Yes
Ⅱ类限制性内切酶
Ⅱ类酶切割位点在识别序列（4－6bp）中，有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ:
5‘-CCC↓GGG-3’）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'。
3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'
三、RNA的高级结构
RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。
RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构，不能形成双螺旋的部分，则形成突环。
这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。
在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。
G除了可以和C配对外，也可以和U配对。
G-U配对形成的氢键较弱。
不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。
tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分。
（一）tRNA高级结构
tRNA二级结构：
三叶草形模型
主要特征：
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1.四臂四环；
2.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构；
3.D环上有二氢尿嘧啶（D）；与氨基酰-tRNA合成酶的结合有关；
4.反密码环上的反密码子；与mRNA相互作用；
5.可变环上的核苷酸数目可以变动；决定着tRNA分子大小；
6.TψC环含有T和ψ；与核糖体的结合有关；
7.含有修饰碱基和不变核苷酸。
tRNA的三级结构
tRNA的三级结构的形状像一个倒写的L字母。
它是在二级结构三叶草形的基础上进一步扭曲、折叠而成的。
氨基酸臂处在倒L的一端并与TψC臂形成双股螺旋；倒L的另一端为反密码子环，二氢尿嘧啶茎与反密码子臂形成双螺旋；在倒L的拐弯处是TψC环和二氢尿嘧啶环。
整个分子为扁平状，厚度约2nm，两端间直线距离约7nm，以氢键和疏水作用力维持倒L结构。
tRNA形成三级结构的共性：
折叠后形成大小相似、三维构象相似的结构，有利于携带氨基酸的tRNA进入核糖体的特定部位。
（二）rRNA的高级结构
rRNA的二级结构是由部分双螺旋和部分单链突环相间排列而成。
第四节DNA的结构
一、DNA一级结构
（一）概念
概念：
DNA分子中脱氧核苷酸的排列顺序，即碱基的排列顺序。
连接键：
3,5-磷酸二酯键,即第一个核苷酸糖环上原来游离的C-3羟基与第二个核苷酸C-5磷酸组成3，5磷酸二酯键。
二个游离末端:
5末端（游离磷酸基）,3末端（游离羟基）。
（二）真核细胞DNA一级结构的特点
1.间隔顺序和插入顺序
间隔顺序：
基因之间的不编码的DNA片段。
插入顺序：
基因内的不编码的DNA片段。
又称为内含子。
外显子：
基因内为蛋白质编码的片段。
有断裂基因：
由于基因中内含子的存在。
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内含子（intron）：
基因中不为多肽编码，不在mRNA中出现。
外显子（exons）：
为多肽编码的基因片段。
例外：
组蛋白基因（histongene）和干扰素基因（interferongene）没有内含子。
2.重复序列
单拷贝序列在整个DNA中只出现一次或少数几次，主要为编码蛋白质的结构基因。
中度重复序列在DNA中重复几十次到几千次。
高度重复列可重复几百万次
高度重复序列一般富含A-T或G-C，富含A-T的在密度梯度离心时在离心管中形成的区带比主体DNA更靠近管口；富含G-C的更靠近管底，称为卫星DNA（satelliteDNA）
3.回文结构：
真核细胞DNA分子中具有180°旋转对称，反向重复的特殊序列。
二、DNA的二级结构
1953年，Watson和Crick提出。
（一）双螺旋结构的主要依据
（1）Wilkins和Franklin发现不同来源的DNA纤维具有相似的X射线衍射图谱。
（2）电位滴定证明，嘌呤与嘧啶的可解离基团由氢键连接。
（3）已知核酸化学结构和核苷酸键长与键角的数据。
（4）Chargaff定则
Chargaff首先注意到DNA碱基组成的某些规律性，在1950年总结出DNA碱基组成的规律：
腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T。
鸟嘌呤和胞腺嘧啶的摩尔数相等，即G=C。
含氨基的碱基总数等于含酮基碱基总数，即A+C=G+T。
嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T。
DNA的双螺旋结构的形成：
DNA分子由两条DNA单链组成。
DNA的双螺旋结构是分子中两DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。
双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。
DNA双螺旋结构特征
（4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。
纵向靠碱基平面之间的碱基堆积力（即疏水作用）维持其稳定性。
DNA双螺旋的构象类型
A-DNA：
75%相对湿度，与溶液中DNA-RNA杂交分子的构象相似，推测转录时发生B→A。
其碱基平面倾斜20°，螺距与每一转碱基对数目都有变化。
B-DNA：
92%相对湿度，接近细胞内的DNA构象，与Watson和Crick提出的模型相似。
Z-DNA：
主链呈锯齿型左向盘绕，直径约1.8nm，螺距4.5nm，每一转含12个bp，只有小沟。
B-DNA与Z-DNA的相互转换可能和基因的调控有关。
C-DNA：
44~46%相对湿度，螺距3.09nm，每转螺旋9.33个碱基对，碱基对倾斜6°。
可能是特定条件下B-DNA和A-DNA的转化中间物。
D-DNA：
60%相对湿度，DNA中A、T序列交替的区域。
每个螺旋含8个bp，螺距2.43nm，碱基平面倾斜16°。
DNA的双螺旋结构模型的意义
该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。
该模型的提出是二十世纪生命科学的重大突破之一，它奠定了生物化学和分子生物学乃至整个生命科学飞速发展的基石。
三DNA的三级结构
DNA的三级结构指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象－－超螺旋结构。
大部分原核生物的DNA是共价封闭的环状双螺旋，这种双螺旋还可以再次螺旋化形成超螺旋。
当引进的张力与原先右手螺旋的方向相同时，超螺旋的方向是左手的，称为正超螺旋（变紧）；引进张力与原先右手螺旋方向相反时，超螺旋的方向是右手的，称为负超螺旋（变松）。
正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的，负超螺旋是放松双螺旋后形成的。
L=T+WW：
为超螺旋数或缠绕数。
T：
为扭转数，是指双链环绕螺旋轴旋转的周数。
L：
连环数，是指双螺旋结构中一条链以右手螺旋缠绕另一条链的交叉次数。
DNA超螺旋结构形成的重要意义
使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中；
推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。
如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。
DNA在真核生物细胞核内的组装
真核生物染色体由DNA和蛋白质构成，其基本单位是核小体（nucleosome）。
核小体的组成：
DNA：
约200bp组蛋白：
H1，H2A，H2B，H3，H4
第五节核酸的性质
一、性状和溶解性
1.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，均微溶于水，不溶于有机溶剂。
2.DNA溶液的粘度高，而RNA溶液要小得多。
3.RNA能在室温条件下被稀碱水解而DNA对碱稳定。
4.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。
5.DNP和RNP的溶解度受溶液盐浓度的影响而不同。
6.0.14摩尔法
DNP在0.14mol/L氯化钠溶液中时，溶解度最低。
RNP在0.14mol/L氯化钠溶液中溶解度较大。
可用0.14mol/L氯化钠溶液分别提取DNP和RNP，然后用蛋白质变性剂除去蛋白质。
二、核酸及其组分的两性性质
1.带电性：
与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质，并有等电点。
由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。
如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。
RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。
DNA没有这种作用。
2.多价解离：
含有多个磷酸基团，可解离成多阴离子态。
三、核酸的紫外吸收性质
核酸的碱基具有共轭双键，因而有紫外吸收性质，吸收峰在260nm（蛋白质的紫外吸收峰在280nm）。
核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少30~40%，当核酸变性或降解时光吸收值显著增加（增色效应），但核酸复性后，光吸收值又回复到原有水平（减色效应）。
增色效应（hyperchromiceffect）：
当DNA双螺旋融解（解链）时，260nm处紫外吸收增加的现象。
减色效应（hypochromiceffect）：
随着核酸复性，紫外吸收降低的现象。
1定量测定核酸和核苷酸的方法88
核苷酸百分含量：
核苷酸％＝Mr×A260/ε260×100
核酸测定：
比吸收系数摩尔磷原子吸收系数ε（P）
2．摩尔磷消光系数（molarabsorptivity）法89
四、核酸的变性
双螺旋区氢键和碱基堆积力断裂，空间结构破坏，形成单链无规线团状，只涉及次级键的破坏。
DNA变性是个突变过程，类似结晶的熔解。
将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔融温度（meltingtemperature,Tm）。
也可指增色效应达50%时的温度。
定义：
在某些理化因素作用下，破坏氢键和碱基堆积力，使核酸分子的高级结构改变，引起核酸理化性质及生物学功能改变的过程。
方法：
加热，过量酸，碱，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。
变性后其它理化性质变化：
OD260增高，粘度下降，比旋度下降，浮力密度升高，酸碱滴定曲线改变，生物活性丧失
当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。
DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收（260nm）值升高,粘度降低等。
RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。
利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。
例如，天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收（260nm）值增加25－40%，而RNA变性后，约增加1.1%。
产生增色效应。
影响Tm的因素：
（1）G-C的相对含量（G+C）%=（Tm—69.3）×2.44
（2）介质离子强度低，Tm低。
（3）高pH下碱基广泛去质子而丧失形成氢键的能力。
（4）变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。
核酸的复性（退火）
变性核酸的互补链在适当条件（去除变性条件等）下重新缔合成双螺旋的过程
减色效应（hypochromiceffect）：
随着核酸复性，紫外吸收降低的现象。
影响复性速度的因素：
（1）单链片段浓度
（2）单链片段的大小（3）片段内重复序列的多少
（4）溶液离子强度的大小（5）溶液温度的高低
五、核酸的含量与纯度测定
一、核酸及其组分含量的测定95
1、紫外吸收法公式
2、定糖法:
苔黑法二苯胺法
3、定磷法无机磷＋钼酸－→磷钼酸－－－→钼蓝
4、琼脂糖凝胶电泳法:
目前分离纯化和鉴定核酸的标准方法
分离范围的大小与凝胶浓度有关。
浓度大，分离较小
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