稻瘟病菌原生质体制备条件优化实验研究精.docx
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稻瘟病菌原生质体制备条件优化实验研究精
稻瘟病菌原生质体制备条件优化实验研究
尹良芬1,
2
八重樫博志3（1.华中农业大学植物科技学院,湖北武汉 430070;2.湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室,
湖北武汉 430070;3.日本佐贺大学农学部,日本佐贺县 840-
8502摘 要:
原生质体的制备一直是现代分子生物学研究的重要内容。
以稻瘟病菌作为供试菌株,优化了其原生质体的制备条件。
优化的原生质体制备条件包括:
使用新鲜的菌丝进行接种;加入玻璃珠一起培养,通过振荡使菌丝体破碎分离以获得更多的生长点;菌悬液继续加入新鲜培养液进行培养;原生质体沉淀时选择3 000r/min离心10min
保证最大限度地收集原生质体。
实验证明,通过这4个条件优化后,原生质体的产量有了极大的提高,每毫升酶液可制备10 8
~1
09个原生质体。
关键词:
原生质体制备;稻瘟病菌;原生质体产量
中图分类号:
Q813.2;Q949.32 文献标志码:
B 文章编号:
1002-
4956（201104-0033-03Optimizing
process of protoplast preparation in Magnaporthe oryzaeYin Liangfen1,
2,Yaeg
ashi Hiroshi 3
（1.College of Plant Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China;2.Key Laboratory of Crop Disease Monitoring and Safety
Control in Hubei,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China;3.Faculty
ofAgriculture,Saga University,Saga 840-8502,Jap
anAbstract:
Protoplast preparation is an important study in modern molecular biology.Several conditions in pre-paring the protoplasts of Magnaporthe oryzae were optimized.The optimized conditions included using freshmycelia of Magnaporthe oryzae strains to inoculate adding glass beads（10mm in diameterin liquid mediumwhile incubating,and shaking vigorously every 4hto encourage uniform growth of mycelium.The cultureswere then transferred to petri dishes with fresh liquid medium and incubated at 30℃for one day.Protoplastswere depostion by centrifugating
at 3 000r/min for 10min,this speed could decrease the loss of protoplastsmostly.After these four conditions optimized,protoplasts were easily
obtained at about 108~109
mL-1.Key
words:
protoplast preparation;magnaporthe oryzae;protoplast yield收稿日期:
2010-06-28
基金项目:
日本教育、文化、体育、科学技术省（文部省基金项目（11660050作者简介:
尹良芬（1974—,女,云南罗平,硕士,实验技术员.E-mail:
yinfangluoy
i@gmail.com 原生质是有组织的生活物质,
是细胞生命活动的物质基础。
细胞内由原生质组成的各种结构统称为原生质体,它们彼此联系、相互影响而构成一个有机整
体,担负着细胞的所有生命活动[
1-
3]。
原生质体具有全能性,
可以在人工控制条件下进行各种各样的操作。
随着现代分子生物学的发展,各种分子生物学技术,诸如转基因工程技术,脉冲场电泳技术,原生质体融合技术等,被越来越多地运用到现代的分子生物学研究中。
这些研究都离不开原生质体的提取跟制备,可以说没有高浓度的原生质体,这些研究也就无法进
行。
因此原生质体制备技术无论在理论上还是实践上都受到人们越来越多的重视。
如何在短期内高效、简便地获得大量的原生质体就成为现代分子生物学研究的一个重点课题。
1 制备原生质体的影响因素
原生质体制备过程中影响其产量的因素很多,归纳起来有:
菌丝体的多少;菌丝的菌龄;酶的浓度;酶解时温度;酶解时间;原生质体收集时的离心速率等。
（1
原生质体产量与菌丝体的多少的关系。
原生质体的产量与菌丝体的多少成严格的正比关系,因此要想增加原生质体的产量就得提高菌丝体的量。
菌丝体的量可以通过延长培养时间以及增加接种种子的量来提高;但延长培养时间会使菌龄增加,最终反而不利于原生质体的释放,所以通常的做法是通过增加接种
ISSN1002-4956CN11-2034T 实 验 技 术 与 管 理Experimental Technology and Management 第28卷 第4期 2011年4月Vol.28 No.4 Ap
r.2011
种子的量,也就是创造更多的生长点来实现菌丝体量的增加。
（2原生质体产量与菌丝菌龄的关系。
菌丝菌龄越低,细胞壁对酶的作用就越敏感,所释放的原生质体的量也就越多。
因为幼龄的菌丝的壁相对较薄,其成分也相对简单,更易于脱除,且原生质体活性高;但随着菌龄的增加,壁生沉积色素等次生物质阻碍酶的作用,使壁难以解体而释放原生质体,因此原生质体的量反而呈明显减少趋势[4]。
（3酶浓度。
由于各种真菌的成分不尽相同,最适宜的酶浓度也就不一样。
酶浓度未达到一定的值时原生质体不易释放出来,但同时,酶中往往含有对原生质体有害的物质,随着酶量的增加,杂质（如过氧化物酶、核糖核酸酶等的浓度也会随之增加,当达到一定浓度时,必然会影响原生质体的活性。
此外,酶浓度过大,细胞脱壁太彻底、易破裂,原生质体量反而下降,因此最佳酶浓度也是原生质体制备的关键因素之一[5]。
（4酶解时的温度。
真菌的最适宜的酶解温度为30~35℃,对于大多数微生物来说,产生原生质体的最适宜酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。
在低于或者高于该温度时,原生质体的产率都有所下降[6-7]。
（5酶解时间。
真菌的原生质体,因缺少细胞壁而变得容易破裂。
酶解过程中,随着时间的增加,原生质体数量达到极限值便不再增加,反而呈下降趋势,这是由于酶解时间过长,酶液对于一些早期释放的原生质体细胞膜有破坏作用,影响原生质体膜的稳定性,导致原生质体破碎,当过量酶解造成原生质体破裂速度大于其形成速度时,就会影响原生质体形成的数量[5]。
（6离心速率。
离心速率过低不利于原生质体沉淀,过高则菌丝等杂质也一起沉淀。
为了保证最大限度地收集原生质体,离心时选择3 000r/min的速率运行10min来收集原生质体[8-12]。
2 材料与试剂
供试菌株:
稻瘟病菌一个组合的亲本菌株SA98-4、Y93-164-1及后代菌株F1-002、F1-057;另一个组合的亲本菌株84R-62B、Y93-245c-2及后代菌株F1-312、F1-326、F1-376、F1-378。
试剂:
CM液体培养基（6g酵母,6g Tryptic Soy-broth,10g蔗糖,定容到1 000mL;OM缓冲液（1.2mol MgSO4和10mmol Na2HPO4,pH值为5.8;山梨醇缓冲液（91g山梨醇溶于1L超纯水中,滤过灭菌;STC缓冲液（1mol山梨醇,50mol Tris-HCl,pH值为8.0,50mmol CaCl2·2H2O。
主要酶类:
裂解酶（lysing enzymes3 实验
（1取一片带有稻瘟病菌菌丝保存于-25℃冰箱中的干燥滤子片接种到PDA斜面培养基上,25℃黑暗培养5d。
（2用接种针从斜面培养基表面刮取新鲜稻瘟病菌丝,并接种到带有10粒玻璃珠的CM液体培养基中,25℃黑暗培养3d,每4h振动1次,使连在一起的菌丝体分开;培养完毕后继续振荡培养30min,使菌丝体充分破碎以制备均一的菌悬液。
刮取菌丝时注意从表面轻轻刮擦,避免挑到菌丝体以外的琼脂块等杂质。
（3在超净工作台中将菌悬液分别加到10皿装有新鲜CM培养液的培养皿中,然后30℃黑暗培养1d。
（4用灭过菌的纱布过滤收集菌丝,先用灭菌水冲洗菌丝2次,然后用OM缓冲液冲洗一次,冲洗后的菌丝体加入到含有10mg/mL裂解酶的20mL OM缓冲液中,200r/min、32℃下振动培养4h。
（5加入20mL山梨醇缓冲液,3 000r/min离心10min。
（6沉淀物用10mL STC缓冲液洗涤2次后,再次悬浮于1mL STC缓冲液中。
4 实验结果
4.1 稻瘟病菌原生质体的形态观察
从酶解4h的酶解液中取原生质体于显微镜下观察其形态:
稻瘟病菌原生质体为透明球状实体,可观察到内含物,原生质体大小不均一。
4.2 稻瘟病菌原生质体产量测定
本实验使用25×16型的血球计数板来测定稻瘟病菌原生质体的数量。
从4h酶解液中取1μL原生质体悬浊液并用水稀释到100μL,之后用血球计数板计数。
每个供试菌株都读取5个25方格（中间跟四周各选1个25方格的原生质体数,然后计算平均值。
每mL酶解液所含原生质体数的计算方法:
原生质体数/mL=5个25方格原生质体平均数×16×10 000×稀释倍数100。
实验结果见表1,表中25方格原生质体数为5次平均值。
表1 稻瘟病菌各供试菌株的原生质体产量
菌株名
25方格原生质体
数/个
每毫升原生质体
数/108 mL-1
SA98-4 65.4 10.50
Y93-164a-1 88.4 14.10
F1-002 36.8 58.90
F1-057 31 4.96
4
3
实 验 技 术 与 管 理
表1（续
菌株名25方格原生质体
数/个每毫升原生质体
数/108 mL-1
84R-62B36.2 5.79Y93-245c-2 16.8 2.69F1-312 40.8 6.53F1-326 54.2 8.67F1-376 115.2 1.84F1-378
62.4
9.98
从表1可以看出,
本实验中供试稻瘟病菌株原生质体的产量通常为108~1
09
个/mL。
为了了解本实验中稻瘟病菌原生质体产量跟其他真菌原生质体产量的差别,特做了比较,比较结果见表2。
从表2可以看出:
本实验的稻瘟病菌的原生质体产量是其他真菌原生质体产量的10到10 000倍;而且,同样是稻瘟病菌的原生质体制备,本实验原生质体产量是其他报道的原生质体产量的10 000倍。
这说明本实验的这几个优化条件对提高原生质体的产量是非常有效的。
同时,本研究的原生质体产量是目前已经报道的真菌的最高产量。
表2 本实验中稻瘟病菌原生质体量跟其他真菌的比较
5 讨论
（1
通过这4个关键步骤的条件优化后,最大限度地简化了实验过程,不需要使用搅拌机破碎,仅使用几个玻璃珠就能获得菌悬液,
因此省了搅拌过程跟清洗搅拌机的过程,既省钱又省事。
同时,因为菌丝体破碎过程就在三角瓶里进行,避免了把培养液倒出来破碎的步骤,从而大大降低了菌液被污染的机会。
（2
本实验使用新鲜菌丝进行培养,因为新鲜的菌丝生长力旺盛,能保证短期内获得大量菌丝体的
要求。
老的菌丝,尤其是长期放置已经发黑的菌丝有很多是死亡的菌丝体,不仅生长力有限,而且会给后期的原生质体提取带来大量不容易去除的杂质。
菌丝体经过搅拌破碎后继续培养,
保证尽可能地得到足够多的菌丝体,增大菌丝体跟CM培养液的接触面
积,从而创造更多的生长点为后期获得大量的菌丝体做准备。
（3
破碎后的菌悬液加入新鲜CM培养液培养一天后就收集菌丝体,这样就保证了所收获的都是低龄菌丝,
从而有利于酶解脱壁而释放原生质体。
本实验原生质体制备过程中所使用的其他条件:
酶的浓度（10mg
/mL、酶解温度（32℃和酶解时间（4h都是经过前人大量研究总结,
并通过本实验所证实的最有利于提高原生质体产量的条件。
正因为有了这些条件的优化组合,本实验所获得的原生质体产量才会达到前所未有的最高水平。
参考文献（References
[1]Muralidhar R V,Panda T.Fungal protoplast fusion[J].Biop
rocessEngineering
2000（22:
429-431.[2
]王升星,林莉,朱丽云.绿色木霉原生质体制备与再生条件的探索[J].安徽农业科学,2010,38（8:
3931-
3934.[3
]刘玲,叶博,刘长江.白腐真菌原生质体制备和再生条件的研究[J].生物技术,2006,16（5:
41-
44.[4
]王鑫,车振明,黄韬睿.原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用[J].食品研究与开发,2008（29:
174-
176.[5]孙剑秋,周东坡.微生物原生质体技术[J].生物学通报,2002（37
:
9-
11.[6]Balasubramanian N,Juliet G A,Srikalaivani P D,et a1.Release
andregeneration of protoplast from the fungus Trichothecium roseum[J].Canada Journal Microbiology
2003（49:
263-268.[7
]张汉波,丁骅孙,程立忠,等.出芽短梗霉的原生质体形成及再生研究[J].云南大学学报:
自然科学版,1999（21:
202-
204.[8]荣跃文.拟青霉属内4种虫生真菌7个菌株的核型分析[D].
合肥:
安徽农业大学,2009.
[9]徐莉.六株细脚拟青霉原生质体制备和染色体核型研究[D].
合肥:
安徽农业大学,2009.
[10]刘振盼.玉米大斑病菌REMI转化体系的建立和分子核型的初步
分析[D].保定:
河北农业大学,2007.
[11
]周益军,范永坚,王金生,等.稻瘟病菌原生质体的制备和再生菌株的致病性[J].江苏农业学报,2000,16（2:
83-
87.[12
]王婧.水稻纹枯病菌原生质体制备及再生菌株的生物学特性研究[D].武汉:
华中农业大学,櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍櫍殻
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2009.
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