高效液相色谱结果分析-第二讲.ppt

高效液相色谱结果分析-第二讲.ppt

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高效液相色谱,结果处理与分析,第二部分,（HighperformanceLiquidChromatography，HPLC）,一、色谱数据处理二、色谱图三、色谱图名词术语四、色谱峰检测五、HPLC测定步骤与内容,一.色谱数据处理,色谱仪信号输出图,色谱数据处理是通过ADC转换器,把模拟信号转换成数字信号,然后采用色谱软件处理给出色谱图等信息。

色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间,二.色谱图（Chromatogram）,样品组分分离示意图,三.色谱图名词术语

（1）,色谱峰（Peak）:

色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号.峰底（PeakBase）:

峰的起点与终点之间连接的直线.峰高（PeakHeight）:

峰最大值到峰底的距离.,基线,切线峰宽（PeakWidth,峰宽）:

在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离.半峰宽（PeakWidthatHalfHeight）:

通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直线与峰两侧相交两点之间的距离.峰面积（PeakArea）:

峰与峰底之间的面积,又称响应值.,三.色谱图名词术语

（2）,色谱峰的判断（最小面积）,响应值,时间,峰面积,三.液相色谱图名词术语（3）,保留时间（TR）（Retentiontime）:

组分从进样到出峰最大值所需的时间.死时间（t0）（Deadtime）:

不被固定相滞留组分的出峰时间.（其测定测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：

正相色谱常用四氯化碳，反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO3等）.调整保留时间：

tRtRt0,保留体积（VR）（Retentionvolume）:

组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.死体积（V0）（Deadvolume）:

不被固定相滞留的组分,从进样到出现峰最大值所需的流动相体积.调整保留体积：

VRVRV0tRFCFc:

流动相的流速mL/min.,三.液相色谱图名词术语（4）,谱带扩展（BandBroadening）:

由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象.,三.液相色谱图名词术语（5）,三.液相色谱图名词术语（6）,拖尾峰（TailingPeak）:

后沿较前沿平缓的不对称峰.前伸峰（LeadingPeak）:

前沿较后沿平缓的不对称峰.鬼峰（GhostPeak）:

并非由试样所产生的峰,亦称假峰.,三.液相色谱图名词术语（7）,基线（Baseline）:

在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号.基线噪声（BaselineNoise）:

由各种因素所引起的基线波动.基线飘移（BaselineDrift）:

基线随时间定向的缓慢变化.,峰宽,半峰宽,标准偏差,标准偏差（）（Standarddeviation）:

0.607倍峰高处峰宽的一半，为便于测量，改用半峰宽。

目的是为了计算柱效率（柱效）。

柱效（理论塔板数）：

或,三.液相色谱图名词术语（8）,进样,图示中塔板数为3.,塔板理论类似蒸馏中的气液平衡,峰的检测和判别是依据在基线的讯号水平上，预设一个“阈值”，超过该值时，判别为峰可开始检测。

一般采用下面两种方式判别峰讯号的变化：

依照信号斜率的变化检测信号依照积分面积检测峰信号,四.色谱峰检测,五.HPLC测定步骤与内容,1.确定色谱条件:

色谱柱的选择，流动相、流速、检测波长、柱温及进样量等。

2.绘制标准工作曲线3.精密度试验与回收率试验4.实际样品含量测定,1.确定色谱条件,色谱柱的选择流动相流速检测波长柱温进样量,2.绘制标准工作曲线,标准曲线是定量分析的根本依据.药物浓度（或质量）与药物在检测器上的产生的信号（通常采用峰面积A）成比例（正比）.标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度.标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!

准确度指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。

相对回收率直接反映测定结果与真实值的接近程度,应控制在100%左右（95%105%）。

绝对回收率模拟生物样品经整个样品处理过程,而相应标准溶液直接分析,两者的响应值之比称为绝对回收率。

绝对回收率一般应大于70%,过低说明方法中待测物质损失严重。

测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”。

3.准确度（accuracy）,

（1）回收试验空白+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,回收率,

（2）加样回收试验已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M,数据要求在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如高、中、低三个不同浓度样品各测三次.,回收率,4.精密度（precision）,精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度,表示测定的重现性。

用偏差（d）、标准偏差（SD）、相对标准偏差（RSD）（变异系数，CV）表示.,

（1）偏差（d）：

测量值与平均值之差,

（2）标准（偏）差（SD或S）,（3）相对标准（偏）差（RSD），也称变异系数（CV,有日内变异与日间变异两种）,5.检测限（limitofdetection,LOD）,指在确定的实验条件下，HPLC能检测出待测物的最低浓度或含量。

（是限度检验效能指标，无需定量测定，只要指出高于或低于该规定浓度即可）.,

（1）信噪比法把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

一般以信噪比（S/N）31或21时的相应浓度或量确定检测限。

（2）非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量.,指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。

6.定量限（1imitofquantitation，LOQ）,

（1）信噪比法确定定量限，一般以信噪比（S/N）为101时相应的浓度或注入仪器的量进行确定.

（2）按1984年国际纯粹和应用化学联合会（IVPAC）规定：

用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值，再经试验确定方法的实际测定下限.,7.专属性（specificity,或称选择性）,指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量.,8.线性（Linearity）,在设计范围内，测试结果与试样中被测物浓度呈正比关系的程度。

线形通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（Slope）来表示。

数据要求：

至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、y截距（检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。

指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。

范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：

9.范围（Range）,含量测定范围为80%-120%；含量均匀度范围为70%-130%；杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%；溶出度应为测定范围的20%。

指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。

是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。

分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同的实验者对同一样品的分别测试而获得的。

（获得的这种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的耐用性,或称粗放度）.,10.耐用性,

（1）鉴别试验除专属性、耐用性外，其它都不要求.

（2）杂质的限量检查除专属性、检测限、耐用性外,其它都不要求。

（3）杂质的含量测定除检测限外，其它都要求。

（4）含量测定及溶出量测定除检测限、定量限外，其它都要求。

11.应用,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.2,2.6,3.0,Time,min,0%,50%,100%,Rel,.Int.（%）,