海洋生物技术整理.docx

海洋生物技术整理.docx

《海洋生物技术整理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《海洋生物技术整理.docx（56页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

海洋生物技术整理

v第一章海洋生物技术概论

v本章思考题

v1什么是生物技术？

生物技术的重要性体现在哪些方面？

v2什么是海洋生物技术？

海洋生物技术的研究重点都有哪些？

v本章重点提示：

生物技术的概念、内容；生物技术的特点和重要性；海洋生物技术的定义及其研究内容

1.生物技术（Biotechnology,BT）,又称为生物工程（bioengineering）,现统一称:

生物技术。

1）生物技术定义

i.传统定义：

应用生物科学及工程学原理，依靠生物体系作为反应器，将物料进行加工改造，获得人类所需产品的技术。

ii.现代生物技术定义：

以现代生命科学为基础,把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料,产生对人类有用的新产品（或达到某种目的）的综合性科学技术。

2）要点:

①对象是具遗传特性的生命类物质:

包括病毒、细菌、植物、动物以及人类。

②生物体系多个不同水平研究:

从大分子（DNA，RNA，蛋白质，酶）、亚细胞、细胞、组织、器官到整个机体。

③应用工程学原理:

经人类思维,设计方案、定向修饰、加工制作过程、经过体外环节。

④有目的产品:

目的产品有三新特征:

新遗传功能、新遗传性状、新物种。

要有合乎人类所需的工业、农业、医疗和食品产品。

⑤高新技术起重要作用。

3）生物技术的发展（包括传统生物技术和现代生物技术）

i.传统生物技术

●传统生物技术的特点：

①主要通过微生物初级发酵获得产品，局限在微生物发酵和化学工程领域。

②没有改变微生物的遗传物质，也没有产生新的遗传性状。

③生产过程简单，上游主要是微生物的发酵培养及产品转化，通过诱变选育良种；下游主要对产品进行纯化。

④生产周期长，费用高，产量低，效率差。

ii.现代生物技术

●现代生物技术的四大支柱

●基因工程（核心和关键、主导技术）、细胞工程（基础）、酶工程（条件）、发酵工程（产品获得手段）、生化工程（分离、纯化、衍生……）

4）生物技术的特点（八高一低）

a）高水平：

即学科具有先进性，是知识、技术密集型产业,处分子水平、新技术前沿。

b）高综合：

跨学科专业,位多学科发展的交叉点上，涉及的行业多、范围广。

c）高投入：

与其他技术比较,在资金、人员、设备、试剂及研发上投资大。

d）高竞争：

各国、各行业、个单位之间，在技术、时效性、知识及人才上竞争激烈。

e）高风险：

上述原因造成一定风险，加上技术风险带来高风险。

f）高效益,应用性强,有目的产品,易商业化。

如干扰素的投入虽然高达数百万美元,但产值数年达30亿美元,用于治病将产生巨大经济和社会效益。

生物技术在解决人类面临众多难题上是没有任何产业可比的。

g）高智力：

具有创新性和突破性,可按人类需要定向改变和创造生物的遗传特性，要求在人才、计划、设计、工艺和产品上都要与众不同。

从认识、利用、再造阶段上升到改造和创造阶段。

h）高控性：

采用工程学手段，易自动化、程控化及连续化生产

I）低污染：

生物技术以生物资源为对象,生物资源具有再生性,是再生资源。

具有不受限制、污染小、周期短的优点。

5）生物技术的内容

医学生物技术；药学生物技术；动物生物技术；农业生物技术；海洋生物技术；微生物生物技术

v生物技术的上、中、下游

●上游工程：

实验室研究和开发阶段，包括基因、细胞、干细胞、转基因生物、组织工程等获得优良菌株、细胞系或固定化的菌体等。

●中游工程：

中游加工以生物反应器为中心，优化和放大生产工艺。

●下游工程：

从反应液中提取目的产物，加工精制成合格产品。

v生物技术涉及的具体技术包括:

1.DNA重组技术,细胞培养及融合技术,抗体制备技术,

2.干细胞培养及定向分化,显微注射技术,动物饲养技术,

3.转基因技术,胚胎克隆,细胞及酶的固定化技术,发酵技术,

4.生物反应器,蛋白质分离纯化,生物大分子合成及纯化,

5.生物大分子修饰,生物物理、生物信息及其他相关领域技术。

v生物技术诸工程的内容及种类（十大工程）

（一）基因工程（Geneengineering）（见幻灯片P46）

1.对象:

在核酸分子（DNA或RNA）或基因上操作。

2.定义:

在体外对DNA进行切割、拼接,使遗传物质重新组合,经载体转移到细胞中扩增表达,获得人类所需产品,或组建新生物类型的技术。

文献上常见到DNA重组、分子克隆、基因克隆、遗传工程等名词与基因工程混用,事实上主要内容相似,不同之处在于所突出的内容有异。

（二）细胞工程（cellengineering）

1.对象:

细胞,在细胞水平上实现基因转移或改变生物学性状。

2.定义:

（1）广义（细胞融合技术）：

在特定的条件下（环境、融合技术）,使不同的细胞融合,获得具有来自双亲代基因的杂交细胞,杂交细胞的遗传物质发生改变,达到改造物种、创建新种的目的。

（2）狭义（淋巴细胞杂交瘤技术）：

骨髓瘤细胞＋淋巴细胞融合（制备单克隆抗体，McAb）。

（3）现代概念:

将广义的概念延展,指在体外条件对细胞进行培养、繁殖，按人们的意愿改变细胞某些生物学特性，获得有用的产品或达到改良生物品种的技术。

细胞工程包括：

①细胞融合技术；②工程细胞移植,即有目的地改造细胞遗传特性后,植入机体；③细胞拆合；④染色体导入及细胞器导入技术；⑤胚胎细胞植入。

3.分类:

①微生物细胞工程,如原生质体融合,试管菌。

②植物细胞工程，如1978年培育出土豆西红柿新物种。

③动物细胞工程,单克隆抗体制备技术。

4.应用:

单克隆抗体制备成绩突出,诊断、治疗。

幻灯片P51

（三）蛋白质工程

（Proteinengineering）

1.对象:

基因序列——DNA分子中改造,最终导致蛋白分子氨基酸序列改变。

2.定义:

在利用X衍射和晶体分析技术了解蛋白质三维空间结构和功能关系基础上,借用计算机和分子设计辅助技术,在DNA分子水平上操作更换或改变其序列,达到改变蛋白质分子氨基酸序列,从而改变蛋白质分子形状及功能,使之具有新遗传学特性。

（四）抗体工程（Antibodyengineering）

1.对象：

免疫球蛋白（Ig）基因

2.定义：

通过对抗体分子结构和功能关系的研究，有计划地对抗体基因序列进行改造，改善抗体的某些功能的技术。

如基因工程抗体技术。

在80年代初，抗体基因结构和功能的研究成果与重组DNA技术相结合，产生了基因工程抗体技术。

v基因工程抗体即将抗体的基因按不同需要进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中进行表达的抗体分子。

3.抗体工程的内容

v完整抗体，及抗体的人源化

v完整抗体与抗体片段的药代动力学比较

v改造抗体片段的多种特异性

v双功能抗体

v抗体库的构建、展示和筛选

v噬菌体展示技术

vmRNA-蛋白质复合物库

v细胞表面库

v转基因鼠

v抗体的生产、稳定性和表达水平

v亲和力成熟

v骨架替换

临床应用

v中和病原体及抗病毒治疗

v细胞内抗体

v肿瘤治疗与细胞补充疗法

v疫苗应用

v用于未来诊断的生物传感器和微矩阵技术

（五）组织工程（Tissueengineering）

1.对象：

干细胞、组织和器官。

2.定义：

运用工程学和生命科学原理和方法，在了解正常和病理学组织结构与功能关系和生长机理的基础上，研制生物学组织器官替代品，通过移植，达到重建、恢复、维持和改进组织功能学科。

3.要点：

①依据正常组织结构、功能设计方案；

②选择种子细胞培养；

③选择细胞外基质、生物支架材料；

④体外构建三维结构替代品；

⑤植入机体，替代病理组织。

4.应用：

组织器官移植。

（六）干细胞工程（stemcellengineering）

◆干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可以分化成多种功能细胞。

◆根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。

◆根据干细胞的发育潜能分为三类：

全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

干细胞的主要特征：

v未分化的早期细胞；

v具有分化成各种特定细胞的能力；

v可无限地分裂增值，产生大量后裔;

v其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。

v克隆技术见幻灯片P65

（七）转基因动物（亦称:

胚胎工程Transgeneticanimal）

1.对象:

胚胎早期细胞上实现基因转移。

2.定义:

把新的遗传信息（DNA序列）用特定技术导入胚胎早期受精卵,经发育后,外源遗传信息分布到所有体细胞生殖细胞中去,这种使动物带有新遗传信息的基因转移技术称胚胎工程。

所得动物称转基因动物。

3.过程:

①提取人所需要蛋白质基因、cDNA；

②基因重组（cDNA＋控制基因＋载体）；

③分离、培养人工受精的卵细胞（如牛）；

④把重组体转入到受精的卵细胞；

⑤植入子宫,使之发育为个体（每一个体细胞均含有新的基因）；

⑥活化植入新基因,使之表达（如在乳腺中表达）；

⑦提取目的基因表达产物,进行验证（定性、定量）；

⑧进行安全性及临床试验。

4.要点:

①必须有外源新基因转移；

②在早期生殖细胞整合；

③发育成新个体中有外源基因正常表达；

④可遗传后代。

（八）生物医学工程（Biomedicalengineering）

1．对象:

人体

2．定义:

从工程学角度研究人体结构、功能及生命现象,为防治疾病提供新技术、新方法、新仪器和新材料的科学。

3．内容:

生物材料（人造器官、起搏器的材料）、康复工程、医学成像（超声、CT、核磁）、生物传感、监护系统等。

（九）生物制药／化学制药工程（Biochemicalpharmaceuticalengineering）

1．生产对象:

药物（活性多肽、酶、抗生素等）

2．定义利用现代生物技术,以生物反应器（微生物、动物细胞、植物及动物个体），大规模地制备高纯度的药物。

如基因工程药物、同份异构体的拆分（利用抗体酶特异结合、特异地进行酶消化来完成）等。

（十）酶工程（Enzymeengineering）

1.对象:

酶分子修饰、生产应用和酶的固定化

2.定义:

在给定的生产工艺和生物反应器中,利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造提高酶的转化率,把对应的原料高效地转化成所需有用的物质。

3.要点:

固定化酶、酶分子修饰和酶反应器的设计是当前酶工程的重点。

近年把酶电极生物传感器也归到酶工程范围内。

如:

底物＋固定化酶—→化学信号—→电信号—→人视觉—→控制反应。

（十一）发酵工程（Fermentationengineering）

1.对象:

微生物。

在常规发酵工艺上发展而成。

有时也称微生物工程。

2.定义:

利用微生物的特点（生长快、培养简单和代谢过程特殊等）,通过现代化工程技术,快速、连续生产人类所需物质的技术。

3.要点:

①核心是提高产率。

②过程包括:

菌种选育、生产、代谢产物的利用。

③所用技术包括大规模悬浮培养,细胞固定化,产物分离提取。

4．应用:

药物生产（活性多肽、抗生素）、单细胞蛋白生产、环境保护、微生物冶金技术。

（十二）生化工程（Biochemistryengineering）

1．对象:

①生化反应器（反应环境与装置），②产品的分离提纯技术

2.定义:

为活细胞和酶提供适宜反应环境,能大规模自动化生产、分离、精制出所需产品的技术。

3.内容包括:

生物反应器的设计、传感器的制造、电泳、离心、层折、免疫层析等。

这是下游工程的关键一环。

注：

1.十二大工程相互联系,相辅相成。

6）生物技术的重要性

v有助于解决全球的重大难题：

资源（能源）、人口、粮食、生态环境、健康与疾病和战争与灾害；

v促进传统产业的技术改造和新产业的形成，对人类社会生活产生深远的革命性影响；

v生物技术正迅速走向老百姓日常生活各个方面,将对人类的发展做出贡献。

2.海洋生物技术

1）.定义：

海洋生物技术是运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物代谢过程生产有用的生物制品或定向改良海洋生物遗传特性的综合性科学技术。

2）.海洋生物技术的研究内容：

主要以海洋生物为对象，综合应用基因工程、细胞操作技术和细胞培养技术等手段，对海洋生物资源进行研究、开发利用和保护。

①开发、生产和改造海洋生物天然产物，以便用作药物、食品、新材料；

②定向改良海洋动物、植物遗传特性，为海水养殖业提供具有生长快、品质高和抗病害的优良品种；

③培养具有特殊用途的“超级细菌”，用来清除海洋环境的污染，或者生产具有特定生物治理的物质。

主攻方向：

利用生物技术，改良具有重要经济价值的海水养殖生物遗传特性。

3．海洋生物技术研究的新发展

①探索有价值的海洋生物种群；

②利用生物技术开发新的海洋动植物优良品种，用于水产养殖业；

③利用海洋生物技术从天然生物中提取加工各种化工产品；

④从基因工程理论上阐明生物的特殊功能，并在可能的范围内加以利用；

⑤用基因工程理论阐明海洋生态系统存在与发展的规律，并对其进行人为的控制；

⑥建立海洋生物利用系统，包括海水养殖新技术和海洋生物生产系统

v第二章海洋动物细胞工程

思考题

v1名词解释：

细胞工程、原代培养、传代培养、细胞株、细胞系、细胞融合、连续细胞系、组织工程、无限细胞系、有限细胞系

v2简述tPA的制备过程。

v3简述动物细胞培养方式和操作方式。

v4动物细胞生物反应器必须具备哪些要求？

有哪些类型？

特点是什么？

一、

1.细胞工程的概念应用细胞生物学、遗传学、发育生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计和需要，通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植，以及组织、细胞培养等方法，在细胞整体水平或细胞器水平改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品，甚至培养出新物种的一门综合性生物工程技术科学。

2.细胞融合技术：

细胞融合，又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。

v体外用人工方法使两种细胞融合，制成一种新品系的杂交细胞，筛选出的杂交细胞有很强的生命力，增殖也很旺盛。

常用的细胞融合诱导物是仙台病毒和聚乙烯丙醇（PEG）。

●思考讨论：

为什么使用的病毒需要灭活？

不灭活不行吗？

答：

因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。

3、原代培养：

从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。

培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。

4、传代培养：

将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。

5、细胞株：

原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。

6细胞系：

细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。

细胞株和细胞系的区别：

细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。

7、转化细胞系（连续细胞系）：

通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。

转化过程可以是自发的或人工的，从肿瘤组织中分离。

8、原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。

如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系，如可以连续培养，则称为连续细胞系（无限细胞系），培养50代以上并无限培养下去。

二、

1、组织纤溶酶原激活剂（tPA）生产工艺：

组织纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白酶，与纤维蛋白结合后形成的复合物可使纤溶酶原活化为纤溶酶。

纤溶酶可水解纤维蛋白，导致血栓溶解，故对血栓性疾病有较好疗效。

人黑色素瘤细胞株培养后可产生大量的tPA，其培养液中tPA浓度可达到1毫克/升。

1）工艺流程

细胞单层、细胞悬液、细胞培养物、培养液、提取液、层析液、浓缩液、层析液、tPA成品

2）工艺过程

A培养基配制；

BtPA抗体制备；

C抗tPA亲和吸附剂制备；

D细胞培养；

EtPA的分离；

F精制。

（1）t-PA抗体的制备

v取人t-PA、或者猪心t-PA

↓

按每只家兔200-300ug的计量，t-PA采用福氏完全佐剂充分乳化，注射入家兔皮下。

↓

每隔2周再用t-PA100ug进行加强免疫，共加强2次

↓

取家兔血清

↓

用50%硫酸铵盐析

↓

沉淀物于0℃下，用生理盐水透析

↓

经过Sephadex75柱层析

↓

得到抗t-PA的免疫球蛋白IgG备用

（2）抗t-PA的亲和吸附剂的制备

[A]、Sepharose4B的活化

[B]、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备

v[A]、Sepharose4B的活化

vSepharose4B用10倍体积的蒸馏水（V/V）多次漂洗、布氏漏斗抽滤

↓

取20克Sepharose4B湿凝胶放入500ml的三颈烧瓶中，加蒸馏水30ml，搅均匀后，用2mol/L的NaOH溶液调节PH=11，降温至18℃

↓

在通风橱中，另取溴化氰1.5g于乳钵中，加入30-40ml蒸馏水分多次研磨溶解

↓

将溴化氰溶液倒入三颈烧瓶中，升温至20-22℃，同时滴加2mol/L的NaOH溶液调节PH=11-12

↓

等反应液PH值不变时，继续反应5分钟，取出烧瓶，向其中投入小冰块降温，用3号垂熔漏斗抽滤

↓

用300ml、4℃、0.1mol/L的NaHCO3溶液洗涤。

然后用300ml、PH=10.2、0.025mol/L的硼酸缓冲液分3-4次抽滤洗涤

↓

最后转移至250ml的烧瓶中，加入50-60ml的硼酸缓冲液，即得活化的Sepharose4B，备用

v[B]、抗t-PA的亲和吸附剂（t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和吸附剂）的制备

v取步骤-2中的抗t-PA的免疫球蛋白IgG，70-80mg溶于20ml硼酸缓冲液中、过滤。

滤液加入到已经活化的Sepharose4B中，10℃下搅拌反应16-18小时

↓

第二天装柱，用10倍柱床体积（V/V）、PH=10.2的硼酸缓冲液，以5-6ml/min的流速洗涤柱床。

收集流出液，测定其A280

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=10.0、0.1mol/L乙醇胺溶液洗涤柱床

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=8.0、0.1mol/L硼酸缓冲液洗涤柱床

↓

用5倍柱床体积（V/V）的、PH=7.4、0.1mol/L磷酸缓冲液洗涤平衡。

↓

直到流出液的A280小于0.01，所得到的固定化抗t-PA的免疫球蛋白IgG，就是待提取的t-PA的亲和吸附剂。

↓

将其转移至含0.01%NaN3的、PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液中，于4℃下贮存，备用。

（3）细胞培养

v取5L玻璃转瓶，按每平方米表面积2.5L的比例加入细胞培养液。

↓

将人黑色素瘤细胞按常规方法消化分散、洗涤、计数、稀释成细胞悬液。

↓

将细胞悬浮液接种到转瓶之中，接种浓度为103～3×103个/ml

↓

置于CO2培养箱中，37℃下培养、通入含5%CO2的无菌空气

↓

等到长成致密单层之后，弃去培养液，

用PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液洗涤细胞单层2～3次。

↓

换入无血清Eagle培养液继续培养

↓

每隔3～4天收获一次培养液，用于制备t-PA。

同时向转瓶中加入新鲜培养液继续培养

↓

如此反复，可获得大量t-PA。

（4）t-PA的分离

v步骤-4中所收集到的培养液中，加入蛋白酶抑制剂aprotinin至5万单位/ml。

加吐温-80至于0.01%、过滤、除去沉淀.滤液稀释3倍

↓

稀释液上柱，以5ml/min的流速进入t-PA-IgG-Sepharoes-4B亲和柱（直径4cm*长度40cm）。

↓

用含0.01%的吐温-80+2.5万单位/ml的蛋白酶抑制剂aprotinin+0.25mol/L的KSCN的PH=7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲液以同样的流速洗涤亲和柱，以除去杂蛋白

↓

最后用3mol/L的KSCN溶液洗脱亲和柱，

以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

↓

装入透析袋内，埋入到PEG20000中浓缩至原体积的1/10-1/5。

↓

各t-PA粗提物

（5）t-PA的精制

vt-PA粗提物

↓

进Sephadex-G-150柱（直径2cm*长度100cm）

↓

用含0.01%的吐温-80的1mol/L的NH4HCO3溶液以2-3ml/min的流速进行洗脱

↓

以每管10-15ml的体积进行分区收集

合并t-PA的洗脱峰，

↓

于冻干机中进行冻干

↓

得t-PA精品

2、动物细胞的大规模培养方法（细胞培养方式）

按照实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。

1）、悬浮培养

v优点：

操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。

v缺点：

体积小，较难采用灌流培养。

常用反应器为搅拌和气升式。

2）、贴壁培养

v优点：

适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。

v缺点：

操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。

3）、贴壁-悬浮培养（固定化培养）

v

（1）微载体培养，优点：

可创造相当大的贴附面积，载体体积较小，比重较轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，发挥悬浮培养的特长。

理想的微载体应具备：

生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.030～1.045g/ml）、粒径均一，在60～250m之间（溶胀后）、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分。

v

（2）包埋和微囊培养，包埋或包裹在凝胶载体和微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；可以获得较高的细胞密度；通过控制微囊膜的孔径可使产品浓缩在微囊内有利于下游处理；可采用多种生物反应器进行大规模培养。

v（3）结团培养，利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养。

优点是操作简单、节省微载体用量。

3、动物细胞培养的操作方式

v分批式、流加式、半连续、连续式、灌注式、细胞工厂培养，见发酵工程相关内容。

4、动物细胞生物反应器必须具备哪些要求？

有哪些类型？

特点是什么？

v必须具备的基本要求：

①材料是无毒性的；②结构性能良好；③密封性能良好；④理化参数能自动检测；⑤能长期运作；⑥容器无死角；⑦维修方便；⑧设备成本低。

v反应器类型及特点：

 1）搅拌罐式生物反应器：

主要用于是悬浮细胞培养，微载体培养，微囊和巨载体培养以及结团培养 

2