一篇关于蝉拟青霉米克尔阿尔的翻译.docx

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一篇关于蝉拟青霉米克尔阿尔的翻译

蝉拟青霉（米克尔阿尔）中杀虫成分的分离

柴一秋，金轶伟，刘又高，厉晓腊，陈官菊，王根锷

（浙江省亚热带作物研究所，温州325005）

摘要：

在这个研究当中，蝉拟青霉子实体中可以杀死小菜蛾的杀虫活性成分首次用分离与生物试验相结合的方式被分离、纯化。

在活性检测引导的方法下，蝉拟青霉子实体40%乙醇提取物经二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶剂依次萃取（剩余溶液为水溶组分），再经过大孔树脂、HPLC和SephedexLH-20分离纯化得到杀虫活性化合物。

【结果】分离纯化到一个白色粉末状化合物，浓度10mg·ml-1，24、48和72h时校正死亡率分别为（95.1±1.8）%、（97.7±1.6）%和（99.1±1.7）%。

该化合物具有较好的杀小菜蛾活性，对酸稳定，对胃蛋白酶不敏感，并具有

茚三酮不显色等其它理化性质。

关键词：

蝉拟青霉；子实体提取物；小菜蛾；杀虫活性

引言

随着社会的发展及人类对环境和生态认识的提高，发现对害虫高效，对人、环境和非靶标生物安全的生物源杀虫剂成为现代农药研发热点（（鲍文等人2000;。

查尔斯等人，2001年。

克里斯蒂安等。

2004年，2005年邓小平和徐，周等人。

2006年，杨等人。

2004年）。

小菜蛾周年多代重叠发生，是高抗药性、世界性和灾害性的蔬菜害虫。

所以，从蝉拟青霉发酵产品中分离杀小菜蛾的活性物质具有重要的生产应用意义和生态环保意义。

蝉拟青霉[Paecilomycescicadae（Miq.）Samson]寄生蝉（PlatylomiaPeilikoto）若虫形成的虫菌复合体称蝉花，是虫草类的古老中药（陈和刘1933）。

最近国内外研究发现蝉拟青霉提取物具有多重治病活性（高野等人，2005年。

金等人。

2005年旗峰等。

1990年，金等人。

2006年，王等。

2001年，陈和刘1993）。

作为昆虫病原真菌，蝉拟青霉可以寄生白粉虱[Trialeurodesvaporariorum（Westwood）]；笔者的研究也发现蝉拟青霉分生孢子对菜青虫（PierisrapaeLinnaeus）具有较强的寄生性，并且致死时间快，在室内对家白蚁的致病率达到84.4%[16]，并发现其培养滤液对小菜蛾[Plutellaxylostel（Lepidoptera：

Plutellidae）]和菜青虫具有杀虫活性[。

蝉拟青霉不仅可以寄生菜青虫，而且其培养滤液具有杀虫活性。

蝉拟青霉子实体中是否存在杀虫活性物质？

这是一个很有意义而有趣的问题。

【拟解决的关键问题】本研究拟采用化学分离分析和生物检测相结合的方法，从定向筛选的蝉拟青霉J-PC菌株生物发酵获得的子实体中分离纯化具有杀小菜蛾活性的化合物。

1材料与方法

1.1菌株来源

蝉拟青霉菌株022017#，从发病虫体上单孢分离、筛选获得。

1.2蝉拟青霉子实体制备[1]

马铃薯蔗糖培养基（PSA）斜面培养基24℃条件下培养7d，转接到马铃薯-蔗糖培养液中，110r·min-1转速摇床振荡培养3d。

1﹕10接种量接入培养基（麸皮2﹕玉米1﹕谷糠1，并加2%果糖），24～25℃培养25d，从培养基上剪刀剪取孢梗束（未去除孢子），60℃烘干备用。

1.3仪器及化学试剂

仪器：

TH-1型梯度混合器（上海沪西机电厂）；

LC-6离心机（上海离心机械研究所）；Art.10626Lobar柱子（Merck公司）；蠕动泵millipore510（Waters公司）；BSZ-100自动部份收集器（上海精科实业有限公司）；SephedexLH-20（瑞士Pharmacia公司），Φ2cm，长50cm。

RT-HPLC为allianceWaters2690，柱子是μ-BandapaReC18300×3.9mm，颗粒大小5μm。

试剂：

甲醇、乙醇、乙醚和丙酮等（国产分析纯）；胃蛋白酶（美国HyClone-PIERCE公司）；CDA-40型大孔树脂（南京化工大学）；纯水（杭州娃哈哈集团）。

1.4RT-HPLC参数

流动相，A液为0.05%三氟乙酸（TFA），B液为80%乙腈（AcN）加0.05%TFA。

流程为100%A液4min；65%A液加35%B液10min；62%A液加38%B液6min；100%B液10min；100%A液10min。

流速（Flow）1.0ml·min-1。

检测波长（PDA）为200～400nm。

1.5小菜蛾来源及饲养方法

南京农业大学植物保护系吴益东教授提供的广州田间抗性小菜蛾。

小菜蛾在25℃，12h光照12h黑暗的光照培养箱内饲养继代繁殖，饲养喂料采用无菌蛭石上萌发生长的萝卜苗（高5～6cm）。

1.6杀虫活性测定[18]

将分离提取的各组（浓度为折合成子实体干重50mg·ml-1）分用0.5%的吐温80溶液稀释，直径5cm的甘蓝叶片分别在各组分稀释液中浸泡20s，取出晾干，置直径6cm培养皿中。

用小号毛笔轻轻地挑取小菜蛾3龄幼虫于叶片上。

每种共处理10头虫，重复3次。

用清水浸泡过的叶片作对照。

试验在25℃，12h光照12h黑暗的光照培养内进行。

处理后次日开始每天统计死亡虫数，直至试验结束，每隔一天换新鲜叶片，计算校正死亡率。

校正死亡率（%）=[（处理组死亡率-对照组死亡率）/（1-对照组死亡率）]×100。

死亡率（%）=（死虫数/供试虫数）×100。

1.7蝉拟青霉杀虫活性物质的分离提取和活性追踪[19]

将人工培养的蝉拟青霉子实体粉碎成200目颗粒（525g），用40%乙醇（ethanol）浸提3次，每次1000ml，合并滤液用旋转蒸发仪70℃浓缩为1800ml。

将浓缩液分别用二氯（dichloromethane）、乙酸乙酯（ethylacetate）、正丁醇（n-butanol）溶剂依次萃取，萃取剩余的为水溶组分，并分别蒸干，各组分采用活性追踪结合HPLE检测的方法，继续分离杀虫活性组分，最后获得活性单体化合物。

1.8水溶组分对蛋白酶的稳定性分析

胃蛋白酶缓冲液（pH=4）：

0.1mol·L-1柠檬酸18.6ml，0.1mol·L-1柠檬酸钠1.4ml。

以不加酶液处理为对照，37℃反应12h，酶液反应浓度均为1mg·ml-1。

2结果与分析

2.14个溶剂萃取组分的杀虫活性测定

杀虫活性主要集中在水溶，24、48和72h的校正死亡率分别为（46.7±1.3）%、（60±2.2）%和（66.7±1.8）%，显著高于其他分离组分（表1），所以，活性物质为水溶性，下一步追踪水溶组分的杀虫活性。

2.2对水溶组分的活性追踪

2.2.1胃蛋白酶对水溶组分的活性影响

具有杀虫活性的水溶组分不受胃蛋白酶的影响，在1mg·ml-1胃蛋白酶、pH4、37℃条件反应12h，与未经胃蛋白酶处理的水溶组分比较杀虫活性没有显著差异（表2）。

表1不同萃取组分对小菜蛾的杀虫活性

浓度为50mg子实体·ml-1；空白对照死亡率均小于10%；同列数据后标有不同字母者表示在5%水平上差异显著（DMRT），表2同

表2胃蛋白酶对水溶组分对小菜蛾的杀虫活性的影响

所以，该杀虫活性物质是水溶性的对蛋白酶不敏感物质。

2.2.2去除多糖对水溶组分活性的影响

已知蝉拟青霉40%乙醇-水提取物的水溶组分中含有大量多糖，采用常规的醇沉水溶的分离方法分离去除水溶组分中的粗多糖。

810ml的水溶组分在混合器上混合，同时缓慢加入3倍体积95%乙醇，3600r/min4℃离心15min，沉淀为粗多糖，收集上清液浓缩蒸干为去除多糖的水溶组分。

分别进行杀虫活性测定。

结果表明杀虫活性物质集中在去除多糖的水溶组分，24、48和72h的校正死亡率分别为（60±1.8）%，（58.6±2.2）%和

（72.4±1.3）%，而粗多糖没有杀虫活性（表3）。

所以，去除水溶组分的多糖可以进一步纯化杀虫活性物质。

2.3大孔树脂分离和活性检测

采用大孔树脂吸附分离进一步纯化去多糖后的水溶组分：

去多糖后的水溶组分90g经9cm×1.0m大孔树脂柱子吸附后，依次加水，50%乙醇，95%乙醇洗脱，分别得到65.90、11.09和0.49g，并进行杀虫活性测定。

结果表明，50%乙醇洗脱的组分24、48和72h的校正死亡都为77.8%（表4），为杀虫活性集中的组分。

所以，下一步继续追踪50%乙醇洗脱组分

表3去除多糖对水溶组分杀虫活性的影响

浓度为50mg子实体·ml-1；空白对照死亡率均小于10%；同列数据后标

有不同字母者表示在1%水平上差异显著（DMRT）。

表4和5同

的杀虫活性物质。

2.4大孔树脂50%乙醇洗脱组分的活性追踪

2.4.1薄层层析

薄层层析板为德国Merck公司生产的DC-ALnfolienArt.5559RP-18F-254S板。

展开溶剂系统为甲醇﹕水=1﹕3。

层析结果中（图1）斑点2，颜色深，在365A°和2537A°下都能紫外显色，但茚三酮不显色，说明没有氨基。

1：

点样点；2：

色浓，茚三酮不显色；3，4，5：

色淡

图1大孔树脂50%乙醇洗脱组分的薄层层析

表4大孔树脂分离组分对小菜蛾的杀虫活性

2.4.2RP-HPLC

分析在3.932min有一高峰，Au=415203，含量为41.23%；2.175min有一小峰，Au=152607，含量为15.56%；另外，在0.958min、1.668min、1.909min和5.616min各有一很小峰（图2）。

所以，下一步分离3.932min处的高峰。

2.4.3RT-HPLC分离

采用LoBarC18分离柱，millipore510蠕动泵一步分离大孔树脂50%乙醇洗脱组分，BSZ-100自动收集仪收集，1管/3min，15ml/管，压力500Psi，流速8ml·min-1。

洗脱液为甲醇（分析纯）﹕水（纯水）=2﹕8，共收集201管，每隔10管作RP-HPLC检测，相同的合并。

经RT-HPLC检测，3.932min的大峰是59～77管，合并蒸干为淡黄色粉末0.033g。

1～56管合并蒸干为大峰前部分。

78～201管洗脱液蒸干为大峰后组分。

检测活性发现大峰组分在24、48和72h校正死亡率分别为（88.8±1.2）%，（91.0±1.5）%和（95.2±1.5）%（表5），在1%水平显著高于其他组分，说明大峰为杀虫物质。

2.4.4活性组分的SephedexLH-20

纯化和活性检测大峰组分经SephedexLH-20纯化，甲醇洗脱液蒸干得白色粉沫。

RT-HPLC检测纯度为98.1%（图3）。

在浓度为10mg·ml-1时，24、48和72h校正死亡率分别为（95.1±1.8）%、（97.7±1.6）%和（99.1±1.7）%。

因此，确定大峰组分为杀虫活性物质。

2.5杀虫活性物质的理化特性研究

外观：

白色粉末；紫外光谱：

λmax＝213.5nm，267nm（㏒ε＝4.19，4.20）[乙醇中]；红外光谱：

IRbands，3300cm-1（OH，NH）和1625cm-1（-C=N-）；熔点：

193℃；性状：

甲醇培育针晶；溶解性：

溶于水，甲醇；酸性、中性和碱性的辨别：

弱碱性物质；显色反应：

硫酸－香兰醛显色[硫酸：

5%苯酚水（体积比5﹕1）]；茚三酮不显色；薄层色谱：

Rf值0.38，展开溶剂为氯仿﹕甲醇（体积比）=5﹕1；酸碱稳定性：

图2大孔树脂50%乙醇洗脱组分的RT-HPLC分析

表5RT-HPLC分离组分的杀虫活性

图3SephadexLH-20纯化的活性成分RT-HPLC分析

pH=3，活性不变；热稳定性：

100℃下10min，活性稳定；酶稳定性：

不被胃蛋白酶降解。

3讨论

3.1蝉拟青霉杀虫活性物质的分离纯化

拟青霉（Paecilomyces）属的许多真菌也能够产生丰富的多种生理活性代谢产物,如淡紫拟青霉（P.lilacinus）、宛氏拟青霉（P.variotii）、粉拟青霉（P.farinosus）、玫烟色拟青霉（P.fumosoroseus）、灰绿拟青霉（P.griseivirdis）和桃色拟青霉（P.persicinus）等产生抑菌或杀虫等活性物质[20]。

本研究首次从蝉拟青霉中分离纯化杀虫活性物质，国内外未见相关报道。

本研究只是分离提取蝉拟青霉子实体的杀虫活性化合物，其菌丝体以及代谢产物的杀虫活性化合物分离有待进一步研究。

3.2有机化学和生物化学相结合的分离提取方法

本研究首先采用有机溶剂萃取，经过活性测定显示主要活性集中在剩余的水溶组分。

由于蝉拟青霉子实体粗提物中含有大量多糖，其次采用生物化学方法，即用乙醇沉淀水溶的多糖，再离心去除水溶组分中多糖。

之后，浓缩上清液，使用大孔树脂吸附分离，以及RT-HPLC进一步纯化分离活性组分。

采取生物化学和有机化学相结合的分离方法是本研究成功分离杀虫活性化合物的关键技术。

另外，在分离初始阶段，测试该活性化合物对胃蛋白酶不敏感，以及后续的茚

三酮不显色（说明没有氨基），提示分离方法设计以及结构鉴定时避开氨基酸或蛋白的假设。

3.3活性引导下的分离提取

本研究在活性引导下的追踪活性化合物，仅纯化了水溶组分中的活性物质，其它一些可能存在的杀虫活性组分还有待进一步的研究，如溶剂萃取的二氯甲烷组分在24、48和72h时校正死亡率分别为（23.3±1.2）%、（36.7±2.1）%和（65.5±1.7）%，排除二氯甲烷的毒性作用外，也可能存在具有一定杀虫活性的化合物，本研究还没有开展进一步的分离；又例如，大孔树脂纯化时水洗脱组分在24、48和72h时校正死亡率分别为（37.0±1.0）%、（49.2±1.2）%和（58.0±1.7）%，提示大孔树脂水洗脱组分还可能存在与最后分离同样或不一样的杀虫活性物质。

3.4蝉拟青霉的杀虫活性

蝉拟青霉分生孢子对小菜蛾的致病死亡3d达到高峰，本研究分离的蝉拟青霉杀虫活性化合物可能是蝉拟青霉分生孢子快速杀死小菜蛾的原因之一。

试验中还发现该杀虫化合物具有使小菜蛾降低活动，明显拒食等现象。

杀虫活性物质的结构鉴定，以及对小菜蛾的发育、产卵和拒食作用的影响等实验结果另文发表。

4结论

4.1发现蝉拟青霉杀小菜蛾活性物质

本研究室筛选的蝉拟青霉菌株022017#发酵培养的子实体含有杀小菜蛾活性物质，蝉拟青霉能够大量人工培养，活性物质来源充足，所以，具有开发意义。

4.2建立快捷的活性追踪化学分离方法

在活性检测引导下，蝉拟青霉子实体40%乙醇提取物经有机溶剂萃取，再经过大孔树脂、HPLC和

SephedexLH-20分离纯化快速简便地得到活性单体化合物。

4.3单体化合物的杀小菜蛾活性及稳定性

该化合物呈白色粉末状，对酸稳定和胃蛋白酶不敏感。

浓度10mg·ml-1，24、48和72h时校正死亡率分别为（95.1±1.8）%、（97.7±1.6）%和（99.1±1.7）%。

致谢

感谢中国科学院上海药物研究所国家新药筛选重点开放实验室的胡国源教授、叶阳教授，以及南京农业大学植物保护学院的吴益东教授对本实验的全力支持和无私帮助，在此一并致以谢意和致意。

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