荧光假单胞菌鞭毛蛋白结合黑松细胞膜蛋白的研究.docx
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荧光假单胞菌鞭毛蛋白结合黑松细胞膜蛋白的研究
目录
1前言1
1.1研究现状及发展前景1
1.1.1松树松材线虫病研究进展及本实验的假设1
1.1.2荧光假单胞菌鞭毛蛋白与黑松细胞相互作用的研究2
1.1.3细胞膜蛋白概述3
1.1.4细胞表面受体4
1.1.5黑松细胞膜蛋白提取的探索4
1．2本实验所用的蛋白质的分离纯化技术5
1.2.1蛋白质盐析5
1.2.2离子交换层析6
1.2.3电泳法6
1.2.4亲和层析6
1.3研究目的和意义7
2实验材料8
2.1实验仪器8
2.2实验菌种与材料8
2.3主要实验试剂8
2.4主要培养基9
3.实验方法9
3.1黑松松枝样品的采集及松枝膜蛋白的提取9
3.1.1黑松松枝样品的采集9
3.1.2黑松细胞膜蛋白的提取9
3.1.3膜蛋白样品SDS-PAGE电泳检测10
3.2荧光假单胞菌的培养及鞭毛蛋白的提取与纯化11
3.2.1荧光假单胞菌的培养11
3.2.2荧光假单胞菌鞭毛蛋白的提取12
3.2.3离子交换层析纯化鞭毛蛋白12
3.3特异性亲和层析纯化与鞭毛蛋白特异性结合的黑松细胞膜受体13
3.4膜蛋白转膜操作14
3.4.1配制试剂14
3.4.2步骤14
4.实验结果与讨论14
4.1结果14
4.1.1鞭毛蛋白粗提品SDS-PAGE电泳结果14
4.1.2鞭毛蛋白离子交换层析纯化后样品蛋白质电泳结果15
4.1.3膜蛋白粗体品及亲和层析纯化后结果16
4.1.4纯化后的膜蛋白转膜结果18
4.2讨论18
参考文献21
致谢23
1前言
1.1研究现状及发展前景
1.1.1松树松材线虫病研究进展及本实验的假设
松材线虫病[Bursaphelenchusxylophilus（Steiner&Buhrer）Nickle]，对松树来讲是一种毁灭性疾病，又称为松树萎蔫病，主要是由松褐天牛（Monochamusalternatus）传播的疾病。
此病是1905年在日本长崎县被首次发现，现已证实，在北美洲，亚洲，非洲，欧洲均已被发现。
目前已经成为世界范围内的严重的森林疾病[1]。
松材线虫病是由松材线虫单一病原引起的松树病害的单病原学说，在森林病理学学术界占有统治地位，但很多现象松材线虫病原学说很难解释，已有的研究证实松材线虫经表面灭菌后就失去了致病性。
Zhao等[2]对中国的松材线虫携带的24株细菌进行了鉴定，其中有11株属于假单胞菌属（Pseudomonas），有6株属于泛菌属（Pantoea），而且有17株细菌培养液对黑松幼苗显示了不同程度的致萎蔫活性。
用无菌松材线虫和其所携带得细菌进行混合接种，结果表明松材线虫所携带的细菌在松材线虫病的发病过程中发挥重要作用。
从而证明了松材线虫病是由松材线虫及所携带的细菌共同引起的[2]。
Zhao等[2]从松材线虫携带的一株荧光假单胞菌培养液中分离出一种分子量为50kDa的毒蛋白，Westernblotting分析和N-末端序列分析表明，该蛋白为鞭毛蛋白。
细胞免疫荧光分析表明，对照组的细胞在荧光显微镜下观察不到细胞荧光，而用鞭毛蛋白处理的黑松愈伤组织悬浮细胞，在荧光显微镜下却能发出黄绿色的光，从而表明鞭毛蛋白与黑松细胞间存在强烈的直接的相互作用，且作用位点主要集中在细胞表面[3]。
进一步的实验也证明鞭毛蛋白毒素是通过引起非典型细胞凋亡方式导致细胞的死亡。
目前，我国对松材线虫病的防治工作中，首先采用的是清理病死树的方法。
但是清理之后，次年仍会有松树死亡。
这可能与松材线虫病的潜伏侵染有关[4]。
不同松树长势有差异，对松材线虫病的抗性也存在个体的差异，同时松褐天牛羽化期长，补充营养传播送菜线虫的时间也很长，造成松树感染的时间也不同，松褐天牛传到松树上的线虫的数量也不同。
从而导致线虫在一些松树体内存在，这些松树在当年并未表现外部的症状，而在次年死亡，因此由此导致的松树萎蔫病顽固性很强，防治难度高[5,6]。
为了能够彻底防治松树的萎蔫病，必须研究清楚其致病机理，从而研究出相应的药物，或改变其基因培育出新品种，从原理上根治松树萎蔫病。
本实验提出了信号转导假设：
有致病机理的鞭毛蛋白毒素通过与黑松细胞膜蛋白进行特异性结合，从而通过膜受体进行进一步的信号转导，将致病毒素转入黑松细胞，从而引起黑松细胞内一系列的生化反应，例如激酶的磷酸化，从而影响到细胞核内相应基因的表达与否或者基因的修饰，最终引起细胞非典型凋亡。
1.1.2荧光假单胞菌鞭毛蛋白与黑松细胞相互作用的研究
在Zhao等[2]在荧光假单胞菌培养液中分离出分子量为50kDa的毒蛋白鞭毛蛋白之后，Li等[3]进一步研究了荧光假单胞菌鞭毛蛋白对黑松细胞的致死作用，研究表明鞭毛蛋白与黑松细胞间存在强烈的直接的相互作用，且作用位点主要集中在细胞表面。
对黑松细胞形态学观察，经台盼蓝（Trypanblue）染色结果表明，鞭毛蛋白处理细胞出现细胞变形、细胞膜皱缩、细胞质浓缩等凋亡现象，而细胞膜保持相对完整。
台盼蓝是一种膜不通透性染料，能使坏死细胞着色，活细胞及凋亡细胞则不能着色，即台盼蓝拒染现象。
Li等[3]又通过Giemsa染色，观察到鞭毛蛋白处理的细胞已变形，细胞质浓缩，细胞核解体成多个小核，处理的细胞中出现若干核膜包裹着的小体。
Giemsa染色主要用于细胞的染色质（体）染色，基于细胞质和细胞核的pH值不同，使二者呈现不同的颜色，经常用作显示凋亡细胞染色质特征变化的方法。
由Giemsa染色结果可以看出，细胞染色质（体）被染成蓝紫色，而细胞质呈现淡蓝色。
通过基因组DNA的电泳检测，表明经鞭毛蛋白处理的黑松细胞基因组DNA发生了不同程度的断裂，但是并没有典型的DNALadder产生，而对照黑松悬浮细胞的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳时，呈现单一的条带，表明胞内的基因组DNA完整。
可以认为，鞭毛蛋白致黑松细胞的致死作用是非典型的细胞凋亡方式。
该方式与抗肿瘤药物顺铂[7]和依托泊苷[8]分别诱导的人类卵巢瘤细胞以及两个白血病细胞系的作用方式类似。
首先Guo等[9]从松材线虫携带的一株荧光假单胞菌的培养液中分离鉴定了两种小分子的环二肽毒素，后Zhao等[2]又从该细菌的培养液中纯化并鉴定了鞭毛蛋白毒素。
Li等[3]又利用黑松愈伤组织细胞，研究了这种鞭毛蛋白与黑松愈伤组织互作过程中细胞的死亡方式，结果表明，鞭毛蛋白处理的细胞具有典型凋亡特征，例如染色质固缩、核裂解、质膜内缩[10]，染色体DNA断裂，但不形成典型的DNALadder，说明了鞭毛蛋白通过引起非典型细胞凋亡方式导致黑松细胞死亡。
Zhao等[2]曾提出松材线虫病病原的松材线虫-细菌二元复合致病假说，Li等[3]的研究也显示松材线虫携带的细菌确实可分泌导致黑松细胞死亡的蛋白毒素，说明细菌在松材线虫病的病理进程可能发挥着重要作用。
Zhao等[2]的研究表明鞭毛蛋白与黑松细胞间存在强烈的直接的相互作用，且作用位点主要集中在细胞表面。
本实验假设荧光假单胞菌鞭毛蛋白与黑松细胞直接相互作用的位点是黑松细胞的膜蛋白，在此假设的基础之上提取黑松细胞的膜蛋白，并利用鞭毛蛋白与黑松细胞膜蛋白的特异性结合作用利用溴化氢活化的琼脂糖树脂亲和层析来纯化出此膜受体，从而进一步研究此膜受体的相对分子量，其蛋白质序列，从而有助于进一步的致病机理的研究。
1.1.3细胞膜蛋白概述
（一）膜蛋白的类型
根据膜蛋白分离的难易程度及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可以分为3种基本类型：
外在膜蛋白（extrinsicmembraneprotein）又称外周膜蛋白，内在膜蛋白（intrinsicmembraneprotein）又称整合膜蛋白，脂锚定蛋白（lipidanchoredprotein）。
外在膜蛋白属于水溶性膜蛋白，通过离子键或其他较弱的键与膜表面的膜蛋白分子或膜脂分子结合，因此只需改变溶液的离子强度甚至提高温度就能从膜上分离下来，而膜结构却不受影响。
脂锚定蛋白是通过与之相连的脂分子（例如脂肪酸或糖脂）插入膜的脂双层中，从而锚定在细胞质膜上。
内在膜蛋白与膜结合紧密，只有用去垢剂使膜崩解后才可以分离下来。
内在膜蛋白占70%-80%[11]。
（二）内在膜蛋白与膜脂结合的方式
内在膜蛋白多为跨膜蛋白，也有些插入脂双层中，与膜结合的主要方式有：
1.膜蛋白的跨膜结构域与脂双层分子的疏水核心的相互作用。
2.跨膜结构域两端携带正电荷的氨基酸残基，如精氨酸，赖氨酸等与磷脂分子带负电的极性头形成离子键，或带负电的氨基酸残基通过Ca2+，Mg2+等阳离子与带负电的磷脂极性头相互作用。
3.某些膜蛋白通过自身在细胞质基质一侧的半胱氨酸残基上共价结合的脂肪酸分子，插入到脂双层之间，进一步加强膜蛋白与脂双层的结合力，还有少数蛋白与糖脂共价结合[11]。
（三）去垢剂
去垢剂（detergent）是一端疏水的两性小分子，是分离与研究膜蛋白的常用试剂。
去垢剂分为离子型去垢剂与非离子型去垢剂两类。
常用的离子型去垢剂如十二烷基磺酸钠（SDS），它不仅可使细胞质膜崩解，还可以与膜蛋白疏水部分结合从而使其与膜分离，而且还可以破换蛋白质内部的非共价键，甚至改变其亲水部位的构象。
由于SDS对蛋白质的作用较为强烈，会引起蛋白质的变性，因此在纯化膜蛋白时，特别是为获得有生物活性膜蛋白时，常采用非离子型去垢剂[12]。
常用的非离子型去垢剂如TritonX-100，非离子型去垢剂也可使质膜崩解，但对蛋白质作用较温和。
不同非离子型去垢剂对不同种类的膜蛋白作用也不同。
本实验用TritonX-100来裂解黑松细胞的细胞质膜，从而提取所需的整合膜蛋白。
TritonX-100能保持电中性和酶活性。
最新的一种非离子型去垢剂为CHAPS，其在增加膜蛋白溶解和防止其聚合的同时，并不会使酶的活力丧失[12]。
但由于实验条件有限，本实验没有尝试用CHAPS。
1.1.4细胞表面受体
受体（receptor）是一种能够识别和选择性结合某种配体（信号分子）的大分子，绝大多数已鉴定的受体是蛋白质且多为糖蛋白，少数是糖脂，有的受体是糖蛋白与糖脂组成的复合物。
根据靶细胞上受体存在的位置，可分为细胞内受体和细胞表面受体。
细胞内受体主要识别脂溶性信号分子。
细胞表面受体分属三大家族：
离子通道偶联受体、G蛋白偶联受体、酶联受体。
细胞表面受体主要识别和结合亲水性信号分子[10]。
根据上述对鞭毛蛋白与黑松细胞相互作用的研究，推论出与鞭毛蛋白结合的受体属于细胞表面受体。
即属于膜蛋白。
1.1.5黑松细胞膜蛋白提取的探索
对膜蛋白质的分离和纯化，常用的方法有密度梯度离心法[13]和两相分配法[14]，但是上述方法容易受到其他细胞结构的污染，有报道利用生物素亲和素亲和法纯化细胞质膜能减少其他细胞器的污染。
然后利用形态学法和特异性酶活测定法鉴定膜的纯度。
在查阅了大量文献下，为了不对进一步的实验造成影响，本着操作简单，添加的化学试剂越少越好的原则，通过对照，本实验利用简单的差速离心的方法来提取膜蛋白的粗品。
在提取膜蛋白的过程中，蛋白酶也可能被释放或被激活，引起蛋白质的水解，从而破坏其生物活性，以及降低提取的浓度，所以在蛋白质的提取过程中需要加入适量的蛋白酶抑制剂来防止蛋白质的水解。
常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮（TLCK）和丝氨酸抑制剂（AEBSF）等[15]。
本实验在现有条件下，提取黑松细胞膜蛋白的过程中利用了蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。
在低温条件下，蛋白酶活性很低，所以样品制备应该尽量在低温条件下进行。
本实验操作环境温度控制在4℃以下。
理论上，在样品的制备过程中也应防止尿素热分解所引起的修饰作用，排除多糖、核酸、脂类和其他分子的干扰。
由于膜蛋白具有疏水性，并且膜蛋白大多是低丰度蛋白和碱性蛋白，因而给膜蛋白的提取增加了难度，同时给蛋白质组学的研究组学带来了挑战。
所面临的最重要的挑战是膜蛋白的增溶性。
蛋白质样品的裂解缓冲液中应包括去污剂，离液剂，还原剂和两性电解质载体，而去污剂的选择是最主要的。
上述所说，去污剂一般使用非离子型去污剂如曲拉通（TritonX-100）和诺纳德（NPO40），但有些研究者发现兼性离子去污剂如3-[（3-胆胺丙基）二甲基铵]-1-丙基磺酸盐（CHAPS）溶解疏水性蛋白质的能力更强。
而在硫脲和尿素存在的条件下，CHAPS本身的溶解度也会下降。
所以在未知黑松细胞及膜蛋白的最适情况下，初级探索阶段，本实验采用了常用的TritonX-100。
离液剂是通过破坏氨基酸残基之间氢键和非共价键，从而使蛋白质变性。
尿素是一种最常用的离液剂，它一般的使用浓度在7mol/L左右。
Rabilloud等[16]发现尿素和硫脲的混合使用大大增加了膜蛋白的溶解性。
虽然离液剂能增加膜蛋白的溶解性，但本实验需要保持蛋白质的活性，所以在膜蛋白质的提取过程中不应加离液剂。
还原剂是通过破坏蛋白质分子的二硫键作用而增加蛋白质的溶解性，常用的有二硫苏糖醇（DTT），β-巯基乙醇，和二硫赤藓糖醇（DTE）[15]，但为了在提取样品中以免破坏其活性，在初级探索阶段本实验未加入还原剂。
1．2本实验所用的蛋白质的分离纯化技术
1.2.1蛋白质盐析
此技术是根据蛋白质溶解度的不同的分离技术。
在低盐浓度下，蛋白质的溶解度随着盐浓度的升高，称为盐溶。
当盐溶液浓度不断升高时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降，而先后析出，称为盐析，从而达到分离纯化目的[17]。
一般粗体物常用该方法粗分。
本实验荧光假单胞菌鞭毛蛋白的粗体物的粗分中利用了硫酸铵分级沉淀技术。
该技术原理便是根据蛋白质的盐析原理。
1.2.2离子交换层析
离子交换层析是一种根据蛋白质带电性质不同的一种分离技术。
在中性条件下，以离子交换剂作为柱填充物，根据蛋白质或多肽带电性不同而引起的离子交换亲和力的不同从而达到分离目的。
可分为阳离子柱和阴离子柱两大类，目前有一些新型树脂，例如离子交换纤维素、葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶树脂、大孔型树脂、均孔型树脂等[16,17]。
本实验在荧光假单胞菌鞭毛蛋白分离纯化中，利用了阴离子交换层析，采用的是阴离子琼脂糖凝胶树脂（DEAESepharoseTM），获得了较纯的鞭毛蛋白。
1.2.3电泳法
电泳法为是根据带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反电极方向移动的原理分离纯化蛋白质的一种分离方法。
蛋白质混合样品经过电泳，被分离的蛋白质组分的电泳迁移率各不相同，因为各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同，从而达到分离效果[16,17]。
常用SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺）凝胶电泳法，此技术是蛋白质分离检测蛋白质相对分子量的基础方法。
1967年Shapiror等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的相对分子量，而与原来的电荷和分子形状无关。
SDS与蛋白质的结合带来了两个后果：
第一，由于SDS是阴离子，使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷远远超过蛋白质本身所带的电荷，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的SDS-蛋白质复合物电泳时都以同样的电荷/蛋白质质量比向正极移动。
第二，改变了蛋白质单体分子的构象，SDS-蛋白质复合体在水溶液中的形状被认为是雪茄烟形似地长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度（直径）都是一样的，约为1.8nm，而长轴长度随着蛋白质的相对分子量成正比例变化。
本实验多次用到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
来检测鞭毛蛋白，膜蛋白的纯度及相对分子质量[19]。
1.2.4亲和层析
亲和层析是根据配体特异性分离技术。
此技术是利用生物大分子的某些相对应的专一分子特异性识别和可逆结合的特性建立的一种分离生物大分子的方法。
利用此技术从粗提液中经过一次简单的处理既可得到所需要的高浓度活性物质。
只需一步处理便可使某一种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，并能保持较高的生物活性，且能达到上千倍的纯化效果。
现今在蛋白质的研究和制备领域中亲和层析分离技术被广泛应用，是分离纯化及分析生物大分子尤其是蛋白质的有力工具[16,17]。
本实验中利用荧光假单胞菌鞭毛蛋白与黑松细胞膜蛋白的特异性结合的特点，将已知的鞭毛蛋白作为亲和层析过程中的配体来分离纯化膜受体。
1.3研究目的和意义
松材线虫病对松树来讲是一种毁灭性的疾病，目前来讲在我国已经造成很大损失。
1982年在我国南京首次发现，到目前为止已经在江苏、安徽、广东、山东、浙江、台湾等地发生，严重威胁我国林业生态环境建设。
很多研究者对松树的松材线虫病的病因和致病机理进行了探索和研究，但到目前为止，尚未有明确的定论[20]。
目前，一些学者已经证明松材线虫病是由松材线虫和细菌共同引起的，1980年奥巴郎等[20]提出导致松树萎蔫的松树萎蔫的毒素可能是松材线虫携带的细菌的代谢产物。
在1981年，Tada肯定了此假设。
1996-1999年，河津等[20]研究表明，这些细菌主要是芽孢杆菌[20]。
Zhao等[2]人从松材线虫体表分离出荧光假单胞菌，并从荧光假单胞菌培养液中分离出一种鞭毛蛋白毒素，其分子量为50kDa。
Li等[3]又研究了荧光假单胞菌鞭毛蛋白对黑松细胞致死作用的方式。
结果表明，鞭毛蛋白处理的黑松细胞具有典型的非典型死亡特征。
Zhao等[2]的研究表明鞭毛蛋白与黑松细胞间存在强烈的直接的相互作用，且作用位点主要集中在细胞表面。
本实验在提出鞭毛蛋白与黑松细胞结合的位点是一种膜蛋白的假设下，研究探索提取黑松膜蛋白的方法，并在此基础上，进一步纯化出与鞭毛蛋白特异性结合的膜蛋白。
确定其相对分子量，并将其进行转膜处理，测出此膜蛋白的序列。
本实验对膜受体的研究有利于进一步的病理机制在细胞内的信号通讯的探索研究。
有利于对松树萎蔫病的致病机理的研究。
从而有助于松材线虫病的彻底根治。
2实验材料
2.1实验仪器
高速离心机型号:
HC-2518，安徽中科中佳科学仪器有限公司
恒温培养振荡器型号:
HZQ-X100A，上海一恒科学仪器有限公司
冷冻离心机型号:
GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂
立式压力蒸汽灭菌器型号:
YXQ-LS-75SⅡ，上海博迅实业有限公司医疗设备厂
超低温冰箱型号：
DF8154， ＳＩＭ国际有限公司
高速冷冻离心机 型号：
CR21G，上海安亭科学仪器厂
电子天平型号：
JY5002，上海精密科学仪器有限公司
电泳仪型号：
DYCZ-23A，北京市六一仪器厂
双恒电泳仪北京君意东方电泳
旋涡混合器型号：
XW-80A，上海精科实业有限公司
大容量恒温振荡器型号：
DHZ-C，江苏太仓试验设备厂
超净工作台苏州净化
恒温磁力搅拌器江苏金坛新一佳保
玻璃器材若干
2.2实验菌种与材料
荧光假单胞菌（Fluorescencepseudomonas），来源于郭道森老师实验室。
新鲜的黑松松枝，来源于青岛大学校园。
2.3主要实验试剂
NaCl，酵母提取物（YEASTEXTRACT），蛋白胨（TRYPTONE），SDS，Gly，Tris，过硫酸铵（AP），纤维素酶，果胶酶，TEBuffer溶液（20mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTApH8），透析液（20mmol/LTris-HCl，5%甘油，10mmol/LNaClpH8），30%丙烯酰胺，1.5mol/LTris-HCl（pH8.8），10%SDS，过硫酸铵（AP），TEMED，考马斯亮蓝检测液，蛋白酶抑制剂2mmol/LPMSF，PBS+2%TritonX-100（pH6.5），2*LoadingBuffer，考马斯亮蓝R-250染液，考马斯亮蓝G-250检测液，洗脱液，蛋白质电泳缓冲溶液，NaCl梯度溶液（50mmol/L–0.5mol/L），硫酸铵，甘油（丙三醇），阴离子交换树脂（DEAESepharoseTM），CNBr-activatedSepharoseTM4B，2%SDS洗脱液，0.2mol/LNaHCO3。
2.4主要培养基
LB固体培养基
LB液体培养基
3.实验方法
3.1黑松松枝样品的采集及松枝膜蛋白的提取
3.1.1黑松松枝样品的采集
在校园黑松树上采集鲜嫩的松枝牙，将其表面的一层白色绒毛去除，速带回实验室放入-70℃冰箱待用。
3.1.2黑松细胞膜蛋白的提取
（1）配制膜蛋白提取所需试剂：
配制1.5%的纤维素酶和0.6%果胶酶300mL4000r/min冷冻离心机离心10min取上清，放入4℃冰箱待用。
考马斯亮蓝G-250检测液，PBS+2%Triton-X100（pH6.5）放入4℃冰箱待用，蛋白酶抑制剂10mg/mLPMSF40mL即称量0.4gPMSF溶于40mL异丙醇中放入4℃冰箱保存待用。
（2）称取新鲜的松枝200g分批放入研钵中研磨，研磨粉碎;研磨过程中每隔一小时加入10μl2mmol/LPMSF，防止研磨过程中松枝中的蛋白酶降解所提取的膜蛋白。
（3）将研磨碎的松枝放入500mL锥形瓶中，加入300mL配好的纤维素酶和果胶酶溶液酶解松枝的细胞壁4h[20],酶解过程中每隔一小时加入3mL10mg/mLPMSF。
（4）六层纱布过滤酶解液，过滤掉大块没有酶解完全的松枝，去除大块杂质的酶解后的溶液约300mL。
（5）将300mL溶液分装到两个离心杯中，高速冷冻离心机在4℃下以8000r/min离心15分钟，去除上清可溶性杂蛋白。
（6）分别向两个离心杯中加入150mL蒸馏水，将杯底的沉淀悬浮，在旋涡仪上振荡10min，使可溶性杂蛋白充分溶解至蒸馏水中。
每管中每隔1小时加入1.5mL10mg/mLPMSF。
（7）在高速冷冻离心机8000r/min离心15min，去除上清。
（8）重复6、7步骤，直到用考马斯亮蓝检测液检测上清不显蓝色，即可溶性蛋白去除干净。
（9）每个离心杯中加入6mLPBS+2%TritonX-100（pH6.5）使沉淀充分溶解，在旋涡仪上振荡10min中，使黑松细胞膜充分裂解，膜蛋白溶解充分。
（10）12000r/min离心30min，取上清，即为提取的黑松细胞膜蛋白样品，将其分装到EP管中，放入-70℃冰箱中备用。
3.1.3膜蛋白样品SDS-PAGE电泳检测
（1）取膜蛋白样品每管200μl与20μl2*LoadingBuffer，在蒸馏水中煮样至剩到样品约30μl左右为止。
（2）配蛋白质电泳缓冲溶液，Tris3.03g，Gly18.8g，SDS1g，500mL水。
放入4℃冰箱保存待用。
（3）将玻璃板及胶条用凡士林粘贴，涂凡士林时不要有间断以防漏水，再在夹片上涂凡士林，将另一带齿的玻璃板粘上。
（4）在夹缝中加蒸馏水检漏10分钟。
（5）将蒸馏水倒出，配分离胶10mL即水3.3mL，30%丙烯酰胺4mL，1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）2.5mL，10%SDS0.1mL，过硫酸铵（AP）0.1mL，TEMED0.004mL。
在距离梳子1.0cm处划线做标记，将分离胶注入至稍高于标记处，用水封直至分离胶凝固，将水倒干净。
（6）插上梳子，配浓缩胶3mL即水2.1mL，30%丙烯酰胺0.5mL，1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.38mL，10%SDS0.03mL，AP0.03mL，TEMED0.003mL。
小心注入齿口，若有气泡，轻轻拔出梳子后再插入。
（7）待浓缩胶凝固，将最下面的胶条抽出，用
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